Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

LEMBAR TUGAS MANDIRI

“Cell Lines & Repository Microbes”

Oleh Miranthy Cinthya R., 1906302195

Menurut buku “The Complete Guide to Cell Culture”, kultur sel merupakan
pertumbuhan sel dari hewan ataupun tumbuhan dalam lingkungan buatan yang terkontrol. Sel-
sel tersebut dapat diambil secara langsung dari jaringan dan kemudian dipisahkan sebelum
kemudian dibiakkan atau dapat diperoleh dari cell line maupun cell strain yang telah ada.
Penggunaan cell lines untuk kultur sel memiliki keunggulan dari pada sel yang diambil
langsung dari jaringan. Untuk melakukan kultur sel, diperlukan juga penyimpanan sel mikroba
untuk memudahkan proses pengkulturan sel. Pada laporan ini, akan dibahas beberapa hal
mengenai cell lines dan repository microbes.

1. CELL LINES
1.1.Definisi Cell Lines
Kultur sel dapat berupa kultur sel primer maupun kultur sel dengan
menggunakan cell line. Kultur sel primer artinya sel yang digunakan dalam kultur
telah diisolasi secara langsung dari jaringan tubuh organisme asalnya dan dibiakkan
dalam kondisi yang sesuai. Sel primer kemudian bisa disubkultur dengan
memindahkannya ke vessel baru dengan medium yang segar sebagai ruang
pertumbuhan selanjutnya. Subkultur dapat memperbanyak kultur sel primer yang
dibuat dan menghasilkan cell line karena tahap subkultur menstimulasi proliferasi dan
melanjutkan pertumbuhan sel (Gibco, 2020).

Gambar 1. Vessel untuk Kultur Sel

Sumber: (https://www.mccourier.com/, 2021)
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

Maka, kultur sel dengan cell line dapat diartikan sebagai kultur sel yang
menggunakan sel dari hasil subkultur pertama sel primer (Gibco, 2020). Kultur sel
dengan menggunakan cell line lebih unggul daripada kultur sel primer karena
kemungkinan adanya kontaminasi dari lingkungan lebih kecil.
1.2.Tipe Cell Lines
Berdasarkan rentang hidup pada kulturnya, terdapat dua tipe dari cell lines, yaitu:
a. Finite Cell Lines
Finite cell lines adalah cell lines yang rentang hidup dalam kulturnya dibatasi.
Sel-sel normal biasanya membelah dalam jumlah terbatas sebelum akhirnya
mengalami penuaan sel (kehilangan kemampuannya untuk berproliferasi atau
membelah). Biasanya, sel-sel ini membelah 20 hingga 100 kali, tergantung
pada spesies, perbedaan garis keturunan sel, kondisi kultur, dan lain-lain.
Beberapa cell line menjadi immortal melalui proses yang disebut transformasi,
yang dapat terjadi secara spontan ataupun secara kimiawi atau dapat pula
dengan diinduksi oleh virus. Ketika finite cell line mengalami transformasi dan
memperoleh kemampuan untuk membelah tanpa batasan waktu, maka cell line
itu menjadi continous cell line.
b. Continuous Cell Lines
Seperti yang sudah sedikit dibahas pada bagian finite cell lines, continuous cell
lines adalah finite cell lines yang telah mengalami transformasi sehingga dapat
membelah terus menerus. Ciri dari continuous cell lines adalah sudah
ditransformasi, bersifat abadi, dan tumorigenik (dapat memicu atau
menyebabkan tumor). Sel yang ditransformasikan untuk continuous cell lines
dapat diperoleh dari kultur sel primer normal atau cell strains dengan
memperlakukannya dengan karsinogen kimiawi atau dengan menginfeksi
virus onkogenik.
Berikut merupakan tabel perbedaan finite cell lines dan continuous cell lines.
Sifat Finite Cell Lines Continuous Cell Lines
Laju Pertumbuhan Lambat Cepat
Mode Pertumbuhan Monolayer Suspensi atau monolayer
Yield Rendah Tinggi
Transformasi Normal Immortal, tumorigenik
Ploidi Euploid Aneuploid
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

Anchorage Dependence Ya Tidak

Penghambatan Kontak Ya Tidak
Efisiensi Kloning Rendah Tinggi
Kebutuhan Serum Tinggi Rendah
Kromosomal, antigenik
Marker Jaringan spesifik
atau enzimatik
Tabel 1. Perbedaan Finite Cell Lines Dan Continuous Cell Lines.
(Chaudhary and Singh, 2017)
1.3.Nomenklatur dari Cell Lines
Nomenklatur atau tata nama dari cell lines digunakan untuk mengidentifikasi
cell lines. Tata nama ini biasanya menggunakan kode, contohnya NHB 2-1 yang
merepresentasikan cell line yang diperoleh dari otak manusia, lalu angka 2
menunjukkan cell strain (atau nomor cell line) dan 1 merupakan nomor kloning.
Penamaan dari cell line harus unik agar tidak ada kekeliruan atau kebingungan yang
terjadi pada saat laporan mengenai suatu cell line diberikan dalam literatur. Selain itu,
pada waktu publikasi penamaan cell line juga harus diawali dengan kode khusus
laboratorium tempat cell line tersebut diperoleh, contohnya WI untuk Wistar Institute
atau NCI untuk National Cancer Institute (Chaudhary and Singh, 2017).
1.4.Pengembangan Cell Lines Baru
Berikut merupakan proses pengembangan cell lines:

Gambar 2. Proses Pengembangan Cell Lines

Sumber: (https://www.moleculardevices.com/)
1. Transfeksi, yaitu proses memasukkan DNA asing ke dalam sel inang.
2. Skrining antibodi / peringkat titer, yaitu tahap pencarian dan pemilihan klon
bernilai tinggi dari kumpulan sel yang ditransfeksi.
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

3. Isolasi sel tunggal dan viabilitas sel, Sel tunggal yang viabel harus diisolasi
dan diklon untuk memastikan bahwa populasi sel identik secara genetik, secara
signifikan mengurangi heterogenitas ekspresi.
4. Jaminan monoklonalitas
5. Skrining produktivitas klon dan titer - Uji yang mendeteksi jumlah protein
atau antibodi rekombinan yang dihasilkan dari cell line yang diturunkan secara
klonal.

2. REPOSITORY MICROBES
2.1.Pengertian
Repository microbes artinya adalah tempat yang digunakan untuk menyimpan
mikroba yang nantinya akan digunakan dalam penelitian. Istilah ini tidak dapat
dipisahkan dari istilah preservasi. Preservasi adalah usaha untuk menyimpan
mikroorganisme agar tetap viabel atau mampu hidup (Fitriana, 2019).
Secara umum, tujuan utama preservasi adalah mengurangi laju metabolisme
mikroorganisme sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitasnya, dan
memelihara biakan sebaik mungkin sehingga angka pemulihan (recovery) dan
kemampuan bertahan hidup (survival) tetap tinggi dengan perubahan yang seminimal
mungkin (Machmud, 2001).
2.2.Manfaat
Manfaat dari koleksi kultur mikroba, antara lain:
1. Untuk mengumpulkan, memelihara, dan menyebarkan kultur mikroba.
2. Untuk mengumpulkan data kultur dan membuatnya dapat diakses oleh komunitas
penelitian mikrobiologi melalui katalog cetak atau online. Data budaya biasanya
sama berharganya dengan organisme itu sendiri, dan peneliti perlu mengakses
informasi ini. Database tingkat lanjut sangat penting untuk transfer pengetahuan
ini. Peneliti dan ahli taksonomi dapat memilih strain untuk aplikasi penelitian
tertentu melalui katalog cetak atau database online. Data ini, terutama di era
bioinformatika, akan menjadi lebih berharga.
3. Untuk bertindak sebagai simpanan mikroorganisme yang aman dengan distribusi
terbatas.
4. Untuk menyediakan layanan identifikasi tentang berbagai jenis mikroorganisme
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

5. Berfungsi sebagai tempat penyimpanan kultur yang berharga. Menyimpan kultur

yang dijelaskan dalam publikasi sangat penting untuk memastikan akses di masa
depan dan memungkinkan reproduktifitas ilmiah.
6. Untuk mengatur kursus pelatihan dan lokakarya terkait dengan identifikasi dan
pemeliharaan mikroorganisme. Kursus dan lokakarya singkat sangat penting
untuk melatih personel dari laboratorium medis, lingkungan, industri atau
pemerintah yang memiliki tanggung jawab untuk mengisolasi dan
mengidentifikasi mikroorganisme, mendiagnosis penyakit, pengendalian kualitas,
fermentasi, manajemen kultur, dll.
7. Untuk melakukan penelitian terkait terutama untuk taksonomi dan pelestarian
mikrobiologi (Çaktü & Türkoğlu, 2011).
2.3.Jenis-jenis Penyimpanan Mikroba
Berdasarkan lama jangka waktu penyimpanan, penyimpanan mikroba dibedakan
menjadi dua, yaitu:
a. Penyimpanan Jangka Pendek
Penyimpanan atau preservasi jangka pendek biasanya dilakukan untuk keperluan
rutin penelitian dalam laboratorium. Penyimpanan jangka pendek dilakukan
dengan cara memindahkan mikroba dari media lama ke media yang baru secara
berkala dalam jangka waktu dekat, misalnya sebulan sekali. Karena dilakukan
secara rutin (misal setiap bulan), maka Teknik ini membutuhkan waktu dan tenaga
yang cukup besar. Tetapi karena hanya memerlukan peralatan yang sederhana dan
mudah diperoleh, Teknik penyimpanan jangka pendek sangat berguna untuk
lembaga atau laboratorium yang belum memiliki peralatan yang canggih. Contoh
dari penyimpanan jangka pendek, antara lain penyimpanan dalam akuades steril,
penyimpanan dalam minyak mineral, dan penyimpanan dengan manik-manik
porselen.
b. Penyimpanan Jangka Panjang
Preservasi jangka Panjang dilakukan untuk koleksi dan konservasi stok mikroba
dengan tujuan agar dapat menumbuhkannya pada saat diperlukan kembali dengan
kinerja yang sama seperti semula. Untuk melakukan penyimpanan jangka
panjang, dibutuhkan peralatan yang khusus. Teknik penyimpanan jangka panjang
dinilai efektif dalam menyimpan mikroba karena memerlukan waktu dan tenaga
yang lebih sedikit. Akan tetapi, tidak semua laboratorium atau lembaga memiliki
peralatan untuk melakukan teknik tersebut. Contoh dari teknik preservasi jangka
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

panjang, antara lain teknik kering beku atau liofilisasi dan penyimpanan secara
kriogenik.
2.4.Tahapan
Penyimpanan Jangka Pendek
a. Penyimpanan dalam Akuades Steril
Tidak semua bakteri dapat disimpan dengan baik dalam akuades steril,
tetapi bakteri yang berbentuk batang dan bereaksi gram negatif seperti bakteri
Pseudomonas dapat disimpan cukup lama dalam akuades steril pada suhu ruang
atau suhu 10-15°C. Pada kondisi ini, bakteri yang disimpan masih bisa tumbuh
dengan lambat, sehingga tidak dapat dijamin stabilitas genetiknya untuk jangka
panjang. Penyimpanan dengan cara ini juga memungkinkan terjadinya
kontaminasi (Machmud, 2001).
Tahap penyimpanan mikroba dalam akuades steril adalah sebagai berikut:
1) Aquades steril disiapkan dalam botol dengan tutup berukuran 25 ml, 5-10
ml/botol (Sly, 1983) atau dalam tabung ependorf.
2) Mikroba yang akan disimpan ditumbuhkan dalam bentuk biakan murni pada
medium agar miring yang sesuai.
3) Biakan bakteri berumur 24-48 jam disimpan dengan beberapa cara seperti:
• Menambahkan 3-5 ml aquades steril ke dalam biakan miring, mengocok
tabung hingga diperoleh suspensi pekat bakteri (108 -109 sel/ml), dan
memindahkan 1 ml suspensi ke dalam tiap botol yang berisi air steril.
• Memindahkan satu ose biakan miring bakteri ke dalam tabung reaksi
berisi 3-5 ml aquades steril, tabung dikocok hingga suspensi merata, dan
memindahkan 1 ml suspensi ke dalam tiap botol yang berisi air steril.
• Memindahkan satu ose biakan miring bakteri langsung ke dalam tiap botol
yang berisi air steril dan mengocok hingga merata.
4) Botol ditutup rapat dan disimpan pada suhu ruang atau suhu 10-15°C
5) Uji viabilitas mikroba dan pemeliharaan stok isolat dilakukan secara rutin.
6) Penumbuhan kembali biakan dilakukan dengan mengambil botol dari tempat
penyimpanan, mengocok, dan mengambil satu ose suspensi dan
menumbuhkan pada medium cair atau langsung pada medium agar yang
sesuai.
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

b. Penyimpanan dalam Minyak Mineral

Dasar teknik penyimpanan ini adalah mempertahankan viabilitas
mikroba dengan mencegah pengeringan medium, sehingga waktu peremajaan
dapat diperpanjang hingga beberapa tahun. Teknik ini sederhana, tetapi kurang
praktis untuk ditransportasi. Di samping itu, keberadaan minyak mineral
mengakibatkan peremajaan menjadi kotor.
Cara penyimpanan dalam minyak mineral menurut Elliot (1975) adalah sebagai
berikut:
1) Penyediaan tabung reaksi dengan tutup atau botol McCartney berisi medium
agar miring yang sesuai untuk mikroba yang akan dipelihara.
2) Penyediaan minyak mineral atau parafin cair steril, diautoklaf pada suhu
121°C selama 60 menit.
3) Menumbuhkan mikroba yang akan disimpan dalam tabung agar miring selama
24-48 jam dan memeriksa kemurnian biakan untuk menghindari kontaminasi.
4) Setelah mikroba tumbuh baik, parafin cair steril dimasukkan ke dalam botol
secukupnya, sehingga permukaan parafin atas berada 10-20 mm di atas
permukaan medium agar.
5) Botol biakan yang telah diberi parafin cair disimpan pada suhu ruang atau di
kulkas.
6) Uji viabilitas mikroba dan pemeliharaan isolat dilakukan secara periodik dan
rutin, paling tidak setiap tahun.
7) Penumbuhan kembali (recovery) mikroba (bakteri, khamir) dilakukan dengan
cara mengambil secara aseptik sebagian biakan dari tabung, memindahkan dan
mensuspensikan pada medium cair. Minyak mineral mengapung di permukaan
suspensi dan sebagian suspensi digoreskan pada medium agar yang sesuai.
Biakan jamur digoreskan langsung pada medium agar.
Penyimpanan Jangka Panjang
a. Teknik Kering-Beku (Liofilisasi)
Teknik kering beku atau teknik liofilisasi merupakan teknik
penyimpanan yang paling populer dan banyak digunakan untuk penyimpanan
jangka panjang mikroba. Teknik ini cocok untuk menyimpan berbagai jenis
mikroorganisme ter-masuk virus (Holding dan Lelliott, 1960), bakteri (Sly,
1983), khamir, jamur berspora dan jamur yang tidak berspora, bahkan algae dan
protozoa (Clark, 1976).
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

Teknik ini dinilai paling rumit jika dibandingkan dengan Teknik

penyimpanan lainnya karena membutuhkan keterampilan teknis dan modal awal
yang besar untuk membeli peralatan pengering beku atau freezing dryer. Jika alat
sudah tersedia, maka teknik ini menjadi sederhana dan sangat memuaskan.
Sesungguhnya alat pengering beku tidak selalu merupakan alat yang canggih dan
mahal, karena peralatan yang sederhana dapat dirakit sendiri dengan
mengkombinasikan pompa vakum dan kompresor pendingin. Saat ini berbagai
model alat pengering beku dijumpai di pasaran yang harganya terjangkau oleh
suatu lembaga penelitian.
Tahap penyimpanan kering beku adalah sebagai berikut:
1) Ampul kosong ukuran 1,0 ml diberi label di dalamnya dengan menuliskan
nomor kode strain mikroba pada sepotong kertas filter 3 mm x 20 mm
menggunakan pensil, ditutup dengan kapas dan di luar ampul diberi label
nomor kode strain menggunakan spidol permanen. Ampul disterilkan
dengan oven kering bersuhu 160°C selama satu jam.
2) Strain mikroba yang akan disimpan dibiakkan pada medium yang sesuai
hingga pertumbuhan optimum (log phase), umum-nya 24-48 jam pada
suhu ruang.
3) Penyediaan larutan preservatif yang sesuai untuk mikroba yang akan
diawetkan.
4) Suspensi pekat strain mikroba 108 -109 sel atau konidia/ml dibuat dalam
cairan preservatif.
5) Ampul yang telah disterilkan diisi dengan 0,1-0,3 ml suspensi mikroba
secara aseptik menggunakan pipet Pasteur atau pipet mikro.
6) Suspensi mikroba dalam ampul dibekukan pada suhu -20 sampai -30°C
atau menggunakan dry ice.
7) Ampul yang telah dibekukan dengan cepat dilakukan proses kering beku
dengan menempelkan pada alat pengering beku. Prosedur kering beku
dilakukan sesuai dengan petunjuk pada masing-masing alat.
8) Setelah selesai proses kering beku, ampul dipotong mengguna-kan api las.
9) Ampul yang sudah dipotong diatur rapi pada kotak penyimpan ampul.
10) Sebagian ampul diambil sebagai contoh untuk menguji viabilitas mikroba
setelah proses kering beku.
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

11) Pengujian juga dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap
tahun, untuk mengetahui viabilitas mikroba.
12) Penumbuhan kembali mikroba:
• Ampul dikeluarkan dari tempat penyimpanan dan direndam pada
suhu 37°C atau dibiarkan beberapa saat pada suhu ruang untuk
mencairkan isi ampul (thawing).
• Secara aseptik leher ampul dipotong dengan pemotong kaca dan
dipatahkan.
• Beberapa tetes medium cair dimasukkan ke dalam ampul, dibiarkan
beberapa saat dan agak dikocok agar biakan cepat larut.
• Sebagian suspensi diambil dan ditumbuhkan pada cawan medium
agar yang sesuai.
• Koloni mikroba ditumbuhkan pada medium agar miring.
b. Kriopreservasi
Mikroba dapat disimpan lama dalam kondisi beku dengan cara
mengurangi sebagian besar aktivitas atau kecepatan metabolismenya. Dalam
teknik ini, mikroba disimpan dalam freezer yang bersuhu -20°C dan -70°C.
Semakin rendah suhu penyimpanan, semakin kecil peluang kehilangan
viabilitasnya. Tetapi apabila mikroba disimpan pada suhu di bawah titik beku air,
maka bagian luar dan dalam sel akan terdapat es dan hal tersebut menyebabkan
rusaknya dinding sel mikroba. Untuk mencegah hal ini, pada kriopreservasi
digunakan senyawa antibeku atau cryoprotectant seperti gliserol. Gliserol bekerja
dengan menurunkan titik beku suspensi sehingga pembentukan kristal es di dalam
sel mikroba dapat diminimalisir dan gliserol juga melindungi jaringan intraseluler
dengan cara menembus membran sel dan memodifikasi pembentukan kristal es
melalui pencegahan peningkatan konsentrasi elektrolit di dalam sel tersebut.
Tetapi, gliserol juga memiliki kekurangan yaitu dapat bersifat toksik bagi
mikroba apabila digunakan lebih dari 10% (Fitriana, 2019).
Tahapan teknik kriopreservasi adalah sebagai berikut:
1) Penyediaan Ampul, Ampul (ukuran 1 ml) yang akan digunakan untuk
menyimpan mikroba diberi label di dalamnya dengan potongan kertas filter
dan di bagian luarnya juga diberi label dengan menggunakan spidol
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

permanen. Ampul ditutup kertas aluminium dan disterilkan dengan oven

kering suhu 160°C.
2) Penumbuhan Biakan, Biakan mikroba disiapkan seperti pada penyimpanan
dengan teknik kering beku. Biakan jamur dapat disediakan dengan cara
menginokulasi 0,3 ml medium agar yang sesuai langsung pada ampul dan
diinkubasi hingga membentuk spora atau konidia, dengan membuat suspensi
spora atau konidia, atau dengan mengambil potongan agar yang ditumbuhi
miselia.
3) Suspensi Sel dalam Medium Preservasi, Menggunakan pipet steril ukuran
5 ml dipindahkan 5 ml medium preservatif misalnya larutan gliserol 5-10%
atau DMSO 5% pada biakan miring mikroba. Biakan disuspensikan pada
medium preservatif menggunakan pipet Pasteur steril sehingga terbentuk
suspensi pekat mikroba. Suspensi mikroba dipindahkan ke dalam ampul yang
telah disediakan, 0,3-0,5 ml setiap ampul. Biakan jamur yang telah
ditumbuhkan dalam ampul dapat langsung ditambahkan 0,4 ml enceran
preservatif.
4) Penutupan Ampul, Penutupan ampul dilakukan menggunakan penangas api
las. Ampul yang telah dipotong, dipak sesuai dengan kebutuhan dan siap
untuk disimpan.
5) Penyimpanan Ampul, Ampul yang telah dipak dan diperiksa label luarnya
ditempatkan pada freezer bersuhu -30°C untuk prapembekuan secara
perlahan. Setelah itu, ampul dipindahkan dengan cepat ke alat kriogenik,
yaitu alat penyimpan menggunakan nitrogen cair. Uji viabilitas bakteri
dilakukan secara periodik dan rutin, misalnya setiap tahun.
6) Penumbuhan Kembali Mikroba, Ampul dikeluarkan dari tempat
penyimpanan dan direndam pada suhu 37°C atau dibiarkan beberapa saat
pada suhu ruang untuk mencairkan isi ampul (thawing). Secara aseptik leher
ampul dipotong dengan pemotong kaca dan dipatahkan. Beberapa tetes
medium cair dimasukkan ke dalam ampul, dibiarkan beberapa saat dan agak
dikocok agar biakan cepat larut. Sebagian suspensi diambil dan ditumbuhkan
pada cawan medium agar yang sesuai. Koloni mikroba ditumbuhkan pada
medium agar miring.
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

Kesimpulan
• Cell line adalah kultur yang diperoleh dari subkultur pertama dari kultur primer.
• Cell line lebih unggul daripada kultur sel primer karena meminimalisir kemungkinan
kontaminasi mikroorganisme lain.
• Repository microbes adalah tempat yang digunakan untuk menyimpan mikroba yang
nantinya akan digunakan dalam penelitian
Kultur Sel Program Studi Teknik Bioproses

Referensi

Andiana, M., Rachmawati, Y., & Andayani, S. S. (2017). Kultur Sel Baby Hamster Kidney
(Bhk) Menggunakan Media Dulbecco's Modified Eagle Medium
(Dmem). Biotropic, 1(1), 10-17.

Caktu, K. and Turkoglu, E., 2011. Microbial culture collections: The essential resources for
life. Gazi University Journal of Science, 24(2), pp.175-180.

Chaudhary, V. and Singh, P., 2017. CELL LINE: A REVIEW. International Journal of
Advance Research in Science and Engineering, 6(4), pp.254-263.

Fitriana, F., 2019, March. Preservation of Corynebacterium striatum bacteria using silica gel.
In Prosiding Seminar Nasional Masyarakat Biodiversitas Indonesia (Vol. 5, No. 1, pp.
134-138).

Invitrogen Gibco, 2020. Cell Culture Basics Handbook.

Khumairoh, I. and Puspitasari, I.M., 2016. Kultur Sel. Farmaka, 14(2), pp.98-110.

Machmud, M., 2001. Teknik penyimpanan dan pemeliharaan mikroba. Buletin AgroBio, 4(1).

Molecular Devices. 2021. Cell Line Development. [online] Available at:

<https://www.moleculardevices.com/applications/cell-line-development#gref>
[Accessed 21 March 2021].

n.d. The Complete Guide To Cell Culture. [ebook] Proteintech Group. Available at:
<https://www.ptglab.com/media/4457/the-complete-guide-to-cell-culture.pdf>
[Accessed 26 February 2021].

Najmiyati, E. and Akhadi, D.H., 2012. Viabilitas dan kinerja konsorsium mikroba
pendegradasi hidrokarbon setelah penyimpanan dalam pendingin dan penyimpanan
beku. Ecolab, 6(2), pp.81-89.
Susilawati, L. and Purnomo, E.S., 2016. Viabilitas sel bakteri dengan cryoprotectant agents
berbeda (sebagai acuan dalam preservasi culture collection di laboratorium
mikrobiologi). Biogenesis: Jurnal Ilmiah Biologi, 4(1), pp.34-40.