BAHAN AJAR ANALISIS MIKROBIOLOGI
“PEWARNAAN MIKROBA”
KOMPETENSI DASAR
3.1 Menerapkan pewarnaan mikroba
Indikator
3.1.1 Menjelaskan bakteri gram positif dan
negatif
3.1.2 Menerapkan teknik pewarnaan mikroba
3.2.1 Melaksanakan pewarnaan mikroba
3.2 Melaksanakan pewarnaan mikroba
Tujuan Pembelajaran
1. Peserta didik mampu menjelaskan
pengertian bakteri gram positif dan
negatif melalui bacaan dengan benar
2. Peserta didik mampu memberi contoh
bakteri yang tergolong gram positif atau
negatif melalui bacaan dengan benar
3. Peserta didik mampu menjelaskan
struktur sel bakteri gram positif dan
negatif melalui bacaan dengan benar
4. Peserta didik mampu menentukan
perbedaan bakteri gram positif dan
negatif melalui bacaan dengan benar
1. Peserta didik mampu menjelaskan tentang
zat warna pada pewarnaan mikroba
melalui media dengan tepat
2. Peserta didik mampu menjelaskan prinsip
teknik pewarnaan mikroba melalui media
dengan tepat
3. Peserta didik mampu menjelaskan
prosedur teknik pewarnaan mikroba
melalui media dengan tepat
4. Peserta didik mampu melaksanakan
pewarnaan miroba untuk bakteri gram
positif dan negative melalui praktikum
dengan tepat
 Pewarnaan Mikroba

A. Bakteri Gram Positif dan Negatif

Bakteri tergolong pada sel prokariot yaitu (prokaryotes, bahasa Yunani: pro
‘sebelum’) yang tidak mempunyai organel inti (nukleus atau inti sel). Sel prokariot
memiiliki tiga strukur dinding sel yang berbeda yang dikenal dengan :
1. Mycoplasma
Mempunyai dinding sel yang kurang kaku dari yang prokariot lainnya karena
mycoplasma hanya mempunyai lipopolisakarida bilayer untuk membrane selnya.
2. Bakteri gram positif
Bakteri ini mempunyai dinding sel yang mengandung peptidoglikan untuk
melindungi membrane sitolpasma. Contoh balteri ini adalah Stapyloccocus aureus
dan Bacillus subtilis.
3. Bakteri gram negatif
Bakteri ini memiliki membran luar yang melingkupi peptidoglikan. Artinya dinding
sel bakteri ini terdiri atas membrane luar, peptidoglikan dan baru membrane
sitoplasma. Lapisan membrane luar ini disebut dengan lipid bilayer kedua.
Membrane luar tersusun atas lipopolisakarida dan protein. Peptidoglikan
mengandung 10% dari total dinding sel. Contoh bakteri ini adalah E.coli dan
Pseudomonas. Struktur dinding sel bakteri ini dapat dilihat pada gamabr berikut :

(http://www.google.com)
Peptidoglikan adalah polisakarida yang terdiri dari dua gula turunan yaitu asam-N-
asetil glukosamin serta asam N-asetilmuramat yang dihubungkan ikatan β-1,4, dan
sebuah rantai peptida pendek yang contohnya terdiri dari asam amino l-alanin, d-
alanin, d-asam glutamat, dan baik l-lisin atau asam diaminopimelik (DAP). Berikut
struktur kimia dari peptidoglikan :

(https://www.google.com/)

(https://www.google.com/)
 Lipopolisakarida adalah sebuah molekul besar berupa kompleks antara senyawa
lipid dan polisakarida dengan ikatan kovalen. Adapun struktur kimia dari
lipopolisakarida adalah :

(https://www.google.com/)

B. Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Negatif

Secara umum perbedaan bakteri gram positif dapat dibedakan dari struktur dinding
selnya di pnejelasan sebelumnya. Selain itu, perbedaannya dapat ditabelkan dalam
bentuk berikut
No. Ciri Gram Positif Gram Negatif
1. Struktur dinding  Tebal (15-80nm)  Tipis (10-15nm)
sel  Berlapis tunggal (mono)  Berlapis tiga (multi)
2. Komposisi dinding  Kandungan lipid rendah  Kandungan lipid tinggi
sel (1-4%) (11-22%)
 Peptidoglikan ada  Peptidoglikan ada di
sebagai lapisan tunggal, dalam lapisan kau
komponen utama sebelah dalam,
merupakan lebih dari jumlahnya sedikit,
50% berat kering pada merupakan sekitar 10%
beberapa sel bakteri berat kering
 Ada asam tekoat  Tidak ada asam tekoat
3. Kerentanan  Lebih rentan  Kurang rentan
terhadap penisilin
4. Pertumbuhan  Pertumbuhan dihambat  Pertumbuhan tidak
dihambat oleh zat- dengan nyata begitu dihambat
zat warna dasar
5. Persyaratan nutrisi  Relatif rumit pada  Relatif sederhana
banyak spesies
6. Resistensi terhadap  Lebih resisten  Kurang resisten
gangguan fisik
 Bakteri gram positif dan negatif dapat dibedakan menggunakan teknik pewarnaan. Pada
pemberian pewarnaan, dinding sel bakteri gram negative menghalangi pewarnaan
sedangkan bakteri gram positif tidak.

C. Teknik pewarnaan pada bakteri gram positif dan negatif

Pewarnaan pada bakteri bertujuan untuk membedakan jenis bakteri. Teknik
pewarnaan mikroba disebut juga dengan gram stain. Prosedur gram stain pertama kali
dikembangkan oleh Crisitan Gram pada tahun 1844. Pada pemberian pewarnaan, dinding
sel bakteri gram negatif menghalangi pewarnaan sedangkan bakteri gram positif tidak.
Zat pewarna adalah zat yang digunakan untuk mewarnai sel bakteri agar dapat lebih
mudah diamati di bawah mikroskop. Macam-macam zat warna : Kristal violet, karbol
fuchsin, metilena biru, malasit hijau, safranin, nigrosin (tinta cina), metil lembayung, dll.
Zat warna yang memiliki daya afinitas (daya gabung) paling kuat yaitu : Kristal violet,
metilena biru, dan karbol fuchsin.
Pewarnaan bakteri pada tingkat dasar dapat menggunakan:
1. Zat warna kristal violet. Pada prosedur pewarnaan diperlukan larutan natrium
yang bertindak sebagai mordan yang berfungsi untuk meningkatkan interaksi
anatara sel bakteri dengan pewarna agar terikat kuat. Uji positif ditunjukkan
sebagi berikut :
Bakteri Uji Positif
Gram positif Mempertahankan warna violet-iodin
Gram negatif Kehilangan warna vioet-iodin

2. Safranin
Pada teknik ini, warna safranin akan memberikan noda/warna pada bakteri gram
negatif yang tidak berwarna dan tidak mengubah warna ungu gelap dari bakteri
gram positif
Bakteri Uji Positif
Gram positif Berwarna ungu pekat
Gram negatif Pink menjadi merah
 3. Pengujian pewarnaan menggunakan KOH
Teknik ini menggunakan slide kaca yang berisi bakteri dan ditetesi dengan
KOH 10%. Bakteri gram negatif akan menghasilkan goresan dan gram positif
tetap cair

D. Praktikum Pewarnaan Mikroba

Untuk prosedur pewarnaan mikroba, teknik yang akan digunakan adalah tekni
pertama menggunakn kristal violet.
1. Sampel :
1) E.coli
2) S. aureus
3) Campuran E. coli dan S. aureus
2. Prosedur kerja
1) Menyiapka goresan sampel
2) Slide tempatkan pada arak pewarnaan
3) Cuci noda dengan kristal violet dan diamkan 30 detik

4) Bilas dengan air selama 5 detik

5) Tutup dengan larutan yodium sealam 1 menit

6) Bilas dengan air selama 5 detik

7) Tambahkan etanol 95% selama 15 hingga 30 detik

8) Tambahakn setetes demi setetes

9) Tambahkan safranin dan tunggu 60-80 detik

10) Bilas dengan air selama 5 detik

 Keringkan dan periksa dibawah rendaman minyak

Pertanyaan :

1. Jelaskan perbedaan dari cara sederhana dan bertingkat!

2. Tuliskan nama reagen dan fungsinya yang digunakan dalam pewarnaan gram
a. Mordant
b. Primary stain
c. Decolorizer
d. counterstain
3. Sebutkan langkah kerja yang berisiko menimbulkan hasil yang buruk terhadap hasil
pewarnaan! jelaskan!
4. Apa yang dimaksud dengan tabel gram
5. Sebutkan bagian bakteri yang paling terlibat dalam pewarnaan bakteri! Jelaskan!