UAS Biosains & Bioteknologi

Dosen : Prof. Dr.dr.Loeki Enggar Fitri, M.Kes, Sp.ParK

Nama : Rokhmatul Asiyah
NIM : 206070100011005
Program Studi / KLS : S2 Biomedik / Reguler
1. Sebutkan perbedaan antara cell culture, explant culture, tissue culture, dan
organoid culture serta berikan contoh masing masing

Kultur sel merupakan perpindahan sel dari manusia, hewan, atau tanaman ke
dalam medium terkontrol yang sesuai untuk menumbuhkan sel tersebut. Kultur sel dapat
berupa kultur sel primer maupun cell line. Kultur sel primer merupakan kultur yang
dimulai dari sel, jaringan, organ yang diperoleh langsung dari organisme asalnya,
sedangkan cell line ialah kultur yang diperoleh dari subkultur pertama dari kultur primer.
Kultur primer mempunyai kesamaan kromosom dan sifat biokimia seperti aslinya, walau
dengan waktu hidup pendek dan ketahanan yang lebih renta. Cell line mudah untuk
ditumbuhkan dan dimanipulasi, serta kondisi yang homogeny. Namun cell line
mempunyai ploidi yang kadang berbeda dengan sumbernya uga sifat biokimianya. Teknik
kultur secara enzimatik(tripsin, kolagenasi, pronase),mekanik, maupun cara kimia. Dalam
kultur harus diperhatikan medium dari PH, buffer, osmolaritas, dan liquiditas. Nutrisi dan
growth factor, kadar gas, dan container yang digunakan harus diperhatikan untuk tiap
jenis selnya. kultur sel dapat diaplikasikan pada proses stem sel, teknologi IVF (In Vitro
Fertilization), mengetahui biologi sel kanker, produksi antibodi monoklonal, produksi
protein rekombinan, terapi gen, pembuatan vaksin, seleksi dan pengembangan obat baru.
Salah satu keuntungan utama dari kultur sel adalah dapat dilakukan manipulasi
fisikokimia (seperti suhu, pH, tekanan osmotik, kadar udara) dan manipulasi lingkungan
fisiologis (seperti hormon dan konsentrasi nutrien). Selain itu dapat dilakukan studi
dengan kondisi sel yang homogeny. Keterbatasan
Kultur Sel, mudahnya kontaminasi dari
mikroorganisme, dan ketidakstabilan genotip dan
fenotip dari sel (Khumairoh dan Puspitasari, 2016).
Lingkungan in vitro yang homogen bisa menjadi
kekurangan dengan hasil yang kadang berbeda dengan
in vivo. Terdapat transwell cell culture, dimana 1
tabung yang dibuat bertingkat dengan 2 sel yang
berbedan untuk pendekatan kondisi in vivo. Contoh penelitiannya monosit diaktifkan
menjadi makrofag M2 dan dikultur bersama dengan sel kanker MCF-7. Hasilnya hibrida
MCF-7/makrofag dihasilkan secara spontan dengan laju rata-rata 2% dan menunjukkan
fenotipik juga sifat genetik dari kedua sel induk (Shabo, et al 2015)
Kultur eksplan adalah teknik untuk membiakkan sel dari sepotong atau potongan
jaringan dari tumbuhan atau hewan. Istilah eksplan karena sampel diperoleh dari bagian
mana pun dari organisme. kultur biasanya dapat digunakan selama dua hingga tiga
minggu. Aplikasi yang luas termasuk memperoleh sel punca yang dapat digunakan
sebagai terapeutik, penelitian kanker, rekayasa genetika, produksi vaksin, skrining obat
dan pengujian toksikologi. Peran gen tertentu, ekspresi gen, dan mekanisme aksi
semuanya dapat dipelajari dengan kultur eksplan juga. Juga dapat mengamati faktor yang
berkontribusi terhadap pertumbuhan dapat diidentifikasi selama embriogenesis. Berikut
contoh penelitian eksplan kultur, dimana cardiac stem cells (CSC) berhasil diisolasi dari
sampel miokard yang dikultur dipertahankan tidak terdiferensiasi atau terdiferensiasi
(Torella, et al, 2007).
 Eksplan dapat diperoleh melalui pembedahan menggunakan peralatan steril.
Jaringan dipotong diletakkan cawan petri dengan medium tanpa serum. Diptong sekitar
1x1 mm, kumpulkan potongan dicuci dalam tabung sentrifus dan biarkan potongan
mengendap , bisa diulang 2 atau 3 kali. Budidaya Eksplan dengan ditempatkan secara
aseptik pada permukaan yang dilapisi media kultur , media minimal basal, Dulbecco's
Modified Eagle Medium (DMEM) atau Minimum Essential Medium Eagle (MEM) yang
dilengkapi dengan 10-15% serum. dalam kondisi kultur jaringan standar (pH 7,2-7,4,
suhu 37°C, 5% CO2 dan kelembaban untuk memungkinkan migrasi dan proliferasi sel.
Mengganti media setiap 3 hari juga tergantung usia jaringan, sel baru tumbuh dari
eksplan dalam waktu 15-30 hari. Setelah pertumbuhan sel dimulai , tambahkan 5 mL
medium ke dalam labu pada hari-hari berikutnya. Subkultur Sel line dilakukan setelah
eksplan benar-benar dikelilingi oleh sel, menggunakan konsentrasi tripsin yang lebih
rendah (misalnya <0,25% tripsin selama 5 menit). Dengan ukuran labu yang sesuai untuk
penyemaian, tergantung pada jumlah sel yang diperoleh.Pertumbuhan efektif dari donor
yang sehat dan lebih muda. Karena sel yang lebih muda membelah dan tumbuh lebih
cepat, juga mempertahankan pertumbuhan karakteristiknya secara in vitro, sehingga
peluang untuk mendapatkan sel-sel dengan cepat dari eksplan sangat tinggi. Kontaminasi
eksplan dapat dihindari dengan mencelupkan potongan jaringan ke dalam larutan
povidone-iodine selama 2 sampai 3 menit. Kelebihan diantarnya dapat membuat berbagai
cell line dari sumber yang berbeda, lebih mirip dengan situasi sel in vivo,Jaringan eksplan
mempertahankan sitokin dan faktor pertumbuhannya sendiri , proliferasi yang terjadi
tidak terlalu menimbulkan stres secara biologis. Kelemahannya, tidak ada waktu yang
cukup untuk mempelajari penyakit kronis. tidak untuk eksperimen yang membutuhkan
pengamatan jangka panjang.

Tissue culture merupakan jaringan dengan struktur 3 dimensi yang masih intak
dan tidak terurai yang dihidupkan dalam media. Contoh penelitiannya yaitu untuk
menghasilkan sperma dari sel germ-line stem (GS) secara in vitro, dikembangkan metode
disebut 'transplantasi in vitro' (IVT). Sel GS disuntikkan ke dalam tubulus seminiferus
dari testis inang yang diangkat, diikuti dengan inkubasi fragmen jaringan di bawah
kondisi kultur. Dalam perkembangannya, sel GS membentuk koloni di tubulus
seminiferous eksplan dan berdiferensiasi menjadi spermatid dan sperma in vitro. Sperma
kompeten secara fungsional, sehingga menghasilkan keturunan yang sehat melalui
inseminasi mikro. Metode IVT memiliki beberapa keunggulan dibandingkan metode
transplantasi in vivo biasa. Dimana dimungkinkan untuk mengamati sel-sel yang
ditransplantasikan kronologis setiap hari atau setiap minggu. Sehingga IVT berguna
untuk mempelajari perilaku spermatogonial stem cells (SSC) secara rinci, seperti
perkembangan proses spermatogenik, IVT bermanfaat untuk menghindari penolakan
imunologis atau efek lainnyabila
dilakukan secara in vivo. Protokol
mudah dilakukan, meskipun
memerlukan latihan untuk
menguasai injeksi SSC ke dalam
tubulus seminiferus dari testis yang
diekstraksi dari tikus (Sato, et al
2013). Selain itu aplikasi terapeutik
seperti kultur jaringan kulit, dimana
kulit pasien dalam kondisi sehat
dipindahkan ke area kulit yang
hilang atau terbakar. Sehingga akan
memicu pertumbuhan kulit baru
dengan adanya factor pertumbuhan
dan Vascular endothelial growth
factor (VEGF).

Kultur organoid adalah versi miniatur dari organ yang diproduksi secara in vitro
yang menunjukkan mikro-anatomi realistis, mampu memperbarui diri dan mengatur diri
sendiri, dan menunjukkan fungsi yang sama seperti jaringan asal. Organoid dari kultur
primer dapat ditanam sebagai lapisan tunggal dalam labu kultur jaringan. Kemudian
berkembang menjadi bentuk 3D seperti bentukan berongga. Organoid dapat dihasilkan
dari adult tissue-derived stem cells (ASCs), embryonic (ESCs) dan induced pluripotent
stem cells (iPSCs). Para peneliti telah menemukan metode untuk menghasilkan model
organoid yang relevan secara fisiologis untuk banyak organ, termasuk usus, paru-paru,
otak, hati, paru-paru, pankreas, dan jantung. Organoid relatif mudah tumbuh dan
menghasilkan gambaran fungsional yang dapat diamati menggunakan teknik molekuler,
seluler, dan pencitraan. Contoh penitian kultur organoid yaitu organoid epitel usus yang
dapat dihasilkan dari kriptus yang diisolasi Lgr5+ stem selnya. Juga organoid mesenkimal
epitel usus dari pluripotent stem sel ditambah kriptus usus. Sehingga terbukti kriptus
mempunyai fungsi majemuk dalam memproduksi organoid yang berbeda (Chusilp, et al
2020).

Terdapat kekurangan dalam

menggambarkan diferensiasi alami sel
atau dalam memprogram ulang
pertumbuhan sehingga tidak dapat
disamakan dengan kondisi in vivo.
Selain itu kultur yang berasal dari
jaringan akan mengandung campuran
jenis sel, misalnya epitel atau stroma.
Sehingga rawan terkontaminasi oleh
jaringan tetangga. Juga tergantung
pada teknik pengambilan sampel,
misalnya sampel jaringan prostat
dengan reseksi transurethral dapat
mengandung jaringan uretra. Jaringan
tumor juga dapat terkontaminasi oleh
sel normal. Sebuah studi model in vitro
dan in vivo untuk pengobatan presisi
menunjukkan bahwa antara 25-95
persen organoid 'tumor' (di berbagai
jaringan) adalah sel normal. Saat
menggunakan organoid, sangat penting
untuk memastikan tidak adanya semua
potensi kontaminan (Lang, 2021)

2. Jelaskan prinsip dasar dari

seminested-PCR, real time PCR (rt-
PCR), reverse transcription PCR (RT-
PCR) dan multiplex PCR
Polymerase Chain Reaction
(PCR) adalah metode enzimatis
amplifikasi DNA yang dikembangkan
 tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi
segmen DNA dalam jumlah jutaan kali sehingga dapat mendeteksi genom dari
berbagai spesimen karena waktu pengujian yang cepat dengan hasil yang lebih
sensitif dan spesifik. PCR telah merevolusi bidang biosains khususnya di bidang
kedokteran dan genetik molekular. Saat ini RT-PCR pun menjadi gold standard
dalam pandemi COVID-19. Tahap PCR secara umum terdiri dari denaturasi DNA
menjadi rantai tunggal, annealing primer sekuens spesifik dan penyambungan
siklus polymerase 30 – 40 kali. Dimana pada awalnya rantai ganda DNA template
dipisahkan dengan denaturasi termal dan kemudian didinginkan hingga mencapai
suatu suhu tertentu untuk memberi waktu pada primer menempel (anneal primers)
pada daerah tertentu dari target DNA. Polimerase DNA digunakan untuk
memperpanjang primer dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP dan dTTP)
dan buffer yang sesuai. Hasil PCR adalah produk berupa 50-10000 bp bagian
spesifik genome yang dapat dianalisis dengan elektroforesis gel atau sekuensing
DNA.

Nested PCR dikembangkan untuk meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas PCR.

Teknik ini menggunakan dua pasang primer amplifikasi dan dua putaran PCR. Satu
pasangan primer digunakan pada putaran pertama amplifikasi PCR dari 15-30 siklus.
Produk amplifikasi putaran pertama kemudian mengalami amplifikasi putaran kedua
menggunakan set primer kedua. Dalam nested PCR, primer outer untuk amplifikasi
putaran pertama dan primer inner untuk amplifikasi putaran kedua. Dalam PCR semi-
nested, menggunakan primer outside untuk putaran pertama dan satu primer inner dan
primer outer lainnya yang sebelumnya digunakan untuk putaran kedua amplifikasi.
Sensitivitas yang meningkat muncul dari jumlah siklus total dan spesifisitas yang
meningkat muncul dari anealling set primer kedua. Perhatian utama untuk metode ini
adalah kontaminasi yang terjadi selama pemindahan produk putaran pertama ke tabung
kedua untuk amplifikasi putaran kedua. Hal ini dapat dihindari dengan memisahkan
secara fisik campuran amplifikasi putaran pertama dan kedua dengan lapisan lilin atau
minyak.

Real time PCR (rt-PCR)

atau quantative (qPCR) adalah
teknologi untuk amplifikasi
fragmen DNA spesifik. “Real
time” berarti pengumpulan dan
analisis data amplifikasi terjadi
saat reaksi berlangsung yang
dihasilkan dari akumulasi
jumalah penanda flouresens
melalui translasi secara
computerize. Perbandingan amplifikasi antara target dan kontrol dapat diketahui.
Sehingga dapat diketahui hasil positif atau negative dari perbandingan kuantifikasi
kelipatan amplifikasi dengan control, yang digunakan sebagai gold standard pada
pandemi covid-19 ini. Fase awal, fase eksponesial dan fase plateu didapatkan dari analisa
data. Cycle threshold (ct) berarti fase dimana jumlah siklusyang diperlukab agar sinyal
flouresens melebihi ambang batas dari kontrol. Kuantifikasi DNA menjadi sangat populer
dalam penelitian diantaranya kuantifikasi dan genotipe patogen, ekspresi gen, analisis
DNA dan microRNA termetilasi, validasi data microarray, diskriminasi alelik dan
genotipe (deteksi mutasi, analisis polimorfisme nukleotida tunggal, identifikasi perubahan
kromosom), validasi terapi obat, studi forensik, dan kuantifikasi organisme hasil rekayasa
genetika.
 Reverse transcription (RT)-PCR digunakan untuk mengamplifikasi target RNA.
Template RNA diubah menjadi komplementer (c)DNA oleh enzim reverse transcriptase.
cDNA kemudian berfungsi sebagai template untuk amplifikasi eksponensial
menggunakan PCR. Dalam proses ini, cDNA pertama kali diproduksi dari target RNA
dengan reverse transcriptase. Kemudian cDNA diamplifikasi oleh PCR. Reverse
transcriptase membutuhkan primer seperti oligo dT primer atau hexamers acak untuk
sintesis untai DNA awal. Oligo dT primer adalah sekuens poli dT untai tunggal sepanjang
18 basa yang akan mensintesis cDNA dari mRNA dengan ekor poli A. Heksamer atau
dekamer acak adalah oligonukleotida untai tunggal dengan panjang 6 atau 10 basepair.
Primer akan annealing ke situs acak di RNA target untuk sintesis cDNA awal. Primer
dapat menghasilkan cDNA dari semua RNA dalam spesimen, dan langkah terakhir adalah
amplifikasi cDNA dengan PCR.

Multiplex PCR, dua atau lebih set primer yang dirancang untuk amplifikasi target
yang berbeda dimasukkan dalam reaksi PCR yang sama. Lebih dari satu urutan target
dalam spesimen klinis dapat diamplifikasi dalam satu tabung. Sehingga teknik ini dapat
menghemat waktu dan tenaga. Primer yang digunakan dalam reaksi multipleks harus
dipilih dengan hati-hati untuk memiliki suhu anealling yang sama dan tidak boleh
menjadi komplementer satu sama lain. Amplikon yang dihasilkan juga harusnberbeda
ukuran untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan gel
elektroforesis. Multipleks PCR dapat dirancang baik dalam reaksi PCR template tunggal
yang menggunakan beberapa set primer untuk mengamplifikasi daerah tertentu dalam
template, atau reaksi PCR multi-template, yang menggunakan beberapa template dan
beberapa set primer dalam tabung reaksi yang sama. Kelemahannya PCR multipleks lebih
rumit untuk dikembangkan dan seringkali kurang sensitif dibandingkan PCR primer-
tunggal. Keuntungan dari multiplex PCR adalah satu set primer dapat digunakan sebagai
kontrol internal, sehingga kita dapat menghilangkan kemungkinan positif atau negatif
palsu. Selain itu, PCR multipleks dapat menghemat polimerase dan template yang mahal
(Shen, 2019).

Referensi :

Chusilp S, Li B, Lee D, Lee C, Vejchapipat P, Pierro A. Intestinal organoids in infants

and children. Pediatr Surg Int. 2020;36(1):1-10. doi:10.1007/s00383-019-04581-3
Khumairoh, ika ; Puspitasari, Irma M.Kultur Sel Farmaka Vol 14, No 4 (2016):
Suplemen. Publisher: Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran.
https://doi.org/10.24198/jf.v14i2.10810.g5152
Lang, Shona. 2021. What are the pros and cons of using organoids?
https://www.drugtargetreview.com/article/48244/what-are-the-pros-and-cons-of-using-
organoids/
Sato, T., Katagiri, K., Kubota, Y. et al. In vitro sperm production from mouse
spermatogonial stem cell lines using an organ culture method. Nat Protoc 8, 2098–2104
(2013). https://doi.org/10.1038/nprot.2013.138
Shabo, I., Midtbö, K., Andersson, H., Åkerlund, E., Olsson, H., Wegman, P., …
Lindström, A. (2015). Macrophage traits in cancer cells are induced by macrophage-
cancer cell fusion and cannot be explained by cellular interaction. BMC Cancer,
15(1). doi:10.1186/s12885-015-1935-0
Shen, C.-H. (2019). Amplification of Nucleic Acids. Diagnostic Molecular Biology, 215–
247. doi:10.1016/b978-0-12-802823-0.00009-2
Torella D, Ellison GM, Karakikes I, Nadal-Ginard B. Resident cardiac stem cells. Cell
Mol Life Sci. 2007;64(6):661-673. doi:10.1007/s00018-007-6519-y
PPT. Polymerase Chain Reaction DNA/Agarose Gel Electrophores.OLEH Prof.
Dr.dr.Loeki Enggar Fitri, M.Kes, Sp.ParK
PPT. Cell Culuture.OLEH Prof. Dr.dr.Loeki Enggar Fitri, M.Kes, Sp.ParK