LAPORAN PRAKTIKUM

MODUL 2
Bioreaktor Kultur Sel
-Kelompok 13-
Amanda Emilia (1806207450)
Eva Esterina (1806207601)
Nabila Shaffa Rizky C (1806207513)
Rizki Fiko Pradana S (1806207412)
Tujuan Percobaan Alat dan Bahan
A • Shaker incubator
1. Memahami metode yang digunakan L • Spektrofotometer
A
• Stirred fermentor
untuk mengkultur sel T
• Beaker glass 500 ml
2. Mengetahui faktor-faktor yang • Tabung sentrifugasi Falcon
• Cawan petri untuk kultur
mempengaruhi kultur sel
bakteri (plate) B • Akuades
3. Mengetahui pola petumbuhan bakteri • MicrotubeAlkohol A • Bacillus subtilis
• Aluminium foil H • Medium LB cair
4. Menghitung kinetika pertumbuhan
• Kawat ose A
dari Bacillus subtilis pada kondisi • Kuvet N
• Autoklaf
aerobik
• Mikropipet
5. Mengetahui hubungan antara nutrisi • Plastic wrap
• Sentrifugasi
dan pertumbuhan Bacillus subtilis
 Prosedur Percobaan
1. Persiapan medium kultivasi dan inokulasi stock culture dalam medium cair
Menimbang 12,5 gr LB dan
Membungkus medium dengan Mensterilisasi medium dengan autoklaf hingga
Melarutkannya dengan
alumunium foil dan plastic wrap mendidih dengan suhu 121°C dan tekanan 2 atm
aquades

2. Inokulasi stock culture dalam medium cair

Memasukkan medium ke dalam microtube Bakteri diinkubasi pada pengaturan 37°C dan
sebanyak 1000μl pengadukan 2,5 dari 5 selama 18-24 jam

3. Kultur bakteri dalam fermentor berpengaduk

Bakteri dimasukkan ke dalam fermentor 300 ml larutan Bakteri dikultur hingga diperoleh data
Kultur bakteri
sebanyak 2-3
media LB cair dengan pengaturan 37° C dan kecepatan absorbansi pada OD 600 mencapai 0,6-
agitasi 200 rpm/3,33 Hz 0,8.

4. Pemanenan sel
Memanen sel dengan Memisahkan hasil Menghitung massa kering sel Menghitung konsentrasi biomassa
sentrifugasi sampel sebanyak 5 sentrifugasi antar yang dikeringkan dalam oven dengan spektrofotometer dengan
ml pada pengaturan 4000 x g padatan sel dan 80° C selama 30 menit interval 10 menit pada OD 600
selama 10 menit. supernatan.
Data Pengamatan
Optical Optical
Waktu Waktu
Density Density
(menit) (menit)
(nm) (nm) massa tabung vial
No. waktu massa basah kotor (gr)
10 0.0156 130 0.58 (gr)
20 0.0439 140 0.64 1 50 13.1468 13.2014
30 0.0489 150 0.689 2 90 12.543 12.6
40 0.0796 160 0.7506
3 110 12.8755 12.97
50 0.1047 170 0.8088
60 0.1723 180 0.8576
massa basah massa kering + massa bersih sel
70 0.1626 190 0.9088 No.
bersih (gr) mikrotube (gr) (gr)
80 0.2278 200 0.9543 1 0.0616 13.1601 0.0133
90 0.3178 210 0.9644 2 0.064 12.5715 0.0285
100 0.37 220 0.9721 3 0.1015 12.9168 0.0413
110 0.41 230 0.9845 Tabel 1. Hubungan waktu dengan OD600

120 0.49 240 0.992

Tabel 1. Hubungan waktu dengan OD600
Teori Dasar
❑ Kultur Bakteri
Kultur Bakteri adalah metode penggandaan dengan
membiarkannya berkembang biak dalam media kultur yang
telah ditentukan dalam kondisi laboratorium yang terkontrol.
Media kultur bakteri adalah suatu bahan yang terdiri atas Gambar 1. Kurva Pertumbuhan
campuran nutrisi atau zat – zat hara (nutrisi) yang digunakan Fase eksponensial : Fase dimana membelah dengan
untuk menumbuhkan mikroorganisme diatas atau didalamnya cepat dan konstan mengikuti kurva logaritmik
dalam bentuk padat, semi padat, dan cair yang terdiri dari C, H, Fase Stationer : Pada fase ini jumlah populasi sel tetap
O, N, S. P, K, Mg, Fe, Ca, Mn, dan sedikit Zn, Co, Cu, dan Mo. karena jumlah sel yang tumbuh sama dengan jumlah sel
yang mati.
❑ Bakteri Bacilius Subtilis Fase Kematian :Pada fase ini sebagian populasi bakteri
Bacillus subtilis, dikenal juga sebagai hay bacillus or grass mulai mengalami kematian.
bacillus, adalah bakteri Gram-positif, ditemukan di dalam
tanah dan saluran pencernaan ruminansia dan manusia.
❑ Persamaan laju pertumbuhan Bakteri
❑ Kurva Pertumbuhan Bakteri Persamaan monod : Model matematis untuk
Menunujukkan 4 fase pertumbuhan : Fase Lag, Fase pertumbuhan mikroorganisme
Eksponensial, Fase Stasioner, dan Fase Kematian
𝝁𝒎 𝑺
Fase lag :fase penyesuaian bakteri dengan lingkungannya yang 𝑹𝒙 = 𝝁 𝑺 𝑿 = 𝑿
𝑲𝑺 + 𝑺
baru dan peningkatan ukuran sel .
𝜇𝑚 : laju spesifik maksimum pertumbuhan dari E.coli
𝐾𝑆 : monod konstan jenuh
Pengolahan Data • Menghitung rata-rata massa basah • Menghitung kosentrasi sel
OD (X)
Konsentrasi
0,0616 + 0,064 + 0,1015 Sel (Y)
𝑚
ഥ= = 0,0757 𝑔𝑟 0,0156 0,00079796
1. Laju pertumbuhan bakteri: kurva 3 0,0439 0,00133849
0,0489 0,00143399
𝑂𝐷600 vs waktu (menit)​ • Menghitung massa kering bersih 0,0796 0,00202036
0,1047 0,00249977
𝑉 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑢𝑚 𝑘𝑢𝑙𝑡𝑢𝑟 𝑑𝑙𝑚 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜𝑟 0,1723 0,00379093
Berdasarkan data pengamatan dari 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑘𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔 =
𝑉 𝑣𝑖𝑎𝑙
×𝑚
ഥ 0,1626 0,00360566
0,2278 0,00485098
250
percobaan, waktu dan 𝑂𝐷600 dapat diplot =
5
× 0,0277 = 1,385 𝑔𝑟 0,3178 0,00656998
0,37 0,007567
untuk membuat kurva laju pertumbuhan • Menghitung massa basah bersih 0,41 0,008331
0,49 0,009859
bakteri 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑎ℎ =
𝑉 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑢𝑚 𝑘𝑢𝑙𝑡𝑢𝑟 𝑑𝑙𝑚 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜𝑟
ഥ.
×𝑚
0,58 0,011578
0,64 0,012724
𝑉 𝑣𝑖𝑎𝑙
250 0,689 0,0136599
= 5
× 0,0757 = 3,875 𝑔𝑟. 0,7506 0,01483646
0,8088 0,01594808
0,8576 0,01688016
• Menghitung massa substrat 0,9088 0,01785808
0,9543 0,01872713
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑆𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑏𝑎𝑠𝑎ℎ − 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑘𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔. 0,9644 0,01892004
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡 = 3,875 − 1,385 = 2,4 𝑔𝑟. 0,9721 0,01906711
0,9845 0,01930395
0,992 0,0194472
3. Perhitungan konsentrasi sel
• Kurva kalibrasi OD dengan
konsentrasi sel
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑠𝑒𝑙 𝑘𝑒𝑟𝑖𝑛𝑔
2. Menghitung massa substrat Konsentrasi sel =
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑣𝑖𝑎𝑙
• Menghitung rata-rata massa kering sel
0,0133 + 0,0285 + 0,0413
𝑚
ഥ= = 0,0277 𝑔𝑟
3
Analisis Percobaan
Persiapan Medium Kultivasi
• Digunakan media LB sebanyak 12,5 g dan dilarutkan pada 500 mL air pada labu Erlenmeyer
• Untuk memastikan tidak terjadi kontaminasi, labu ditutup dengan aluminium foil dan plastic wrap serta disterilisasi dengan
autoklaf
Inokulasi Stock Culture dalam Medium Cair
• 1000 μl media LB dipipet (mikropipet) ke microtube
• Inokulasi Bacillus Subtilis menggunakan jarum ose yang berpijar (untuk memastikan kondisinya steril)
• Microtube berisi stock culture diinkubasi pada shaking incubator agar bakteri tumbuh pada kondisi optimumnya
• Setelah selesai, pilih microtube dengan warna paling buram, dimana hal ini mengindikasikan pertumbuhan bakteri terbanyak
Kultur Bakteri dalam Fermentor Berpengaduk
• 2-3 mL Bakteri kemudian disubkuktur ke stirred fermentor dengan kapasitas 250 mL LB cair menggunakan mikropipet
setelah suhunya stabil (dikultur hingga 𝑂𝐷600 mencapai 0,6-0,8)
• Stirred fermentor biasanya memang digunakan untuk skala laboratorium, dimana dengan bantuan pengaduknya nutrisi
diharapkan tersebar merata
• Sampel diukur menggunakan spektrofotometri setiap 10 menit untuk melihat tingkat kekeruhan (OD) melalui nilai
absorbansi
Pemanenan Sel
• Dilakukan pada 3 interval waktu, yaitu 50, 90, dan 110 menit untuk disentrifugasi, dimana sel yang dikultur akan terpisah
dari medium cair membentuk endapan yang akan dipisahkan dari supernatan
Massa Kering Sel
• Sel dikeringkan pada oven (80°C, 30 menit,), lalu untuk menghilangkan cairan dan uap yang masih tersisa, sel akan
dimasukkan ke desikator
• Setelah itu massa sel kering ditimbang dan dikurangi dengan massa microtube untuk mendapatkan berat bersihnya
• Data absorbansi beserta massa sel kering dapat digunakan untuk mencari konsentrasi sel dengan membuat kurva kalibrasi
Analisis Hasil dan Grafik

• Berdasarkan kurva laju pertumbuhan bakteri, fase Lag terjadi pada rentang waktu 0 ‒ 70 menit, fase
Log terjadi pada rentang waktu 80 – 200 menit, dan fase Stasioner terjadi pada rentang waktu 210 –
240 menit

• Berdasarkan kurva laju pertumbuhan bakteri, yang merupakan hubungan waktu dan OD, dapat dilihat
bahwa waktu berbanding lurus dengan nilai OD. Dimana nilai OD menyatakan kepadatan bakteri
(yang dapat dilihat sebagai kekeruhan dalam microtube)

• Massa substrat sebanyak 2,5 g menunjukkan jumlah nutrisi yang masih tersedia pada stirred
fermentor di akhir proses kultur (nilai pendekatan). Dimana pada awal proses percobaan dilarutkan 12,5
g medium Luria Bertani (LB) pada 500 mL air

• Pengurangan jumlah nutrisi seiring berjalannya waktu menunjukkan bahwa bakteri memang mengalami
pertumbuhan dengan mengonsumsi nutrisi untuk proses metabolismenya

• Berdasarkan kurva kalibrasi, nilai OD berbanding lurus dengan konsentrasi sel, dimana dengan
semakin meningkatnya nilai OD maka konsentrasi sel juga akan bertambah.

• Hubungan antara OD dan konsentrasi sel dapat dinyatakan dalam y = 0.0191x + 0.005, dimana
persamaan ini digunakan untuk mencari konsentrasi sel yang sesungguhnya
 Analisis Kesalahan Kesimpulan
Kemungkinan terjadinya kontaminasi akibat penggunaan • Kultur sel merupakan suatu teknik untuk memperbanyak

mikropipet berulang kali dan pada saat pembukaan lengan sel dimana prosesnya dilaksanakan dalam kondisi steril

fermentor, dalam waktu cukup lama, sehingga massa sel dan (aseptis)

konsentrasi sel yang didapat mungkin saja kurang akurat serta • Sel dapat dikultur dengan cara adeherent atau monolayer

terjadinya kompetisi antara Bacillus Subtilis dengan • Faktor-faktor yang mempengaruhi kultur sel adalah nutrisi,

kontaminan dalam mengkonsumsi nutrisi jenis media yang digunakan, suhu, pH, kandungan air, dan
Dissolve Oxygen (DO)
Saran • Berdasarkan grafik hubungan antara OD600 dengan waktu,
• Pastikan bahwa alat dan meja kerja yang digunakan steril dapat dilihat fase pertumbuhan dari Bacillus Subtilis pada
• Pada saat melakukan streak, pastikan bahwa jumlah yang percobaan ini, yaitu fase lag, fase log, dan fase stasioner
terambil di jarum ose cukup banyak • Kultur sel dipengaruhi oleh substrat, dimana semakin lama
• Pada saat pengambilan sampel dari stirred fermentor, proses kultur sel berlangsung, maka substrat di dalam
diusahakan lebih cekatan karena pada saat tutup medium akan semakin berkurang dan konsentrasi sel
lengannya dibuka, risiko kontaminasi sangat besar bertambah

• Mengelap kuvet dengan tissue sebelum memasukkannya ke • Berdasarkan kurva hubungan antara OD dengan
spektrofotometer konsentrasi diperoleh bahwa semakin meningkatnya OD

• Sebaiknya menggunakan mikropipet sekali pakai maka konsentrasi sel akan semakin meningkat.
Daftar Pustaka
Isaac dan Jennings, D. 1995. Microbial Culture. Oxford, U.K.
Ma’at, Suprapto. 2011. Teknik Dasar Kultur Sel. Surabaya: Airlangga University Press
Monod, J., The Growth of Bacterial Cultures, Ann. Rev. Microbiol. 3, 371-394, (1949)
Tim Dosen. 2015. Modul Praktikum Unit Operasi Bioproses 1. Depok : Departemen
Teknik Kimia Fakultas Teknik Universitas Indonesia