STANDAR MIKROBIOLOGI DAN UJI

MIKROBIOLOGI UNTUK BAHAN

DAN PRODUK FARMASI
K B K K I M I A FA R M A S I
M I K R O B I O L O G I FA R M A S I 2 0 1 3

1
 Jenis Uji Mikrobiologi
• Uji langsung
• Teknik kultur
• Metode Enumerasi
• Metode Alternatif
• Metode Cepat

2
 Uji Pengamatan Langsung
• Pengamatan langsung dengan mata
(makroskopik)
• Pengamatan di bawah mikroskop
(mikroskopik)
• Metode pewarnaan
• DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)

3
• Pengamatan langsung dengan mata (makroskopik) :
morfologi mikroorganisme, warna spora, warna dan
bentuk koloni
• Pengamatan di bawah mikroskop (mikroskopik) :
bentuk dan motilitas mikroorganisme, bentuk dan
warna hifa. Ada dua jenis mikroskop : optik dan fase
kontras
• Metode pewarnaan : pewarnaan gram untuk bakteri
• DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique) : Sampel
disaring dengan filter, bakteri diwarnai dengan zat
warna tertentu lalu dilihat di bawah mikroskop
epifluoresens
4
DEFT (Direct Epifluorescent Filter Technique)

• Filter membran polikarbonat

• Zat warna senyawa fluorokromatis yang
berfluoresensi setelah berikatan
• Acridine orange :
Ikatan denan dsDNA : hijau
Ikatan dengan ssRNA : oranye
Ikatan dengan sel hidup : kuning
Ikatan dengan sel mati : hijau terang

5
Teknik Kultur
• Walaupun berbagai metode analisis
cepat dan sensitif telah
dikembangkan untuk identifikasi dan
karakterisasi mikroba patogen,
teknik pembiakan mikroba di dalam
medium mikrobiologi masih
diperlukan terutama untuk
konfirmasi identitas. Media
mikrobiologi yang sering digunakan
umumnya adalah medium padat
atau cair. Medium padat umumnya
mengandung agar.
8
 Kultur pada media agar
• Tujuan Isolasi
• Tujuan Determinasi
• Tujuan Penyimpanan
• Tujuan Pertumbuhan
• Tujuan Produksi
• Tujuan Analisis

9
 Metode Enumerasi
• Plate Count : metode perhitungan
mikroba yang ditumbuhkan di atas
cawan petri
• MPN Count (Most probable Number) :
metode perhitungan relatif berdasarkan
fenomena kekeruhan
• Analisis Fisikokimia : metode
perhitungan mikroba berdasarkan
komponen sel atau metabolit yang
dihasilkan
10
Metode Alternatif
Dye-Reduction
Test

Electrical Methods

ATP
Determination

11
 Dye-reduction Test
• Berdasarkan reaksi redoks dari suatu zat warna (dye)
• Dye akan mengambil elektron dari suatu sistem
biologi yang aktif dan akan menghasilkan perubahan
warna
• Umumnya bentuk teroksidasi akan berwarna dan
bentuk tereduksi tidak berwarna
• Contoh dye yang sering digunakan : metilen blue,
resazurin, trifeniltetrazolium klorida

12
 Methylene blue
Resazurin (blue)
Leuco-methylene blue
Resorufin (pink)
Triphenyltetrazolium
chloride (leuco) Dihydroresofin
(leuco)
Formazan (red)
 Electrical Methods
• Ketika mikroorganisme tumbuh, aktivitasnya
akan menyebabkan perubahan komposisi
medium dan oleh karenanya akan merubah
sifat elektriknya.
• Sifat elektrik yang dapat diukur : konduktansi,
kapasitans, dan impedansi

14
 Conductance
Impedansi :
resistansi
Pertumbuhan
bakteri
----menurunkan
resistensi
Time
----meningkatkan
DT
konduktansi
Detection time
106-107 cells/ml
 Penetapan ATP
• ATP ditemukan dalam aktivitas sel hidup yang
melakukan metabolisme
• Digunakan pada sintesis sel baru, transport
aktif, pergerakan sel dan produksi cahaya
• Diukur melalui aktivitas enzim luciferase dan
substrat luciferin menghasilkan pendaran
cahaya (chemiluminesence)

16
 ATP photometry
Luciferin + luciferase + ATP + O2

Mg2+

Oxyluciferin + luciferase + AMP + light

1 ATP light 1 photon

17
 Metode cepat (Rapid Test)
• Metode Imunokimia
• Metode molekuler

18
 Metode Imunokimia
• Prinsip analisis : berdasarkan reaksi Antigen-
Antibodi
• Komponen sel atau metabolit sel mikroba
bertindak sebagai antigen, direaksikan dengan
pereaksi (suatu Ab yang spesifik) menghasilkan
kompleks Ag-Ab
• Kompleks Ag-Ab divisualisasi dengan berbagai
cara yang dapat diukur (spektrofotometri,
spektofluorometri, dll.)

19
 Prinsip ELISA (Enzyme Linked-
Immunosorbent Assay)

Konjugat
enzim pada
Antigen Ag-Ab
Kompleks Ag-
Ab
Substrat
Antibodi
Reaksi Produk
enzimatik berwarna

20
 Jenis Metode Imunokimia
• EIA / ELISA (Enzyme Immuno Assay)
• RIA (Radio Immuno Assay)
• IFA (Immuno Fluoresence Assay)
• LIA (Luminescence Immuno Assay)

21
 Metode Molekuler
• Cara Hibridisasi
• Cara Amplifikasi

22
 Bahan Farmasi
• Bahan baku
• Air murni (Purified Water)
• Produk Farmasi Steril (Sterile
Pharmaceuticals)
• Produk Farmasi Non-Steril (Non-Sterile
Pharmaceuticals)

23
24
 BAHAN BAKU FARMASI
• Bahan baku untuk produk farmasi dapat
berupa bahan kimia atau bahan yang berasal
dari alam
• Bahan yang berasal dari alam lebih cenderung
terkontaminasi mikroorganisme lebih berat
dibandingkan bahan sintetik kimia

25
 Kategori Bahan Baku Alam (Grigo, 1976)

1. Bahan baku hasil sintesis atau ekstrak bahan alam

yang sudah dimurnikan (rata-rata 10 cfu/g atau mL)
2. Bahan baku hasil sintesis dan dari bahan alam
(rata-rata 102 cfu/g atau mL)
3. Ekstrak tanaman (rata-rata 103 cfu/g atau mL)
4. Produk hewan atau tanaman yang sedikit
mengalami proses (rata-rata 104 cfu/g atau mL)
5. Produk hewan atau tanaman yang tidak mengalami
proses (rata-rata 105 cfu/g atau mL)

26
 Mikroorganisme kontaminan yang sering
dijumpai dalam bahan baku alam
• Bacillus
• Enterobacteriaceae
• Staphylococcus
• Aspergillus
E.coli
• Penicillium
• Mucor
• Rhizopus

Salmonella 27
 AIR
• Air minum (potable water) : tidak boleh ada
Coliform bacilli per 100 ml
• Air untuk injeksi :
– < 0,25 endotoksin unit (EU) per ml.
– Batas mikroba < 10 cfu per 100 ml
– Tidak ada Pseudomonas
• Air untuk sediaan non-steril :
o Kisaran dari >10 sampai < 100 cfu per 100 ml
o Tidak ada Pseudomonas
28
 Produk Farmasi Steril
• Untuk produk parenteral, sediaan obat mata, termasuk
larutan lensa kontak , dan produk-produk yang diberikan
pada luka terbuka atau untuk proses irigasi rongga tubuh.
• Uji sterilitas perlu dilakukan
• Syarat Steril : Sterility Assurance Level dengan
probabilitas sama atau lebih baik dari 10 -6, artinya dalam
satu juta sediaan steril hanya boleh maksimum 1 yang
tidak steril.
• Analisis sterilitas adalah berdasarkan tidak adanya
pertumbuhan mikroba pada media Fluid Thioglycollate
(FTM) dan Soyabean Casein Digest (SCD)pada 30-35°C
(bakteri) dan 20-25°C (fungi) selama 7 dan 14 hari.

29
 Produk Farmasi Non-Steril
• Tidak ada aturan tunggal yang mengatur, tergantung
pada farmakope negara masing-masing
• Tidak mengandung mikroba yang dapat
menyebabkan infeksi akibat penggunaan obat
tersebut (medication-borne infection)
• TVC (Total Viable Count) dalam jumlah tertentu dan
tidak adanya patogen enterik dalam bahan baku nya.

30
 Persyaratan Kualitas Mikrobiologi
Sediaan Farmasi versi FIP (1976)
Gol. Jenis Sediaan Persyaratan

1a Injeksi Steril – Farmakope

1b Obat mata, sed.utk bgn tubuh Bebas mikroba yang memp.daya hidup/g atau
yg bebas mikroba, sed.utk luka mL
bakar, tukak berat

2 Sed. topikal pada lesi kulit, Mikroba yg memp.daya hidup maks 102 /g atau
hidung, tenggorokan (resiko mL, dan tidak mengandung Enterobacteriaceae,
tinggi) P.aeruginosa, S.aureus

3 Sediaan lain Mikroba yg memp.daya hidup maks 103 – 104

bakteri anaerob, 102 ragi dan kapang /g atau mL,
Batas mikroba spesifik : tdk ada E.coli, dan tidak
mengandung Salmonella, P.aeruginosa,
S.aureus,
Enterobacteriaceae lain maks. 102 /g atau mL
31
 Batas kontaminan mikroba pada bahan dan
sediaan obat asal tanaman (versi UNIDO,1990)
Bahan/ Bakteri Ragi dan Baketri Salmonella Staphylococcus
Sediaan kapang coliform

Sediaan < 104 /g < 102 /g - - -

obat asal
tanaman

Bahan < 107 /g < 104 /g - - -

obat asal
tanaman

Ket.: (-) tidak boleh ada

UNIDO (United Nation Industrial Development Organization)
32
 Uji Mikrobiologi yang Tercantum pada
Farmakope Indonesia edisi IV
• Uji secara Mikrobiologi
<51> Uji Batas Mikroba
<61> Uji Efektivitas Pengawet
<71> Uji Sterilitas
• Uji dan Penetapan secara Biologi
<91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12
<121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat
<131> Penetapan Potensi Antibiotik secara
Mikrobiologi
33
 <51> Uji Batas Mikroba
• Dilakukan untuk memperkirakan jumlah mikroba aerob
viabel di dalam semua jenis perbekalan farmasi, mulai
dari bahan baku hingga sediaan jadi
• Untuk menyatakan bahwa perbekalan farmasi tersebut
bebas dari spesies mikroba tertentu
• Pengerjaan harus dilakukan secara aseptik
• Jika tidak dinyatakan lain, “inkubasi” adalah
menempatkan wadah di dalam ruang terkendali secara
termostatik pada suhu antara 30 – 35°C selama 24 – 48
jam
• Istilah “tumbuh” ditujukan untuk pengertian adanya dan
kemungkinan adanya perkembangan mikroba viabel
• Metode yang digunakan adalah pour plate method

34
 <61> Uji Efektivitas Pengawet
• Pengertian Pengawet Antimikroba : zat yang ditambahkan
pada sediaan obat untuk melindungi sediaan terhadap
kontaminasi mikroba.
• Pengawet terutama digunakan pada wadah dosis ganda
• Pengawet tidak boleh digunakan semata-mata untuk
menurunkan jumlah mikroba viabel sebagai pengganti cara
produksi yang tidak baik
• Kadar yang digunakan harus serendah mungkin
• Pengujian dalam farmakope dimaksudkan untuk menguji
efektivitas pengawet yang ditambahkan pada sediaan dosis
ganda yang dibuat dengan dasar atau bahan pembawa cairan
• Pengujian dan persyaratan hanya berlaku pada produk di
dalam wadah asli yang belum dibuka , yang didistribusikan
oleh produsen

35
 <61> Uji Efektivitas Pengawet
• Tujuan : untuk menunjukkan efektivitas
pengawet antimikroba yang ditambahkan
pada sediaan dosis ganda dengan dasar atau
bahan pembawa air yang dicantumkan pada
etiket
• Pengawet tidak boleh sengaja ditambahkan ke
dalam sediaan untuk tujuan menggantikan
cara pembuatan obat yang tidak baik
 <71> Uji Sterilitas

• Digunakan untuk menetapkan apakah bahan atau produk

farmasi yang harus steril memenuhi syarat berkenaan
dengan uji sterilitas seperti yang tertera pada masing-
masing monografi bahan atau produk
• Untuk penggunaan prosedur uji sterilitas sebagai bagian
dari pengawasan mutu di industri, tertera pada <1371>
Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas Bahan Kompendia
• Mengingat kemungkinan hasil positif dapat disebabkan
oleh pengerjaan yang salah atau kontaminasi lingkungan,
diberlakukan pengujian 2 tahap seperti yang tertera pada
bagian :
Penafsiran Hasil Uji Sterilitas

46
• Prosedur alternatif dapat digunakan asal hasil yang
diperoleh sekurang-kurangnya setara keandalannya →
Lihat Prosedur pada Uji dan Penetapan dalam
Ketentuan Umum
• Jika timbul perbedaan, dan adanya kontaminasi terdapat
pada hasil dari prosedur Farmakope, maka hasil harus
dinyatakan sebagai tidak memenuhi syarat.

47
 <91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12

• Dilakukan menggunakan bakteri uji Lactobacillus

leichmanii dengan metode turbidimetri
• Pembanding larutan baku Sianokobalamin BPFI
berkisar antara 0,01 – 0,04 ng per mL. Blanko
menggunakan air.
• Metode spektrofotometri pada panjang gelombang
530 nm.
• Penetapan kadar dihitung melalui kurva baku

48
 <121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat

• Dilakukan menggunakan bakteri uji Lactobacillus

plantarum dengan metode turbidimetri
• Pembanding larutan baku Kalsium pantotenat BPFI
berkisar antara 0,01 – 0,04 µg per mL. Blanko
menggunakan air.
• Metode spektrofotometri pada panjang gelombang
660 nm.
• Penetapan kadar dihitung melalui kurva baku

49
 <131> Penetapan Potensi Antibiotik secara
Mikrobiologi
• Aktivitas (potensi) suatu antibiotik dapat ditunjukkan
pada kondisi sesuai dengan efek daya hambatnya
terhadap mikroba uji
• Perbedaan kadar dan potensi
• Dua metode umum : cara lempeng dan cara tabung
• Cara lempeng : menggunakan kertas cakram atau
selinder baja, efek difusi antibiotik pada medium
agar.
• Cara tabung : turbidimetri, efek larutan antibiotik
terhadap turbiditas mikroba

50
TERIMA KASIH
 Aplikasi Plate Count Agar
• Menguji kualitas • Menentukan
bahan baku dan kontaminasi bakteri
sediaan patogen
• Menguji kondisi
higiene di industri
farmasi
• Mengestimasi waktu
hidup produk
 Most Probable Number
• Aplikasi metode • Biasanya digunakan
statistik dalam untuk uji presumtif
mikrobiologi (pendahuluan),
• Menggunakan teknik contohnya untuk
multitabung reaksi sampel air minum
• Untuk bakteri dalam kemasan
Coliform, E. coli, S.
aureus, dan faecal
streptococci