Skrining dan Pemuliaan Galur

Pendahuluan
Meskipun teknologi DNA rekombinan telah
meningkatkan produksi berbagai produk
fermentasi, pencarian mikroorganisme baru
dari alam yang memiliki potensi untuk
menghasilkan produk tertentu masih tetap di
eksploitasi.
Prescott et al. (2002) Industrial
Microbiology and Biotechnology.
Prescott et al. (2002) Industrial
Microbiology and Biotechnology.
Koleksi kultur murni
Tujuan Skrining mikroorganisme
Skrining mikroorganisme dilakukan untuk:
Mendeteksi produk baru (metabolit, vitamin,
enzim) serta potensi kegunaan ekonomis lainnya
seperti:
Kontrol biologis
Biodegradasi
Bioremediasi
 Proses Kimiawi (biotransformasi,
bioakumulasi)
Pangan dan pemrosesan pangan
Pengembangan uji
Metode isolasi mikroorganisme
 Metode kualitatif (Pengamatan,
Mikroskopi)
 Metode kuantitatif (Kecepatan
pertumbuhan, kapasitas sporulasi)
 Metode Biokimiawi (kromatografi, uji
enzimatis, analisis protein)
 Metode molekular (PCR, Sekuensing)
Metode Kualitatif
1. Morfologi dan anatomi kultur
 Studi anatomi (bentuk dan ukuran spora,
kloroplas, organisasi intraselular)
 Morfologi kultur (pigmentasi, radius koloni,
pembentukan hifa dan agregasi,
penampakan total)
 Sporulasi (kelimpahan, jenis)
 Pergerakan (nematoda dan organisme yang
berflagela)
Morfologi kultur tiga spesies Monilina

(A) Monilinia laxa; (B) M. fructicola; (C) M. fructigena

Morfologi kultur tiga spesies Monilina

Catatan: Penentuan berdasarkan morfologi kultur  mudah dan murah, tapi

memerlukan isolat murni dan memerlukan waktu yang lama.
Metode Kualitatif (Lanj.)
2. Mikroskopi
 Analisis morfologi, anatomi, dan organisasi
intraselular
 Deteksi senyawa biokimia dan struktur makro
dengan teknik staining (pewarnaan)
 Identifikasi menggunakan oligonukleotida
dari organisme dengan pewarna spesifik
 Penentuan viabilitas
Morfologi Bakteri
Penentuan viabilitas ragi dengan
pewarnaan metilen violet

• Sel berwarna ungu:

sel yang mati (non-
viable)
• Sel yang tidak
berwarna: sel yang
hidup (viable)
• Sel mati tidak
dapat
memetabolisme
metilen violet
sehingga menjadi
berwarna
Metode-metode mikroskopi

Mikroskop SEM TEM

cahaya

Fluorescence Microscopy
Metode Kuantitatif
1. Laju Pertumbuhan (bakteri, jamur, alga)
2. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
3. Laju fotosintesis (alga dan bakteri
fotosintetik)
4. Laju respirasi
5. Produksi enzim / penggunaan substrat
 Laju Pertumbuhan
Laju pertumbuhan mikroorganisme (bakteri,
ragi, jamur, alga) dapat ditentukan dengan
cara:
 Penghitungan jumlah sel (mis.: hemasitometer)
 Kerapatan Optis pada 600 nm
 CFU
 Berat kering sel
Penghitungan jumlah sel dengan
hemasitometer

Untuk sel yang dihitung di kotak A, B, C, D:

Kerapatan sel / mL = jumlah sel yang
dihitung × 104 × fp
Untuk sel yang dihitung di kotak kecil di
kotak E:
Kerapatan sel / mL = jumlah sel yang
dihitung × 2,5 × 105× fp
CFU
Kurva Pertumbuhan Mikroorganisme

Rao, D.G. (2005). Introduction to

Biochemical Engineering. McGraw Hill.
Kromatografi lapis tipis
Untuk menentukan jumlah metabolit (bakteri,
jamur, ragi) atau senyawa lain (misal: klorofil
pada alga)
Produksi enzim / Penggunaan Substrat

Riffel, A. & A. Brandelli. (2006). Braz. J. Microbiol. 37 (3): 

Produksi enzim / Penggunaan Substrat

Plate 1 & 2 memiliki aktivitas ligninilitik  menunjukkan bahwa mikroorganisme

pada plate 1 & 2 memiliki kemampuan untuk memetabolisme lignin.
Prosedur pendekatan penemuan
metabolit baru
• Skrining
Skrining dilakukan untuk produksi metabolit baru dengan
isolat dan/atau metode uji baru.
• Modifikasi kimia
Modifikasi kimia dilakukan terhadap senyawa mikrobial
yang sudah diketahui untuk mengubah atau meningkatkan
aktivitasnya
• Biotransformasi
Pada proses biotransformasi, terjadi perubahan molekul
senyawa kimia dengan reaksi yang dikatalisis oleh sel
mikroorganisme, atau lebih tepat lagi dikatalisis oleh enzim
Prosedur pendekatan penemuan
metabolit baru (Cont.)
• Fusi protoplas interspesifik
Pada metode ini, dilakukan penggabungan
informasi genetika dari strain yang memiliki
kekerabatan dekat
• Kloning gen
Pada metode ini gen asing di transfer kepada
mikroorganisme lain yang produknya sudah
diketahui.
Ilmu yang terlibat dalam skrining

 Mikrobiologi: isolasi dan identifikasi

mikroorganisme, pengawetan galur, uji
aktivitas hayati dan fermentasi
 Biokimia: prosedur analitik, pendekatan
untuk pemurnian produk
 Kimia: sintesis substrat dan inhibotor
 Studi pustaka: pencarian literatur dan
database terkomputerisasi
 Perekayasa: pengembangan peralatan teknis
Tujuan skrining

 Skrining bukan suatu pekerjaan rutin, karena

metode yang digunakan harus mengadaptasi
teknik dan informasi terbaru, tergantung
metabolit target
 Tujuan skrining: mendeteksi dan
mengidentifikasi senyawa baru yang menarik
secara komersial dan memisahkan senyawa
tersebut dari senyawa lain yang tidak
diinginkan.
Metabolit primer

 Metabolit primer: metabolit penting untuk

hidup dan reproduksi sel
 Fungsi metabolisme primer mirip pada
semua mikroorganisme
 Contoh: Protein, karbohidrat
Metabolit sekunder

 Setiap metabolit sekunder dibentuk hanya

oleh beberapa organisme
 Metabolit sekunder tidak esensial untuk
pertumbuhan dan reproduksi
 Pembentukan metabolit sekunder
tergantung kepada kondisi lingkungan
Metabolit sekunder (Cont.)

 Beberapa metabolit sekunder dihasilkan sebagai

suatu golongan dengan berhubungan secara
struktural. Contoh: Streptomyces menghasilkan 32
antrasiklin yang berbeda
 Beberapa organisme menghasilkan bermacam
kelompok senyawa sebagai metabolit sekunder
 Regulasi biosintesis metabolit sekunder berbeda
secara signifikan dengan metabolit primer
Metabolisme Primer Vs Sekunder

• Disamping lima fase metabolisme primer suatu sel, metabolisme

sekunder merupakan suatu ranah yang dapat dimodifikasi untuk evolusi
perkembangan biokimia tanpa mengganggu metabolisme primer
• Perubahan genetika yang mengarah ke modifikasi metabolit sekunder
tidak memberi efek terhadap fungsi normal sel.
• Jika suatu perubahan genetik mengarah kepada terbentuknya senyawa
yang menguntungkan bagi sel, maka perubahan genetik ini dapat
menjadi permanen dalam genom sel, dan menjadi esensial
Skrining metabolit baru

 Tidak ada metode skrining universal

 Keberhasilan suatu skrining tergantung pada pemilihan
jenis uji yang sesuai dan juga kesesuaian
mikroorganisme yang diuji
 Fokus skrining terhadap senyawa dengan aktivitas
terhadap galur mikroorganisme yang resisten-
antibiotik, tumor, virus, inhibitor enzim, dan senyawa
yang aktif secara farmakologi (mis: hormon). Selain itu,
skrining juga dilakukan untuk kultur yang lebih baik
pada industri pangan dan juga mikroorganisme yang
memiliki kemampuan penguraian bahan berbahaya
Strain yang digunakan untuk skrining

 Keberhasilan skrining tergantung pada jenis

mikroorganisme dan metode deteksi aktivitas.
Pemilihan strain berkontribusi 30-40% terhadap
keberhasilan skrining, sedangkan metode pengujian
berkontribusi 60-70%.
 Untuk pencarian metabolit baru, biasanya dilakukan
isolasi strain dari lingkungan yang ekstrim atau tidak
biasa, dengan harapan strain teresebut memiliki
kemampuan menghasilkan metabolit baru
 Misal: MO dari dataran tinggi, kondisi yang sangat
dingin, air laut, laut dalam, gurun, penghasil minyak.
Pengayaan mikroorganisme dengan
seleksi pada kondisi kultur yang sesuai

Metode Pengayaan Jenis isolat

Nilai pH yang ekstrim (pH 2-4) Asidofilik
Suhu yang rendah (4-15°C) Psikotrof
Suhu tinggi (42-100°C) Termofilik
Konsentrasi NaCl yang tinggi Halofilik
Atmosfir N2 Anaerobik
Kitin sebagai substrat pertumbuhan Lysobacter
Kulit batang pohon, akar Myxobacteria
Butiran pollen Actinoplanes
Skema metode isolasi secara
umum
1. Sampel tanah atau air yang mengandung MO
disuspensikan dalam air steril yang mengandung
Tween sebagai agen pengemulsi. Sampel
kemudian dikocok
2. Supernatan diencerkan sebesar 10-1 – 10-10
3. Sampel hasil pengenceran ditumbuhkan pada
cawan dngan media kultur yang berbeda dan
diinkubasi.
4. Koloni tunggal dipilih dan dimurnikan dengan
digoreskan pada media baru
5. Strain murni ditumbuhkan pada kultur agar
dalam tabung reaksi
Pengujian skrining metabolit

 Prosedur skrining dapat dipercepat dengan

menguji aktivitas hayati isolat awal secara
langsung.
 Tanah atau air diencerkan langsung pada
cawan uji, dan koloni yang menunjukkan
aktivitas yang diisolasi lebih lanjut
Pengujian skrining metabolit (Cont.)
Produk yang Sistem Pengujian
diharapkan
Antibiotika Cawan agar dengan mikroorganisme yang ingin diuji (dihambat
pertumbuhannya). Zona penghambatan digunakan sebagai indikator
aktivitas
Antibiotika resisten β- Cawan agar dengan mikroorgainsme uji dimana β-laktamase sudah
laktamase ditambahkan
Protease Cawan agar dengan kasein, pemilihan koloni berdasarkan
pembentukan zona bening pada cawan yang keruh
Amilase Cawan agar dengan pati, pemilihan koloni setelah pewarnaan dengan
iodin
Lipase Cawan agar dengan emulsi minyak, pemilihan koloni setelah
pengendapan asam lemak bebas dengan Ca2+
Fosfatase Cawan agar dengan fenolftalein-difosfat dan indikator pH, pemilihan
berdasarkan peribahan warna
NAD Agar dengan mikroorganisme auksotrop NAD
Pemuliaan galur

Pemuliaan galur dapat dibagi sebagai berikut:

 Pengaturan aktivitas enzim yang disekresikan oleh organisme
 Untuk metabolit yang dihasilkan secara ekstraselular,
dilakukan peningkatan permeabilitas organisme, sehingga
produk mikrobial dapat menuju keluar sel dengan lebih mudah
 Pemilihan galur pengasil senyawa yang diinginkan dari
populasi alami
 Manipulasi kelengkapan genetika yang sudah ada dalam
organisme
 Memasukkan sifat genetik baru kepada mikroorganisme
dengan teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika
Pemuliaan galur (Cont.)

 Isolat alami biasanya menghasilkan produk yang

diinginkan dalam jumlah yang sedikit dan
seringkali bercampur dengan senyawa lain yang
mirip
 Peningkatan produksi dapat dilakukan dengan
beberapa metode, seperti mutasi terinduksi dan
teknologi DNA rekombinan.
 Perolehan penisilin meningkat dari 20 – 8000
unit/mL pada periode 1943-1955, sekarang sudah
mencapai 85000 unit/mL atau 50 g/L
Mutagenesis melalui Radiasi non-
pengion (ultraviolet)
 Radiasi ultraviolet panjang gelombang pendek
(SWUV) merupakan agen mutagen yang efektif pada
panjang gelombang antara 200-300 nm, dan optimum
pada 254 nm yang merupakan λmax DNA.
 Radiasi ultraviolet panjang gelombang panjang (300-
400 nm) kurang letal dan efek mutagennya
dibanddingan SWUV, namun dapat efektif jika ada
zat warna penginterkalasi, seperti 8-Methoxypsoralen
 Sel yang bertahan hidup setelah perlakuan UV dapat
dua kali lebih produktif dibandingkan galur induknya.
Mutagenesis melalui Radiasi non-
pengion (ultraviolet) (Cont.)
 Dalam mutagenesis melalui iradiasi UV, suatu
galur dipaparkan terhadap mutagen, kemudian
mutan dengan sifat yang diinginkan dipilih
 Produk penting proses iradiasi UV adalah dimer
(T-T, T-C, C-C) terbentuk antara pirimidin yang
dekat atau rantai komplemen, sehingga
membentuk ikatan silang dan menginduksi
transisi GC-AT, transfersi, mutasi begeser
kerangka, delesi.
Radiasi UV (non-pengion)
Mutagenesis melalui radiasi pengion

 Radiasi pengion (berenergi tinggi) yaitu sinar X, γ dan β,

digunakan jika material sel tidak dapat ditembus sinar
UV.
 Pemecahan rantai tunggal dan rangkap terjadi dengan
kemungkinan yang lebih besar dibandingkan radiasi
non-pengion
 Rantai ganda terpecah menyebabkan terjadinya
perubahan struktural utama, seperti: translokasi dan
inversi, sehingga mutan yang dihasilkan bersifat non-
viabel dan tidak bertahan hidup terhadap proses
iradiasi
Radiasi sinar-X
Mutagenesis dengan senyawa kimia

 Mutagenesis dengan senyawa kimia dibagi

menjadi:
 Mutagen yang memengaruhi DNA non-
replikasi
 Analog basa
 Mutagen penggeser kerangka
Mutagen yang memengaruhi DNA non
replikasi
Sejumlah senyawa yang menyebabkan kerusakan langsung
terhadap DNA non-replikasi:
 Asam nitrit (HNO2) menyebabkan deaminasi adenin menjadi
hipoksantin dan sitosin menjadi urasil, menyebabkan terjadinya
transisi AT-GC melalui perubahan sifat berpasangan produk
deaminasi
 Hidroksilamin (NH2OH) bereaksi dengan sitosin dan derivatnya
berpasangan dengan adenin, menyebabkan transisi GC-AT.
 Agen pengalkilasi diantaranya: N-metil-nitrosoguanidin (suatu
karsinogen), etil metansulfonat, dan gas mustrad (Di-2-kloretil-
sulfida) menyebabkan transisi, transversi, dan delesis
Mutagenesis oleh asam nitrit
Analog basa
 Analog basa seperti 5-bromourasil dan 2-aminopurin
masuk kerantai DNA yang bereplikasi menggantikan
basa timin dan adenin karena kemiripan struktur,
menyebabkan terjadinya transisi AT-GC
Mutagen penggeser kerangka

 Mutagen penggeser kerangka berinterkalasi ke

dalam molekul DNA sehingga menyebabkan
kesalahan sehingga terjadi alterasi pembacaan
reading frame, yang berakibat terbentuknya
protein yang salah
 Mutagen penggeser kerangka yang umum
digunakan adalah dye seperti akridin oranye,
proflavin, dan akriflavin, yang dapat masuk
diantara dua basa bertetangga pada rantai DNA.
Mutagen penggeser kerangka
Fusi protoplas
 Protoplas dibentuk oleh bakteri, ragi, jamur dan
aktinomycetes ketika terjadi pembelahan sel sehingga
kehilangan dinding selnya.
 Protoplas juga dapat dipersiapkan dengan
menambahkan enzim pendegradasi dinding sel dalam
larutan isotonik.
 Fusi sel, yang diikuti oleh fusi inti, dapat terjadi antara
protoplas galur yang secara normal tidak dapat
melakukan fusi, dan menghasilkan protoplas gabungan
yang dapat membentuk dinding sel dan tumbuh normal
dengan membawa sifat kedua induknya.
Fusi protoplas
Teknologi DNA rekombinan

 Material genetik dari satu spesies dapat

dimasukkan ke dalam spesies lain, sehingga
spesies tersebut dapat mengekspresikan
produk yang diinginkan
 Akan dibahas lebih lanjut dalam mata kuliah
Teknik Biokimia