1. Seperti biasa, pada no 1 selalu ditanyakan apa tujuan dari praktikum kali ini ?

1. Mahasiswa mampu melakukan penyiapan olesan bakteri dengan baik sebagai prasyarat
macam pewarnaan
2. Mahasiswa mampu melakukan pewarnaan gram
3. Mahasiswa mampu melakukan pengamatan bakteri dengan menggunakan mikroskop

1. Olesan yang baik itu yang seperti apa ?

Olesan yang baik adalah olesan yang tidak terlalu tebal dan tidak terlalu tipis. Jika terlalu tebal,
maka akan terjadi penumpukan mikroba, sehingga akan sulit diamati. Jika terlalu tipis juga akan
sulit diamati karena bentuknya tidak jelas.

2. Sebutkan macam-macam pewarnaan !

Pewarnaan Negatif
Metode pewarnaan negatif bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya
menjadi hitam gelap.
Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum digunakan. Berbagai macam
tipe morfologi bakteri dapat dibedakan dengan menggunakan pewarnaan sederhana. Pada
pewarnaan ini, hanya digunakan satu macam zat warna untuk mewarnai sel-sel bakteri.
Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-asam, dan
penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan warna merah.
Pewarnaan Struktural atau khusus
Pewarnaan yang digunakan untuk mewarnai struktur khusus dari bakteri seperti kapsul, spora,
flagel dan nukleolus.
Pewarnaan Diferensial/Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri
menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan
fisik dinding selnya. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

3. Mengapa bakteri gram positif bisa tewarnai biru ungu sedangkan bakteri gram
negatif terwarnai merah muda ?
 BACA ARTIKEL INI
4. Contoh Bakteri gram positif dan gram negatif ?

(Sumber wikipedia.org)

1. Mengapa perlu dilakukan pengocokan tabung reaksi berisi biakan sebelum diambil ?

Hal ini bertujuan agar tidak ada endapan bakteri di bagian bawah tabung.

2. Mengapa pada media padat perlu ditambahkan air steril sedangkan pada media cair
tidak?

Pada media padat, perlu ditambahkan air steril karena sel-sel pada medium padat cenderung
melekat dengan sesamanya, sehingga jika tidak diberi air steril, bakteri akan saling tumpang
tindih dan hal ini yang menyulitkan pengamatan. Sedangkan pada media cair tidak perlu
ditambahkan air steril karena sel-sel bakteri dalam medium cair dapat bergerak bebas dan tidak
melekat dengan sesamanya, sehingga tidak diperlukan lagi air steril seperti media padat.

3. Apa yang Anda ketahui tentang fiksasi ?

 Fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan atau penempelan struktur sel mikroorganisme
pada suatu posisi. Selain itu fiksasi juga berfungsi untuk menonaktifkan enzim lytic sehingga
bakteri tidak mengalami lisis dan berubah bentuk pada saat diamati. Fiksasi dilakukan setelah
olesan pada kaca preparat sudah kering. Jika olesan belum kering akan menyebabkan sel-sel
mikroorganisme yang bersangkutan menjadi tidak beraturan bentuknya. Tujuan dari fiksasi
adalah pelekatan bakteri supaya pada saat pencucian, bakteri tersebut tidak ikut hilang tercuci.
Fiksasi yang digunakan pada percobaan kali ini adalah fiksasi panas, yaitu dengan cara
melewatkan kaca preparat di atas api. Fiksasi dilakukan sampai kaca preparat terasa hangat
apabila ditempelkan pada punggung tangan. Fiksasi yang dilakukan tidak boleh terlalu panas dan
lama, karena bakteri yang ada pada preparat bisa hangus terpanggang dan terjadi perubahan
bentuk dan penyusutan sel.

4. Apa fungsi pewarna ungu kristal dan apa konsekuensi jika proses pewarnaan terlalu
lama atau cepat ?

Zat pewarna ini berfungsi untuk memberikan warna ungu pada semua bakteri. Proses yang
dilakukan selama 1 menit, karena jika terlalu lama maka warna ungu ini akan menembus dinding
sel, sehingga akan sulit membedakan gram positif dan negatif. Tetapi jika kurang dari 1 menit,
zat warna ungu akan kurang melekat sehingga akan menyulitkan pengamatan.

5. Apa fungsi iodin gram?

Iodine gram sering disebut dengan zat mordan. Zat mordan sendiri adalah zat yang dapat
membuat zat warna terikat lebih kuat pada jaringan sel dengan membentuk kompleks iodine-
violet. Selain itu, penambahan iodine gram bertujuan agar sel-sel bakteri akan dapat diwarnai
lebih intensif dan akan menyebabkan pewarna terikat lebih kuat pada jaringan sel.

6. Apa fungsi ethanol dan apakah bisa diganti dengan zat lain , sebut beserta alasannya
?

Penambahan etanol 95% ini berfungsi untuk memucatkan warna ungu kristal pada kaca preparat
yang sudah menempel pada olesan bakteri tersebut. Selain digunakan etanol sebagai pemucat,
dapat juga digunakan zat lain yang dapat melarutkan kompleks ungu-iodium, contohnya aceton.
Namun, aceton merupakan pemucat yang bekerja paling cepat sehingga dikhawatirkan akan
terjadi pemucatan yang berlebihan. Pemucatan ini akan mengakibatkan bakteri gram negatif
kehilangan warnanya dan kembali menjadi tak berwarna, namun bakteri gram positif tetap
berwarna ungu/ biru.
7. Apa fungsi safranin dan mekanismenya sehingga bisa dibedakan antara gram positif
dan gram negatif ?

Safranin merupakan pewarna tandingan yang akan memberikan warna merah muda pada bakteri. Setelah
digenangi dengan pewarna tandingan, olesan dibilas dengan aquades. Bakteri gram negatif yang tidak
berwarna kemudian akan menyerap warna ini sehingga berwarna merah muda sedangkan bakteri gram positif
yang telah berwarna ungu/biru tidak akan menyerap warna ini (warna merah muda dari safranin). Hal ini
disebabkan karena adanya perbedaan struktur dinding sel bakteri gram positif dan bakteri negatif, dimana
bakteri gram positif mempunyai dinding sel yang lebih tebal dan mengandung sedikit lipid dibandingkan
dengan dinding bakteri gram negatif yang mengandung banyak lipid. Ketika pemucatan dinding sel yang
tebal pada bakteri gram positif akan mengalami penyusutan oleh perlakuan alkohol karena terjadinya
dehidrasi, yang menyebabkan pori-pori dinding sel menutup dan mencegah terlarutnya warna ungu kristal-
iodium pada langkah pemucatan. Sedangkan sel bakteri gram negatif mempuyai kandungan lipid yang lebih
tinggi dari pada dinding selnya. Dan lipid pada umumnya mudah larut pada pelarut yang polar seperti alkohol
ataupun aseton. Dengan larutnya lipid pada dinding sel bakteri gram negatif akan memperbesar pori-pori
dinding sel sehingga warna ungu kristal-iodium akan lebih mudah hilang pada saat langkah pemucatan.

8. Berapakah perbesaran yang dipakai untuk pengamatan bakteri dan apa alasannya ?

Pengamatan dilakukan dengan mikroskop dengan perbesaran 1000x. Hal ini dikarenakan ukuran
bakteri yang sangat kecil, jika menggunakan perbesaran biasa, akan menyulitkan pengamat
dalam pengamatan bakteri.

9. Mengapa pada saat pengamatan perlu diberikan minyak imersi antara preparat dan
lensa objektif ?

Hal ini dikarenakan, cahaya yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara
dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu membiaskan cahaya dari
medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal. Bahan yang
mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang
mendekati garis normal adalah minyak imersi. Selain itu, minyak imersi juga mempunyai indeks
bias yang mendekati atau identik dengan kaca.

10. Faktor-faktor apa saja yang dapat membuat bakteri gram positif dapat menjadi gram
negatif begitupun sebaliknya !
 a. Metode dan teknik yang digunakan Pemanasan yang berlebihan selama fiksasi, dekolorisasi
yang berlebihan dengan alkohol, dan bahkan pembilasan dengan air yang terlalu banyak pada
tiap langkah dapat menyebabkan bakteri gram positif kehilangan kompleks kristal violet-iodine.
b. Umur dari biakan Biakan dengan umur lebih dari 24 jam akam kehilangan kemampuan untuk
menahan kompleks kristal violet-iodine.
c. Organisme itu sendiri Beberapa bakteri gram positif lebih dapat menahan kompleks kristal
violet-iodine dibandingkan dengan lainnya.
d. Perubahan keasaman. Bila pH turun kemungkinan bakteri gram positif dapat berubah menjadi
gram negatif. Sebaliknya bila pH naik ada kemungkinan bakteri-bakteri gram dapat berubah
menjadi gram positif.
e. Faktor medium Misalnya bakteri-bakteri gram positif yang lemah bila terlalu lama ditumbuhkan
dalam medium yang mengandung bahan yang mudah difermentasi dapat berubah menjadi gram
negatif.
f. Kerapatan sel pada olesan Semakin rapat suatu sel bakteri akan semakin sukar hilangnya
warna ungu kristal pada saat langkah pemucatan, oleh karena itu pada saat diberi warna
tandingan sel bakteri tetap berwarna ungu, padahal bakteri tersebut merupakan bakteri gram
negatif.

1. Langkah kerja

II.3.1. Pengamatan Morfologi Khamir

1. Dibersihkan kaca obyek dengan baik sehingga bebas dari lemak dan kotoran. Pembersihan kaca obyek dilakukan
dengan tahapan sebagai berikut:
a. Dilakukan pembersihan di tempat cuci.
b. Dengan kaca obyek di tangan kiri, dibasahi telunjuk dan jari tengah kanan.
c. Digosokkan kedua jari yang basah pada sabun pembersih.
d. Digosok kedua permukaan kaca obyek dengan kedua jari yang bersabun kemudian dibilas dengan air hingga tidak
ada lagi sabun yang tersisa.
e. Dibersihkan apabila kaca obyek yang bekas diwarnai, langkah c dan d diulangi.
f. Diteteskan alkohol 95% pada kedua permukaan kaca obyek.
g. Ditiriskan kaca obyek untuk membuang kelebihan alkohol, kemudian diseka kaca obyek dengan lap dari kertas yang
disediakan. Kaca obyek tidak boleh diseka dengan menggunakan bahan yang meninggalkan serat pada kaca obyek.
h. Setelah dibersihkan, dipegang kaca obyek pada bagian pinggirnya supaya lemak yang terdapat pada jari tidak
mengotori kaca obyek.
2. Ditulisi sisi kaca obyek dengan nama kelompok dan nama organisme yang akan dioleskan.
3. Digunakan teknik aseptik dalam pembuatan olesan. Pembuatan olesan dengan teknik aseptik dapat dilakukan dengan
tahapan sebagai berikut:
a. Apabila yang dipindahkan adalah biakan dalam media cair, maka diletakkan satu hingga dua lup penuh biakan pada
kaca obyek yang bersih setelah mengocok media dengan baik tanpa membasahi sumbat tabung.
 b. Apabila yang dipindahkan adalah biakan dalam media padat, maka diletakkan satu hingga dua lup penuh aquades
pada kaca obyek, kemudian dipindahkan biakan dengan menggunakan lup inokulasi.
4. Olesan dibiarkan kering di udara, kemudian olesan dilalukan beberapa kali di atas api hingga kaca obyek terasa agak
panas saat ditempelkan pada punggung tangan.
II.3.2. Pewarnaan Gram
1. Disiapkan olesan bakteri pada kaca obyek.
2. Setelah selesai difiksasi panas, diletakkan kaca-kaca obyek di atas rak pada bak pewarna. Dilakukan pewarnaan gram
dengan tahapan sebagai berikut:
a. Digenangi olesan bakteri dengan menggunakan pewarna primer, ungu kristal selama satu menit.
b. Dengan menggunakan pinset atau penjepit lain, dimiringkan kaca obyek di atas bak pewarna untuk membuang
kelebihan ungu kristal, kemudian dibilas olesan dengan aquades.
c. Ditiriskan kaca obyek dengan cara menegakkan sisi-sisi yang pendek dari kaca obyek tersebut di atas kertas serap,
kemudian dikembalikan kaca obyek ke atas rak pada bak pewarna.
d. Digenangi olesan dengan iodium gram selama dua menit.
e. Dimiringkan kaca obyek untuk membuang kelebihan iodium, kemudian dibilas olesan dengan menggunakan aquades.
f. Dicuci olesan dengan menggunakan pemucat warna, alkohol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau hingga
warna ungu kristal tidak lagi terlihat mengalir dari kaca obyek.
g. Dicuci olesan dengan menggunakan aquades, kemudian ditiriskan dan dikembalikan ke rak pada bak peawarna.
h. Digenangi olesan dengan menggunakan pewarna tandingan, safranin selama 30 detik.
i. Dimiringkan kaca obyek untuk membuang kelebihan safranin, kemudian dibilas olesan dengan menggunakan
aquades.
j. Ditiriskan kaca obyek dan diserap kelebihan air pada olesan dengan menekankan kertas serap secara hati-hati ke
atasnya.
3. Diamati masing-masing preparat di bawah mikroskop.

Untuk memudahkan pembelajaran, silahkan mendownload tes jurnal ini di sini