MAKALAH KULTUR DAN REKAYASA SEL HEWAN

“KULTUR SEL PRIMER”

OLEH :

NAMA : ASTRIANA

STAMBUK : F1D5 16 010

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2020
 BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Sebelum tahun 1960, media kultur yang berasal dari alam atau natural

masih banyak digunakan, seperti cairan amniotik, ekstrak embrio dan cairan yag

berasal dari berbagai jaringan tubuh. Seiring dengan banyaknya kesulitan dalam

standarisasi, akhirnya media tersebut banyak ditinggalkan dan yang masih banyak

digunakan hingga saat ini yaitu serum, tryptose phosphate broth dan laktalbumin

hidroksilat yang diperoleh dari hidrolisis enzimatis protein susu, akan tetapi

kebanyakan digunakan dalam campuran bersama media kultur (defined media)

untuk meningkatkan sifat-sifat pertumbuhan.

Pembuatan media kultur untuk pertumbuhan sel harus diusahakan agar

dapat memenuhi kriteria. Konstituen dasar dari media kultur yang paling banyak

digunakan adalah BSS (Balanced Sald Solution) yang disusun dari garam

anorganik, natrium bikarbonat dan suplemen glukosa. Pembuatan media kultur

yang kompleks, misalnya pembuatan medium Eagle MEM (Minimum Esential

Medium) diperlukan penambahan bahan-bahan seperti asam amino, vitamin, dan

mineral.

Media kultur buatan yang digunakan untuk menumbuhkan sel di luar

tubuh organisme dibuat semirip mungkin dengan cairan biologis pada saat sel

yang berada dalam tubuh organisme Kultur sel dapat berupa kultur sel primer
 maupun cell line yang dibuat secara khusus dalam kondisi steril dan ditumbuhkan

secara In Vitro (diluar tubuh organisme). Kultur sel tentunya memiliki teknik dan

metode atau cara khusus untuk menumbuhkan suatu sel hewan hingga dapat

digunakan untuk keperluan kesehatan dan lainnya.

B. Rumusan Masalah

Rumusan masalah pada makalah ini adalah sebagai berikut:

1. Apa yang dimaksud dengan kultur sel Primer?

2. Apa saja fase pertumbuhan sel dalam media kultur dan kelemahan kultur sel

primer?

3. Jelaskan ciri-ciri kerusakan kultur sel primer?

4. Jelaskan metode kultur sel primer secara umum?

5. Berikan satu contoh langkah-langkah atau tahapan kultur sel primer pada

hewan?

C. Tujuan Makalah

Tujuan pada makalah ini adalah sebagai berikut:

1. Untuk mengetahu tentang pengertian kultur sel Primer.

2. Untuk mengetahu tentang fase pertumbuhan sel dalam media kultur dan

kelemahan kultur sel primer.

3. Untuk mengetahui tentang cirri-ciri kerusakan kultur sel primer.

4. Untuk mengetahui tentang metode kultur sel primer secara umum.

5. Untuk mengetahui tentang langkah-langkah atau tahapan kultur sel primer

pada hewan.
 BAB II
PEMBAHASAN

A. Defenisi Kultur Sel

Kultur sel merupakan suatu proses saat sel hidup ditempatkan ke dalam

suatu media yang dapat membuat sel tersebut berkembang biak atau tumbuh

secara in vitro (Ma’at, 2011). Media kultur buatan yang digunakan untuk

menumbuhkan sel di luar tubuh organisme dibuat semirip mungkin dengan cairan

biologis pada saat sel berada dalam tubuh organism. Keterbatasan teknik kultur

sel antara lain dalam pembuatan kultur sel memerlukan keahlian dan keterampilan

khusus yang menjamin bahwa seluruh mata rantai prosedur pembuatannya

terkontrol secara aseptis (Freshney, 2005).

B. Pengertian Kultur Sel Primer

Kultur sel dapat berupa kultur sel primer maupun cell line. Kultur sel

primer merupakan kultur yang dimulai dari sel, jaringan, organ yang diperoleh

langsung dari organisme asalnya, sedangkan cell line ialah kultur yang diperoleh

dari subkultur pertama dari kultur primer. Kultur jaringan atau kultur sel primer

dapat diperoleh dengan cara menumbuhkan sel dari potongan jaringan atau

fragmen jaringan disebut eksplan primer atau menggunakan enzim maupun

diperoleh secara mekanik. Kultur sel primer mempunyai sifat dapat bertahan

hidup setelah dilakukan disagregasi, mempunyai sifat adhesive yaitu mampu

 melekat pada subtrat. Beberapa segi fungsi khusus sel dapat diekspresikan lebih

kuat dan jelas pada kultur sel primer, terutama setelah kultur itu menjadi

konfluen. Pada fase ini kultur sel akan menunjukkan morfologi yang hampir

serupa dengan jaringan asalnya (Trenggono, 2009).

C. Fase Pertumbuhan Sel dalam Sistem Kultur

Menurut Budiono (2002), pertumbuhan sel dalam sistem kultur terdiri dari

tiga fase yaitu Lag Phase, Log Phase dan Plateu Phase sebagai berikut:

1. Pada Lag Phase konsentrasi sel adalah sama atau hampir sama dengan

konsentrasi pada waktu subkultur. Fase ini juga disebut dengan fase adaptasi

atau fase lambat, yaitu fase sel yang meliputi pelekatan pada substrat dan

penyebaran sel.

2. Log Phase merupakan fase terjadinya peningkatan jumlah sel secara

eksponensial dan saat pertumbuhan mencapai konfluen, poliferasi akan

terhenti setelah 1 atau 2 siklus berikutnya. Fraksi pertumbuhan pada fase ini

mencapai 90-100%.

3. Plateu Phase merupakan fase terjadinya penurunan dan berkurangnya

kemampuan sel untuk tumbuh apabila sel telah mencapai konfluen. Pada fase

ini fraksi pertumbuhan akan mencapai 0-10%.

D. Kelemahan Kultur Sel Primer

Keterbatasan teknik kultur sel antara lain dalam pembuatan kultur sel

memerlukan keahlian dan keterampilan khusus yang menjamin bahwa seluruh

mata rantai prosedur pembuatannya terkontrol secara aseptis (Freshney, 2005).

Kultur sel primer memiliki beberapa kelemahan di antaranya kebutuhan hewan

percobaan sebagai bahan baku kultur yang besar dan kemungkinan besar adanya

kontaminasi virus atau mikroba yang dapat menginfeksi hewan percobaan yang

akan digunakan sebagai stok kultur (Ma’at, 2011).

E. Kerusakan Sel Kultur Primer

Kerusakan sel merupakan perubahan atau gangguan yang dapat

mengurangi viabilitas atau fungsi essensial sel. Stress oksidatif dapat

menyebabkan kematian sel secara apoptosis dan nekrosis. Apoptosisi adalah

proses kematian sel secara terprogram berupa proses autodestruksi seluler aktif

yang ditandai dengan penyusutan sel, kerusakan membrane dan fragmentasi DNA

inti sel. Nekrosis merupakan kematian sel secara tiba-tiba akibat kerusakan berat

yang ditandai kerusakan struktur seluler secara menyeluruh diikuti dengan

lisisnya sel dan inflamasi jaringan (Moodie, (2004).

1. Viabilitas Sel Kultur Primer

Pertumbuhan sel dalam kultur dapat dilihat dari viabilitas sel, konfluen

sel dan normal tidaknya sel. Viabilitas sel yaitu jumlah sel-sel sehat dalam

sampel, apakah sel-sel secara aktif membelah. Pengujian viabilitas sel berguna
 ketika sel tidak membelah (seperti sel primer) yang terisolasi dan dipelihara

dalam kultur untuk menentukan kondisi kultur optimal untuk populasi sel.

Viabilitas sel merupakan perbandingan jumlah sel yang hidup dan sel

yang mati. viabilitas sel ditentukan dari kemampuan sel untuk hidup dan

menjalankan metabolismenya dimana ini merupakan faktor yang

mempengaruhi keberhasilan kultur sel. Metode yang paling mudah untuk

menentukan jumlah sel hidup adalah perhitungan sel dengan menggunakan

hemositometer dan menggunakan pewarna tripan biru 0,4% karena tripan biru

tidak mengubah integritas membrane plasma dan memperlambat proses

kematian sel. Tripan biru juga memperkecil jumlah sel dan memfasilitasi

identifikasi sel yang akan dilihat dengan mikroskop.

2. Abnormalitas Sel Kultur Primer

Abnormalitas sel biasanya ditandai dengan adanya nekrosis dengan

ciri-ciri yaitu kromatin menggumpal, pembengkakan organel, kerusakan

membrane sel, keluarnya isi sel. Proses nekrosisi sel dapat muncul sebagai

respon terhadap rangsangan spesifik misalnya stress oksidatif. Stres oksidatif

adalah suatu gangguan keseimbangan antara oksidan dan antioksidan yang

menyebabkan rusaknya sel potensial.

Sel dikatakan abnormal jika sel tersebut melebihi ukuran sel normal

dan mengalami perubahan bentuk dari asalnya, terkontaminasi oleh bakteri

dan jamur. Abnormalitas sel yang sering muncul pada kultur sel ditandai
 dengan adanya sel raksasa (sel giant) yaitu sel yang volume selnya, DNA,

RNA serta massa protein bertambah hingga 20-200 kali lipat dari sel normal.

F. Metode Kultur Sel

Metode dalam kultur sel terdiri atas kultur monolayer dan kultur suspensi.

Metode kultur monolayer digunakan jika sel yang akan dikultur merupakan sel

yang melekat, sedangkan metode kultur suspensi digunakan untuk sel yang tidak

melekat (Ma’at, 2011). Prinsip umum maupun metode yang digunakan dalam

kultur sel invertebrata, relatif sama dengan prinsip maupun metode kultur yang

digunakan dalam kultur sel vertebrata.

Pembuatan media kultur untuk pertumbuhan sel diusahakan memenuhi

kriteria. Konstituen dasar dari media kultur yang paling banyak digunakan adalah

BSS (Balanced Sald Solution) yang disusun dari garam anorganik, natrium

bikarbonat dan suplemen glukosa. Beberapa jenis media yang digunakan dalam

kultur sel yaitu Minimum Essential Media (MEM), Basal Medium Eagle (BME),

McCoy’s 5A Medium, Medium 119 dan Media Roswell Park Memorial Institute

(RPIM) 1640.

G. Langkah-langkah atau Tahapan Kultur Sel Primer Baby Hamster Kidney

(BHK)

Contoh metode kultur sel ginjal oleh Andiana, dkk., (2017) menggunakan

media Dulbecco’s Modified Medium (DMEM). Media Dulbecco’s modified

Eagle’s medium (DMEM) meruapakan media yang mengandung vitamin dan

asam amino 4 kali lebih besar dan mengandung 2-4 kali lebih banyak glukosa dan

terdapat tambahan unsur besi dan phenol red. Media Dulbecco’s modified Eagle’s

medium (DMEM) memiliki konsentrasi asam amino 2 kali lebih tinggi dari media

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) sebagai berikut:

 Preparasi Kultur Primer Baby Hamster Kidney (BHK)

Pertama hamster di anesthesi kemudian vena jugularisnya dipotong dan

dikeluarkan darahnya, lalu hamster disayat dan diambil ginjalnya. Kemudian

ginjalnya ditempatkan pada cawan petri yang mengandung Hank’s BSS fascia

dan jaringan ikat dibuang kemudian dipotong menjadi 4 bagian dan

ditempatkan di gelas kecil dan dicuci beberapa kali dengan Hank’s BSS dan

dicincang.

Kemudian cincangan ginjal dimasukan ke labu tripsinizing dan dibilas

dengan Hank’s BSS da ditambah tripsin, kemudian ditempatkan di magnetic

stirer lalu dibuang supernatannya, disaring kedalam tabung centrifuge dan

ditambahkan media pertumbuhan, lalu disentrifugasi dibuang supernatannya

lalu dicuci dengan Hank’s BSS dan kembali disentrifugasi. Resuspen sel

dimedia pertumbuhan dan diencerkan dengan kristal violet kemudian dihitung

sel hidup dan ditempatkan kedalam wadah inkubasi, diinkubasi dan diperiksa

keadaan selnya.
 Preparasi Suspensi Kultur BHK

Media dari tiap botol kultur dituang kemudian dicuci dengan PBS 2 sampai

3x lalu ditambahkan tripsin dan diinkubasi. Kemudian tripsin dibuang dari

botol kultur dan ditambah media yang baru lalu dikocok dan diamati.

 Revival

Sel yang disimpan pada suhu -80◦c dicairkan dengan cara di inkubasi pada

suhu 37◦c, setelah mencair sel di sentrifuge selama 10 menit kemudian

supernatan dibuang dan sel ditambahkan dengan media DMEM (Dulbecco’s

modified Eagle’s medium) + FBS (Fetal Bouvine Serum) dan di masukan ke

dalam botol kultur ( total sel + media kultur adalah 8-10 ml). Sel + media

disimpan pada suhu 37◦c dan dilakukan pengamatan setiap harinya.

 Split Sel (Memperbanyak Sel)

Sel di ambil dari inkubator suhu 37◦c kemudian dilakukan split dengan cara :

media dibuang kemudian dicuci dengan PBS 2-3 kali, setelah itu botol diberi

firsen tripsin dan dikocok pelan. Kemudian seluruh cairan dari botol kultur di

sedot dengan menggunakan pipet dan di bagi kedalam 2 botol kultur . Lalu

masing-masing botol kultur di beri media dan di pelihara pada suhu 37◦c.

Media diganti setiap 2-3 hari sekali.

 Stor Sel

Prepare media Stor. Pelarut DMSO + FBS di dinginkan dikulkas, setelah

dingin media dibuang kemudian dicuci dengan PBS, lalu di tambah firsen
 tripsin dan dikocok pelan. Kemudian botol ditambah media dan disentrifuge.

Supernatan dibuang lalu endapan diberi media kemudian dimasukan ke vial-

vial dan di dinginkan, setelah 24 jam dipindahkan ke suhu -80◦c.

 Hitung Sel

Sel didalam botol kultur diambil dari suhu -20◦C kemudian di hangatkan pada

suhu 37◦C, setelah sel mencair sel di ambil dengan menggunakan pipet tetes

lalu di teteskan pada objek glass lalu ditetesi dengan pewarna untuk

memudahkan perhitungan sel, kemudian sel + pewarna di teteskan pada

Counting chamber dan dilakukan perhitungan dibawah mikroskop.

 III. PENUTUP

A. Simpulan

Berdasarkan isi makalah diatas maka dapat disimpulkan sebagai berikut:

1. Kultur sel primer merupakan kultur yang dimulai dari sel, jaringan, organ

yang diperoleh langsung dari organisme asalnya.

2. Fase pertumbuhan sel primer dalam media terdiri dari tiga yaitu Lag phase,

Log phase dan Plateu phase.

3. Kerusakan kultur sel primer yaitu nekrosis dengan ciri-ciri kromatin

menggumpal, pembengkakan organel, kerusakan membrane sel, keluarnya isi

sel, sedangkan apoptosis ditandai dengan penyusutan sel, kerusakan

membrane dan fragmentasi DNA inti sel.

4. Metode kultur sel ada dua yaitu kultur monolayer digunakan jika sel yang

akan dikultur merupakan sel yang melekat, sedangkan metode kultur suspensi

digunakan untuk sel yang tidak melekat.

5. Contoh langkah-langkah kultur sel primer Baby Hamster Kidney (BHK)

dengan media Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) terdiri dari

preparasi Kultur Primer BHK, Preparasi Suspensi Kultur BHK, revival, split

sel (memperbanyak sel), Stor sel dan hitungan sel.

B. Saran

Saran yang dapat diajukan penulis yaitu makalah ini masih memiliki

banyak kekurangan sehingga dibutuhkan kritikan dan masukan dari pembaca.

 REVERENSI

Andiana, M., Rachmawati, Y dan Andayani, S.S., 2017, Kultur Sel Baby Hamster
Kidney (BHK) menggunakan Media Dulbeccos’s Modified Medium (DMEM),
Biotropic The Journal of Tropical Biology, 1(1): 1-8