Minggu ke 5

G. E. Wijayanti
Program Sarjana, Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman
PENDAHULUAN
 Pengertian kultur primer: kultur sel yang diperoleh
secara langsung setelah sel/jaringan/organ diangkat
dari suatu organisme.
 Tipe kultur primer
 Kultur eksplan: organ/jaringan langsung dikultur dalam
medium yang sesuai.
 Kultur sel: jaringan/organ didisosiasi melalui reaksi
enzimatik ataupun mekanik kemudian sel-sel yang
diperoleh dikultur dalam medium
 Campuran beberapa tipe sel → heterogenous cells
 Sel tertentu hasil purifikasi → homogenous cells
Contoh kultur primer
A B C

Keterangan:
A. Reasosiasi sel-sel folikel dan oosit in vitro
B. Kultur primer paru-paru tikus neonatal, dengan berbagai tipe sel
C. Kultur primer sel granulosa
Kelebihan dan kekurangan kultur primer

 Kelebihan
 Baru diambil dari jaringan/organ hidup sehingga fungsi
sel lebih mencerminkan kondisi sel tersebut pada
kondisi in vivo
 Kekurangan
 Renponsif terhadap perubahan kondisi kultur pada
hari-hari atau minggu pertama kultur
 Adanya kerusakan dan rekaveri sel selama pemrosesan
 Perubahan dari kondisi in vivo ke in vitro
 Perubahan komposisi sel karena adanya sel yang mati,
berploriferasi ataupun berdiferensiasi.
PEMBUATAN KULTUR PRIMER
1. Persiapan peralatan
2. Persiapan sumber jaringan
3. Pengambilan jaringan
4. Pembentukan suspensi sel
5. Penanaman jaringan
6. Pemeliharaan kultur
7. Evaluasi hasil kultur
1. Persiapan peralatan

Biosafety Cabinet Tissue culture ware

Disecting set Cell stack

Culture tube
Mikroskop Centrifuge Waterbath Micro pipette
2. Persiapan sumber jaringan
 Beberapa pertimbangan yang perlu diperhatikan dalam
persiapan sumber jaringan adalah:
 Tujuan kultur
 Praktikum
 Penelitian

 Tipe jaringan
 Jaringan embrional
 Jaringan dewasa

 Ketersediaan jaringan
 Jumlah terbatas
 Jumlah cukup banyak
3. Pengambilan jaringan

 Beberapa hal yang

perlu diperhatikan
dalam proses
pengambilan
jaringan:
 Aseptisitas
 Kesegaran jaringan
 Tipe kultur
4. Pembentukan suspensi sel
 Untuk mendapatkan single cell maka perlu dilakukan disosiasi
sel menggunakan enzim.
 Enzim yang sering digunakan diantaranya:
 Tripsin: enzim proteolitik yang paling sering digunakan bertujuan
untuk mencerna matriks ekstra seluler
 Collagenase: berfungsi untuk mencerna jaringan ikat
 Pronase: digunakan untuk mencerna jaringan embrional karena
sifatnya tidak sekeras tripsin dan collagenase
 Beberapa enzim dapat digunakan secara bersamaan bila diperlukan;
enzim dapat pula dikombinasikan dengan chelating agent untuk
mempercepat disosiasi
 Waktu dan temperatur inkubasi dalam enzim
 Waktu dan temperatur inkubasi harus diperhatikan untuk menghindari
over digest yang dapat merusak membran sel
 Inaktivasi enzim
 Inaktivasi enzim dilakukan untuk mencegah over digest, agensia yang
biasa digunakan adalah serum
Disosiasi jaringan
i. Mekanik : antara lain mincing (pencacahan),
tituration (pemipetan), sieving (penyaringan)
ii. Enzimatik: trypsin, pronase, collagenase,
dispase.
iii. Kombinasi dari kedua pilihan di atas
Pemisahan jaringan secara mekanik
 Tripsinasi pada temperatur hangat Tripsinasi pada temperatur dingin

Disosiasi jaringan secara mekanik dilanjutkan enzimatik menggunakan Tripsin

a) Berat basah embrio mencit tanpa plasenta ataupun membran menurut umur
kehamilan.
b) Sel yang dihasilkan per embrio setelah diinkubasi dengan 0,25% trypsin pada
37°C selama 4 jam (kotak) atau 0,25% trypsin pada 4°C selama 5 jam dilanjutkan
inkubasi pada 37°C selama 30 menit (segitiga)
 Sebelum collagenase dibuang

Setelah collagenase dibuang

Disosiasi jaringan secara mekanik dilanjutkan enzimatik

menggunakan collagenase
5. Penanaman jaringan
 Sebelum dilakukan penanaman jaringan perlu dilakukan
pengujian
 viabilitas sel: trypan blue, crystal violet
 kepadatan sel dalam suspensi: manual dan cell counter
 Kepadatan sel pada saat penanaman
 Faktor lingkungan yang perlu diperhatikan
 Temperatur inkubasi: menyesuaikan dengan temperatur
individu asal sel
 Poikiloterm: 18-25°C
 Homeoterm: 36-37°C
 Pemilihan medium: menyesuaikan kebutuhan sel
 Jenis substrat: menyesuaikan tipe sel yang dikultur
 Cell density and cell viability

1 2 3

6 5 4
Jenis cawan kultur, luas area dan jumlah sel yang dihasilkan
Petridish

Multi well plates

Roller bottle
 3 hari

7 hari

Gambar skematis proses diseksi dan penanaman Eksplant

pada kultur primer jaringan karsinoma kulit mencit
Foto morfologi kultur eksplan (A) hepatopancreas, (B) insang, (C) sirip kaudal dan
(D) limfa ikan nilem (Osteochilus vittatus) yang dikultur dalam medium DMEM
dengan suplemen 5% L-gulamin, 5% penstrep dan 10% FBS selama 9 hari

Sumber: Gratiana E. Wijayanti and Atang 2021 IOP Conf. Ser.: Earth Environ. Sci.
746 012023
Foto morfologi sel yang berasal dari (A) eksplan sirip kaudal, (B) hepatopancreas,
(C) limfa dan (D) insang ikan nilem (Osteochilus vittatus) yang dikultur dalam
medium DMEM dengan suplemen 5% L-gulamin, 5% penstrep dan 10% FBS
selama 9 hari (400x)

Sumber: Gratiana E. Wijayanti and Atang 2021 IOP Conf. Ser.: Earth Environ.
Sci. 746 012023
6. Pemeliharaan kultur
 Tipe kultur
 Monolayer culture system: sel tumbuh dan melekat pada
substrat
 Biasanya ditumbuhkan dalam petri dish, T-flask, atau mutiple well
plate
 Suspension culture system: sel berada bebas dalam medium
 Contoh sel darah
 Ditumbuhkan dalam rotated spinner flask atau shaken erlenmeyer
flask

Spinner flask Erlenmeyer Roller Low profile flask Well plate

flask bottle
7. Evaluasi hasil kultur
 Bagaimana perkembangan sel setelah dikultur?
 Di dalam media kultur, sel memperlihatkan tingkahlaku, karakteristik dan
bentuk yang beragam.
 Kondisi kultur yang baik ditandai dengan adanya sel yang tumbuh dan
melalukan pembelahan tidak sekedar bertahan hidup
 Tipe Sel
 Tipe sel dalam kultur biasanya dibedakan berdasarkan karakteristik morfologi
dan fungsinya
 Epithelial-like: sel melekat pada substrat , tampak pipih dan berbentuk
poligonal
 Lymphoblast-like: sel pada umumnya tidak melekat pada substrat dan
berbentuk bulat
 Fibroblast-like: sel melekat pada substrat, tampak memanjang dan bipolar
Population doubling level (PDL) PDL =
3.32 (log Xe –log Xb) + S
Xb : jumlah sel pada awal inkubasi
Xe : jumlah sel pada akhir inkubasi
S : kepadatan populasi awal
Cell doubling time(DT)
DT = T Ln2(ln Xe/Xb)
Xb : jumlah sel pada awal inkubasi
Xe : jumlah sel pada akhir inkubasi
T : waktu inkubasi
Tabel Rekam data kultur primer
Tanggal: ……………….. Waktu:………… Pelaksana: …………….
Data spesimen Rincian data Keterangan

Asal Jaringan Spesies, umur, jenis kelamin, kode spesimen

Tipe jaringan, bagian jaringan, segar/stok

Patologi

Bahan untuk disosiasi Jenis enzim, konsentrasi, lama inkubasi

Pengenceran

Jumlah sel Konsentrasi setelah resuspensi (Ci), Volume (Vi)

Hasil (Y)= Ci x Vi, hasil per g jaringan (berat basah)

Penanaman sel Jumlah sel (N) dan tipe cawan kultur

Konsentrasi akhir, (Cf) dan volume per cawan (Vf)

Medium Tipe, No. batch, tipe dan konsentrasi serum, No. Batch

Bahan aditif lain, konsentrasi CO2

Matriks pelapis Fibronectin, metrigel, collagen dan sebagainya

Subkultur Hasil panen pada sub-kultur-1; jumlah sel/cawan kultur

% (sel hasil panen:sel yang ditanam); arah cell line

Contoh prosedur kultur primer
PREPARASI KULTUR SEL PRIMER DARI EMBRIO AYAM
BAHAN
-Telur ayam berembrio umur 10 hari
-Telur bebek berembrio umur 13 hari
-Tripsin 0,1%
-Medium pertumbuhan, 5% fetal bovine serum dalam medium Melnick A

PROSEDUR KERJA
1. Telur ayam dipilih yang berembrio kemudian telur ayam dicuci dengan
detergen dalam air hangat.
2. Cangkang didesinfeksi dengan etanol, membrane ekstra embrional dibuka
dan diambil embrionya
3. Embrio ditempatkan pada cawan petri. Kepala dan ujung ekor dipotong bila
perlu seluruh membra (kaki dan sayap) dipotong
4. Embrio yang dipotong kepalanya disatukan untuk tripsinasi. Botol 250ml
cukup untuk kira-kira 10 embrio ayam. Embrio dicacah halus kemudian
dikumpulkan dalam suatu beaker glass sebagai ganti botol
Prosedur kerja (lanjutan)
5. Embrio dicuci beberapa kali dengan merendam dalam larutan tripsin.
6. Jaringan direndam dalam botol tripsinasi dengan larutan tripsin (75-100 ml
per botol 250ml).
7. Jaringan diaduk perlahan-lahan selama 10-15 menit pada temperatur kamar.
8. Cairan supernatan yang berisi sel dituang dan disaring dengan 8 lapis kertas
saring halus dan steril ke dalam botol sentrifuga berbentuk kerucut 125 ml.
Kertas saring dicuci dengan menambahkan 25 ml medium pertumbuhan
pada permukaan dan biarkan cairan tersaring dalam botol sentrifuga.
9. Sentrifugasi panenan tersaring pada 65xg selama 10 menit. Cairan
supernatan diambil dan dibuang. Sel-sel terendapkan diresuspensi dalam 50
ml medium pertumbuhan.
10. Tahap tripsinasi diulang, biasanya 3-4 kali untuk jaringan embrio ayam
Prosedur kerja (lanjutan)
11. Panenan dijadikan satu dengan menyaring lewat 8 lapis kertas saring
halus dan steril ke dalam botol sentrifuga berbentuk kerucut perlahan-
lahan. Kertas saring dicuci dengan medium pertumbuhan sebelumnya

12. Suspensi sel disentrifugasi pada 65 x g selama 10 menit

13. Jumlah sel dihitung
14. Cairan supernatan diambil. Sel-sel yang mengendap diresuspensi
dalam medium pertumbuhan sebagai berikut: bebek 1:200; ayam 1:400
15. Suspensi sel diinkubasi pada 37oC
16. Monolayer akan konfluens pada 1-2 hari
Kepadatan awal kultur
 Kepadatan suspensi sel= 2x108/mL

 Kepadatan awal platting = 1x106/mL

 Tentukan formulasi medium yang akan anda gunakan untuk kultur
dengan volume akhir 1 mL dan 2 mL

 Gunakan rumus V1.N1 = V2.N2 untuk menentukan volume suspensi yang akan di
tanam
Hasil kultur primer synovial MCS dari manusia

Synovial MS yang ditanam dengan

kepadatan rendah (103) memiliki
kemampuan proliferasi lebih tinggi

Synovial MSC yang dikultur dengan

kepadatan awal rendah (103)
memiliki potensial kondrogenik
yang lebih tinggi

Sumber: Nakamura et al. (2018)

 Ringkasan prosedur kultur sel primer
Embrio burung Amnion manusia Ginjal kera Ginjal hamster

Umur hewan Ayam 10 hari Cukup umur 1,5-2 thn 4 minggu

Bebek 13 hari
Asal jaringan Embrio utuh Plasenta/amnion ginjal ginjal
Jaringan yang diambil Kepala dan ujung ekor Plasenta dan area Kapsula Jaringan ikat
korda
Metode disosiasi Pemanenan multipel Pemanenan multipel Pemanenan multipel tripsinasi
Agensia disosiasi Tripsin 0,1% Tripsin 0,2% Tipsin 0,2% Tripsin 0,2%
Vesene0,02% Versene 0,02%
Temperatur disosiasi Temperatur ruang 37oC Temperatur ruang 4oC

Metode penghitungan CPV Manual Manual Manual & CPV

Medium pertmbuhan/fetal Melnick A/5% Melnick A/15% Melnick A/5% Eagle 15%
bovine serum %
Kepadatan atau konsentrasi Ayam 1:400 600.000 300.000/ml 600.000/ml atau
sel disemai Bebek 1:200 1.000.000/ml 1:300

Perubahan medium selama 0 2 1 1

pertumbuhan
Jumlah hari untuk 1-2 5-10 5-6 5-6
mencapai monolayer
 Materi kuliah minggu depan
 Evaluasi hasil kultur