MODUL 2

KULTUR SEL DAN JARINGAN HEWAN

Pendahuluan
Kultur sel merupakan teknik pemindahan sel (baik hewan maupun tumbuhan) dari tempat
tumbuh semestisnya di dalam tubuh makhluk hidup ke dalam lingkungan artifisial. Studi dengan
menggunakan teknik kultur sel biasa disebut dengan studi in vitro. Beberapa keuntungan
menggunakan studi in vitro diantaranya peneliti lebih dapat mengontrol lingkungan fisiokimia
(pH, suhu, tekanan osmotik, tekanan O2 and CO2) dibandingkan studi in vivo. Selain itu,
karakterisasi seperti pewarnaan relatif lebih mudah karena tidak perlu membuat sayatan. Teknik
ini juga dapat meminimalisasi jumlah tumbuhan maupun hewan uji yang digunakan sehingga
dapat digunakan untuk uji toksisitas maupun studi farmakologi yang memerlukan banyak
replikasi. Kultur sel dapat disimpan dalam kondisi hidup sampai berahun-tahun. Akan tetapi
sebagai konsekuensi sel ditumbuhkan di luar tempat hidup alaminya, sel menjadi lebih rentan
terutama dari paparan agensia biologis (bakteri, virus, atau jamur), kimiawi, dan fisik. Oleh
sebab itu, harus dipastikan semua pekerjaan dengan kultur sel dilakukan dalam kondisi steril dan
menggunakan teknik aseptik.
Kultur sel hewan pada umumnya berbeda dengan kultur sel tumbuhan karena sifat sel
hewan (kecuali stem cell) yang berbeda dengan sel tumbuhan, yang mana sel tumbuhan memiliki
sifat totipotensi yang tinggi. Oleh sebab itu perlu diperhatikan karakteristik sel yang dikultur
untuk disesuaikan dengan teknik kultur yang dilakukan.

Tabel 1. Beberapa teknik dalam kultur jaringan hewan (Freshney, 2005)

Kategori Kultur Organ Kutur Eksplan Kultur Sel
Sumber Organ embrionik, Potongan Jaringan Jaringan yang
potongan jaringan teragregasi, kultur
dewasa primer, lini sel (cell
line)
Keterampilan Tinggi Sedang Rendah
yang dibutuhkan
Karakterisasi Mudah untuk Sitologi dan marker Assay biokimia,
pengamatan molekuler,
histologi immunologi dan
sitologi
Histologi Informatif Sulit Tidak dapat
digunakan untuk
pengamatan
histologis
Kuantitasi Sulit sulit Mudah
 (e.g.hemasitometer,
image analysis, flow
cytometri)
Pengulangan Variasi antar Variasi atar sampel Homogen
sampel, sampel tinggi tinggi
reproduksibilitas,
dan homogenitas

Selain ketiga teknik di atas, juga terdapat teknik kultur organotypic atau dikenal dengan
co-culture yang pada dasarnya sama dengan kultur sel biasa namun terdapat interaksi beberapa
jenis sel untuk mendukung pertumbuhan sel utama yang ingin dikultur.
Terdapat dua karakter umum sel hewan yang biasa dikultur yaitu: 1) monolayer dimana
sel akan melekat pada substrat (anchorage dependent) dan membentuk satu lapis sel, misalnya
sel epitelial dan sel fibroblas dan 2) suspensi dimana sel bersifat anchorage independent dan
tersuspensi dalam medium misalnya sel hematopoietik. Perbedaan kedua karakter sel tersebut
akan menyebabkan perbedaan teknik penggantian medium dan subkultur yang dilakukan,
dimana sel bersifat melekat pada substrat memerlukan tahapan tripsinasi saat subkultur,
sedangkan sel yang anchorage independent tidak memerlukan tripsinasi.
Pada Tabel 1 dapat dilihat terdapat beberapa metode kultur sel. Sel yang akan dikultur
dapat diperoleh dari kumpulan sel kemudian langsung ditanam ke dalam media, biasanya akan
terjadi kompetisi dan penyusunan strain sel, dimana sel sejenis akan cenderung berkelompok dan
menempati bidang tertentu dalam kultur. Sel juga dapat didisasosiasikan terlebih dahulu
menggunakan pemisahan fisik atau enzimatis (Gambar 1) sehingga hanya sel tertentu yang akan
ditumbuhkan ke dalam medium. Beberapa waktu setelah ditumbuhkan sel monolayer (24 jam, 72
jam, atau tergantung jenis sel dan luas permukaan substrat) akan cenderung memenuhi
permukaan substrat atau dikenal dengan istilah confluence. Teknik kultur yang akan dilakukan
dalam praktikum ini adalah kultur primer dimana sel-sel yang ditumbuhkan diperoleh langsung
dari jaringan hidup yang pada kali ini berasal dari embrio mencit. Dari sel hasil kultur primer
yang confluence, dapat dilakukan subkultur terhadap outgrowth cells (lihat Gambar 2) yang
nantinya dapat membentuk cell lines yang ditanam dalam substrat yang lebih luas.
Gambar 1. Beberapa alternatif untuk memperoleh cell lines melalui kultur primer; bagian tengah dan kiri
melalui disagregasi mekanis; bagian kanan melalui diagregasi enzimatis. Eksplan kemudian ditumbuhkan
dalam growth medium untuk mendapat outgrowth cells yang kemudian disubkultur untuk mendapat cell
lines (Freshney, 2005).

Tujuan
1. Melakukan teknik kultur primer menggunakan jaringan dari embrio mencit (Mus
musculus).
2. Melakukan pengamatan pertumbuhan outgrowth cells (sel fibroblast) dari jaringan
embrio mencit
3. Membandingkan pertumbuhan (persentase konfluensi) outgrowth cells (sel fibroblast)
yang diberi medium dengan suplementasi FBS 10% dan yang tidak disuplementasi FBS
(serum free media)

Medium Pertumbuhan (Growth Medium)

Pada praktikum ini medium pertumbuhan yang digunakan adalah DMEM (Dulbecco Modified
Eagle’s Medium, Sigma). Komponen Medium makronutrien dan mikronutrien yang dibutuhkan
sel. Komposisi DMEM adalah sebagai berikut:
 Tabel 2. Komposisi DMEM
Asam Amino Vitamin Garam Inorganik Komponen lain
L Arginine Choline CaCl2 Pewarna: Fenol
L Cystine Asam folat KCl Red
L Glutamin Myo-Inositol MgSO4
Glycine Nicotinamid NaCl Gas terlarut: CO2
L Histidine Asam Nikotinik NaHCO3 10%
L Isoleusin Pyridoxal HCl NaH2PO4
L Leusin Riboflavin
L Lysine HCL Thalmin
L Metionin Lipid Mineral
L Fenilalanin
Asam Linolenat Fe(NO)2.9H2O
L Serin

L Treonin
Metabolit Energi
L Triptofan
D-Glukosa
L Tyrosin
Sodium Piruvat
L valin

DMEM memiliki pewarna fenol red sehingga bewarna merah pada rentang pH 7. Apabila
medium pH terlalu basa akan terlihat perubahan warna menjadi keunguan. Sedangkan apabila
asam menjadi kekuningan. Sebagian besar sel ditumbuhkan pada pH 7.4

Serum (pendukung pertumbuhan sel)

Fetal Bovine Serum 10% dari volume media Serum biasanya diperoleh dari fetus maupun
embrio hewan seperti bovine (FBS) atau calf (FCS) maupun hewan lain. Kandungan di dalam
serum dapat mendukung proliferasi sel dan daya hidup sel yang dikultur in vitro karena
mengandung:
(1) adhesion factor seperti fibronectin;
(2) hromon dan growth factor seperti insulin, PDGF, danTGF-β, yang meregulasi pertumbuhan
dan differensiasi;
(3) nutrien essensial(mineral, vitamins, asam lemak, dan metabolit intermediet; dan
(4) hormone seperti insulin, hydrocortisone, estrogen, and triiodothyronine, yang mengatur
transpor membran, status fenotipik, dan konstitusi permukaan sel.
 o
Serum menjadi inaktif karena suhu yang terlalu tinggi sehingga harus disimpan di 4 C dan
sterilisasi tidak boleh menggunakan autoklaf melainkan dengan milipore 0,2µm (dengan syringe
filter maupun vacum flask) sehingga bakteri maupun jamur tersaring pada filternya. Tetapi filter
tersebut masih dapat meloloskan partikel virus.

Antibiotik (meminimalisasi pertumbuhan mikroba)

 Penicilin 100U/mL
 Streptomycin 100µg/mL

Tripsin (pemanenan sel pada subkultur)

Tripsin memiliki aktivitas enzimatis sehingga dapat memutuskan ikatan peptida. Larutan trypsin
yang digunakan adalah 0,25% Trypsin dalam PBS steril. Pada kultur sel hewan trypsin umumnya
digunakan untuk melepaskan sel monolayer yang melekat pada substrat apabila melakukan
subkultur. Aktivitas Trypsin dapat diinaktivasi dengan penambahan serum.

Phospate Buffer Saline (PBS 1x free Ca2+ & Mg2+)

No. Bahan Jumlah

1 NaCl 8 gram
2 KCl 0,2 gram
3 Na2HPO4.7H2O 2,16 gram
4 KH2PO4 0, 24 gram
5 Deionized Water Sampai 1 L

PBS selain digunakan sebagai plarut Trypsin juga digunakan sebagai buffer pencuci. PBS yang
digunakan disterilisasi terlebih dahulu menggunakan autoklaf.

Prosedur Kerja

1. Sterilisasi Alat dan Bahan

Sebelum digunakan alat harus disonikasi untuk menghilangkan sisa lemak,
protein, maupun senyawa kimia lain yang melekat pada alat akibat penggunaan alat
sebelumnya. Alat yang telah disonikasi dikeringkan overnight di dalam inkubator
pengering. Setelah dipastikan alat bebas dari agensia kimia, selanjutnya alat dibungkus
dengan alumunium foil kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf (sterilisasi
basah)untuk menghilangkan agensia biologis (mikroba) yang kemungkinan masih
menempel lalu dilakukan pengeringan kembali di dalam inkubator. Selain alat, bahan
yang digunakan juga harus dipastikan steril. Larutan yang tahan suhu dan tekanan tinggi
 dapat disterilisasi dengan autoklaf bersama alat. Untuk larutan yang tidak tahan suhu dan
tekanan harus disterilisasi menggunakan milipore (diameter pori 0,2 µm) misalnya
medium kultur.

2. Kelengkapan Sebelum Kultur Sel Hewan

Kultur sel dilakukan di dalam Laminar Air Flow (LAF) untuk memastikan proses
dilakukan dalam kondisi steril. Lampu UV LAF harus dinyalakan minimal 1 jam sebelum
penggunaan. Praktikkan harus menggunakan jas lab, sarung tangan, dan masker sebelum
bekerja di LAF. Semua alat yang akan digunakan di dalam LAF harus disemprot
permukaannya dengan alkohol 70%. Larutan sebelumnya yang disimpan dalam lemari
pendingin dan akan digunakan suhunya harus diatur menjadi 37 oC. Selama bekerja harus
senantiasa menggunakan teknik aseptis.

3. Isolasi Embrio Mencit

Alat dan Bahan
Steril:
- PBS
- PBS + antibiotic (%)
- Cawan petri
- Alat bedah (gunting, scalpel, blade, pinset)
Nonsteril:
- Laminar air flow
- Mencit bunting (10-13 hari)
- Alkohol 70%
- Bunsen burner

Cara Kerja
Mencit dibunuh dengan cara dislokasi dan kemudian bagian permukaan ventral
dibasahi dengan alkohol (bertujuan untuk menghindari kontaminasi dari rambut mencit
dan tidak mengganggu pembedahan). Bagian ventral kemudian dibedah sehingga uterus
yang berisi embrio terihat. Selanjutnya bagian uterus yang berisi embrio diambil
menggunakan pinset dan diletakkan dalam petri dish berisi 10-20 mL PBS steril,
kemudian dibersihkan dan ditransfer ke dalam cawan petri berisi PBS steril untuk segera
siap dipreparasi dalam ruang kultur. Usia embrio optimal yang dipersiapkan untuk kultur
adalah sekitar 13 hari, ketika embrio sudah cukup besar tapi masih mengandung proporsi
jaringan mesenkim yang besar dan merupakan sumber utama kultur. Namun usia embrio
9-10 hari lebih mudah dilakukan handling untuk isolasi dan kultur. Masing-masing organ
kecuali otak dan jantung mulai terbentuk pada hari ke-9 gestasi, namun sulit untuk
diisolasi hingga mencapai hari ke-11. Pemotongan masing-masing organ lebih mudah
pada usia 14 hari dan kebanyakan organ terbentuk sempurna pada umur 18 hari.
4. Kultur Primer/Eksplan dari Jaringan Embrio Mencit
Alat dan Bahan
Steril:
- Growth medium (suplementasi 10% FBS dan 0% FBS)
- PBS 1 L
- Cawan petri 9 cm
- Alat bedah (pinset, scalpel, blade, gunting)
- Pipet kaca
- Tabung sentrifuga/falcon 15 mL
- Dish culture (polystirene) 33 mm

Cara kerja
Jaringan embrio yang telah dilepaskan dari uterus kemudian dicuci dengan PBS
yang berisi 1% antibiotik sebanyak dua kali. Selanjutnya dilakukan pemisahan antara
kepala dan badan embrio berserta jaringan yang tidak diinginkan. Pada praktikum ini
ingin dilakukan pengamatan pertumbuhan sel fibroblast yang mana banyak terdapat
dalam jaringan ikat dan kulit embrio. Setelah dilakukan pemisahan jaringan yang tidak
diinginkan, jaringan yang akan dikultur kemudian direndam dalam gelas kimia yang
berisi alkohol 70% selama ±1 menit. Selanjutnya jaringan segera dipindahkan ke dalam
cawan petri berisi PBS dan antibiotik 1% hingga bersih (termasuk dari darah). Jaringan
yang telah siap, ditransfer ke dalam cawan petri berisi medium basal (serum free media)
untuk dilakukan penyacahan atau pemotongan jaringan hingga berukuran 0,5-1,0 mm
dengan metode crossed scalpel (lihat Gambar 2). Selanjutnya, jaringan yang telah
dicacah, diresuspensi dalam tabung sentrifuga 15 ml dalam medium basal, kemudian
supernatant dibuang dan jaringan yang tertinggal di tabung bagian bawah dipindahkan ke
dish culture yang telah berisi growth medium suplementasi FBS 10% atau yang tidak
disuplementasi FBS (serum free media).
Gambar 2. Metode pencacahan jaringan menjadi eksplan primer dan penanaman eksplan ke
substrat yang berisi growth medium (a) serta hasil outgrowth cells yang tumbuh disekitar eksplan
(b), outgrowth cells berumur 7 hari yang tumbuh setelah eksplan dibuang (c)

Format logbook
1. Judul (5)
2. Tujuan (5)
3. Hipotesis: terkait tujuan (10)
4. Pendahuluan: (a) penjelasan kultur sel hewan secara umum, (b) definisi kultur primer dan
teknik dasar kultur primer embrio mencit, (c) komposisi secara umum dan fungsi medium
basal (DMEM) dan FBS (Fetal Bovine Serum) sebagai medium kultur, (d) karakteristik
umum sel hewan yang dikultur (20)
5. Alat dan bahan (5)
6. MSDS: alkohol 70%, PBS, DMEM, FBS, Penicillin-Streptomycin (5)
7. Cara kerja (10)
8. Hasil dan Pembahasan (30)
9. Kesimpulan (5)
10. Daftar pustaka (5)