Identification and Antimicrobial

Susceptibility in
Microbiology Automation
SURAMADE VII, 29 Juli 2017

Aryati

Departemen Patologi Klinik

Fakultas Kedokteran UNAIR
RSUD Dr. Soetomo Surabaya
2
Interpretasi Mikrobiologi
Tergantung dari :

Pasca
Pra Analitik Analitik
Analitik
•Pengambilan Metode • Hasil (review&
•Penyimpanan
•Identifikasi delivery)
•Transportasi • Interpretasi (action
•Identifikasi Spesimen •Antibiotic
taken based on the
sensitivity test
result)
3
Hasil Laboratorium Mikrobiologi

Memberikan Informasi :
 Bakteri/Jamur ?
 Gram Negatif atau Positif
 Aerob atau Anaerob
 Infeksi Tunggal atau Campur
 Antibiotik / Antifungal yang tepat

4
 Manfaat Penting Identifikasi Bakteri dan TKA

1. Menentukan bakteri patogen yang penting secara klinis

2. Membantu klinisi untuk “care of patients”, termasuk kohorting
3. Menentukan MDRO
4. Mapping untuk pola kuman
5. PPI-RS
6. Identifikasi yang tepat akan menentukan tata laksana terapi
antibiotik

5
Keberhasilan identifikasi bakteri tergantung pada :

1. Teknik aseptik
2. Pengambilan spesimen tepat
3. Handling spesimen
4. Transpor spesimen ke laboratorium
5. Spesimen segera dikultur dan diidentifikasi

6
Identification of Bacteria

7
Identifikasi bakteri dapat dilakukan secara :
1. Manual / konvensional
2. Semi-otomatis (API, Crystal, TDR-300B)
3. Otomatis :
• VITEK® 2 Compact
• Phoenix TM 100
• Microscan Walkaway
• VersaTREK® dan Sensititre®
• Alfred60 AST Model → TKA
• FilmArray® Blood Culture Identification Panel, multiplex
PCR System
• CLART® SeptiBac
•MALDITOF- MS
10
Tahapan Identifikasi Bakteri
9

1. Perwarnaan Gram
2. Pertumbuhan dan isolasi bakteri
3. Uji Biokimia
4. Uji Imunologi (serologi)
5. TKA → misal untuk MDRO (suspek E coli
ESBL)
 Kriteria Fenotipik

• Morfologi koloni secara makroskopis (bentuk koloni, elevasi,

batas/margin, permukaan, opasitas, kromogenesis)
• Karakteristik pewarnaan Gram (bakteri Gram + dan Gram ─)
dan morfologi mikroskopis
• Lingkungan yang mendukung untuk pertumbuhan bakteri
• Resistensi atau kepekaan terhadap agen antibiotik (optochin test
membedakan antara S viridans dan S pneumoniae)
• Kemampuan metabolik dan nutrisi yang diperlukan

Mondal, 2014
10
 Pewarnaan Gram (Mikroskopis)

• Gram
11 positif atau Gram negatif
• Dibedakan berdasarkan bentuk dan
kemampuan metaboliknya

11
 Kemampuan metabolik dan nutrisi yang diperlukan

- Banyak digunakan untuk penentuan genus and spesies bakteri

- Tes enzim tunggal: katalase, oksidase, indol, urease, PYR

Tes untuk menentukan kemampuan metabolik

• Fermentasi & oksidasi : oksidasi glukosa memerlukan oksigen,

fermentasi tidak; pH yang turun menyebabkan timbulnya warna
kuning pada media gula-gula
• Degradasi asam amino : deteksi enzim amino acid decarboxylase

Garduque, 2016
12
Mondal, 2014 13
 Resistance or susceptibility to antimicrobial agents

The ability of an organism to

grow in the presence of
certain antimicrobial agent is
widely used to establish
preliminary identification
information.

El Zolawaty, 2016
14
15
16
Metode Semi-otomatis

17
 Koloni dari Blood agar, Mc Conkey

Pengecatan Gram

- Identifikasi awal (tes oksidase, katalase)

- Pembuatan suspensi kuman ½ Mc Farland

Identifikasi dengan ID semiotomatis cards/ kit (API 20E; 20NE; Staph dll)

18
 2. Pengecatan Gram

1. Spesimen yang disubkultur

3. - Identifikasi awal (tes oksidase, katalase)

- Pembuatan suspensi kuman ½ Mc Farland

5. Tabel / Database Result

4. ID dengan API/ Crystal/TDR

19
API (BioMerieux, Inc)

20
API 20 E
• Sistem identifikasi standar untuk
Enterobacteriaceae
• Terdiri dari 20 microtubes berisi dehydrated
substrates yang diinokulasikan dengan suspensi
bakteri

API 20 NE
• Sistem identifikasi standar untuk bakteri non-fastidious, non-enteric batang Gram negatif (e.g.
Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium, Moraxella, Vibrio, Aeromonas,etc.),
• Terdiri dari 8 conventional tests, 12 assimilation tests dan database.
• Database: 32 genera, dan 64 spesies bakteri batang Gram negatif, non-fastidious, non-
Enterobacteriaceae

21
22
BBL crystal (BD)

23
 Miniaturized bacterial identification method employing modified conventional and
chromogenic substrates (30 total).

Setiap kit berisi sumuran reaksi berisi dehydrated substrates yang ditutup setelah
inokulasi

Hasil reaksi dibaca setelah 3 jam untuk RS/E kit dan setelah 18-20 jam untuk E/NF kit

Pembacaan hasil dilakukan secara visual dan pencatatan secara manual. Selanjutnya di
konversi menjadi 10 digit profile number yang di masukkan dalam database

24
Rapid Stool Enteric ID (RS/E kit ) Database : 59
Taxa

Rapid Stool Enteric/non fermenters ID (E/NF kit)

Database : 59 Taxa

25
TDR (Mindray, inc)

26
Mindray, 2013
27
 Hari ke-1

Hari ke-2

28
 TES KEPEKAAN ANTIMIKROBA
Tes kepekaan antimikroba adalah prosedur in vitro yang
digunakan untuk mengetahui profil kepekaan dan resistensi
antibiotika terhadap mikroba tertentu (Bailey and Scott,2007).

Metode:

Difusi (konvensional) : Dilusi (MIC) : Difusi&dilusi

- Metode Stokes - Broth dilution (Gradien)
- Metode (Micro & Macro)
Kirby-Bauer - Agar dilution Metode E-test 41
Metode Otomatis

30
 Kelebihan metode otomatis pada laboratorium mikrobiologi :

TAT lebih cepat, akurasi, presisi, keselamatan

Nilai tambah informasi : auto validation, trending /

resistensi MDRO

Hasil laboratorium lebih cepat berdampak pada pemilihan

terapi lebih awal ke pasien
Rao, 2010
31
Rapid Identification System with AST

32
 BacT/Alert®

Bakteri bermultiplikasi di dalam

k
media, menghasilkan CO2
menyebabkan penurunan pH
media, sehingga menyebabkan
perubahan warna sensor yang
tertempel di dasar botol kultur.
Media selektif dan spesifik
(lyophilized) berada di dalam
sumuran dalam sistem tertutup
suatu curette atau cartridge
plastik. Rao, 2010 33
 VITEK  2 COMPACT: PRINSIP
IDENTIFIKASI: reaksi biokimia + / – / ? (kolorimetri)

pola database

Hasil

TES KEPEKAAN ANTIBIOTIK (TKA)/

ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITY TEST (AST):
Two Fold Microdilution (Broth)

MIC (Turbidimetri)

Sensitif/ Intermediate/ Resisten 34

Phoenix System

35
Pertumbuhan positif pada Subkultur pada BA, MC Pengecatan Gram
inkubator

Pembuatan suspensi kuman ½ Mc Farland untuk ID dan AST

Inokulasi pada cards / panel

Memasukkan panel / cards ke instrumen
36
BD Phoenix TM
The BD Phoenix TM Automated Microbiology System :
identifikasi (ID) bakteri Gram positif dan Gram negatif secara in
vitro

Kemampuan pemeriksaan mulai of 0.20 hingga 4.0 McFarland

Penentuan kepekaan suatu antibiotik secara kuantitatif

berdasarkan nilai minimal inhibitory concentration (MIC).

http://www.bd.com/ds, 2008
37
MicroScan Walkaway plus System

38
 ID/AST : method
• Colorimetry, measures
absorbance of specific
wavelengths of light to
measure either color or
turbidity.
• Fluorometry, measures
fluorescence-scattered and
re-emitted light in random
directions.

Beckman Coulter, 2015 39

Sensititre : Susceptibility & Identification Testing System

Flexible equipment options, combined with standard and

customized plate formats, allows for the ultimate test
program tailored to laboratories unique needs.

71
http://www.trekds.com
 SENSITITRE : Automated SusceptibilityTesting
 Panel kepekaan antibiotik secara mikrodilusi kering
 Menggunakan teknologi fluoresens
 Menggunakan Alamar Blue Technology untuk TKA jamur

• Jika terdapat pertumbuhan bakteri, maka akan memecah ikatan kimia

substrat enzim dengan senyawa fluoresens sehingga tidak dapat
menghasilkan fluoresens

• Bakteri resisten antibiotik : menghasilkan floresens

• Bakteri sensitif antibiotik : gagal tumbuh, tidak menghasilkan fluoresens
72
Alfred60 AST Model

42
Deteksi aktivitas antimikrobial dalam urine dipicu oleh adanya :

• antibiotik
• obat-obat dengan aktivitas antimikrobial
• substansi alami dengan efek antimikrobial
Consequence: false negativeness of the urine culture in presence
of a UTI infection
In the absence of clinical data, the execution of the R.A.A. test in
association with urine culture can be essential for a correct
diagnosis of the urinary tract infections Alfred60 Manual Book, 2011
75
 Molecular Rapid Tests for
Detection and Identification of
Bacteria

77
CLART® SeptiBac

78
 CLART (Clinical Arrays Technology)

CLART GENOMICA
(Multiplex-PCR DNA Amplification + Hybridization)

www.genomica.com, 2015 46
 • Simultaneous • Detection and • Detection and • Detection and
detection and identification of identification identification of 8
genotyping of 19 different 11 different human
35 (20HR 15 respiratory viruses respiratory Herpesviruses 3
LR) HPV types bacteria Enteroviruses VZV,
EBV, CMV

CLART® CLART® PneumoCLART CLART®

HPV2 PneumoVir
bacteria® ENTHERPEX

• Detection and • Detection and • ALL existing mutations

identification of • 21 Main bacteria
identification of 19 in KRAS, BRAF and
8 bacteria, 2 viruses, Gram +, 19 Gram – causing infectious PI3K, NRAS, iKRAS
1 parasite 7 fungi and 4 fungi causing diarrhea. (CRC) also all EGFR
causing STIs in one sepsis. Include MecA mutations (NSCLC)
go resistant 4 Gram+ involve in therapy
response

CLART ® CLART® CLART®

CLART® SeptiBac EnteroBac CMA
STIs A&B
www.genomica.com, 2015
47
 Target Deteksi CLART® SeptiBac
19 Bakteri
Gram +
Streptococcus pyogenes/dysgalactiae
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus agalactiae
Streptococcus mitis
Streptococcus sanguinis/parasanguinis
Milleri group Streptococcus
(S. anginosus, S. constellatus)
Streptococcus spp.
Staphylococcus epidermidis*
Staphylococcus aureus *
Staphylococcus hominis*
Staphylococcus haemolyticus*
Listeria monocytogenes
Enterococcus faecium
Enterococcus faecalis
Clostridium perfringens
*Methicillin resistance
marker mecA
www.genomica.com, 2015
4 Fungi
19 Bakteri Gram -
Candida albicans
Candida krusei
Candida glabrata
Candida spp.
Universal fungal marker
Escherichia coli
Klebsiella (pneumoniae/oxytoca)
Salmonella enterica
Enterobacter (cloacae/aerogenes)
Citrobacter freundii
Serratia (spp./marcescens)
Proteus (vulgaris/mirabilis)
Haemophilus (spp./influenzae)
Acinetobacter baumanii
Bacteroides (spp./fragilis)
Pseudomonas (spp./aeruginosa)
Stenotrophomonas maltophilia
48
 Hasil Pembacaan & Interpretasi
82

CAR Reader membaca target

positif berbentuk spot hitam

serta kontrol dan memberikan

report klinis obyektif

www.genomica.com, 2015
BioFire (FilmArray) Multiplex PCR Assays

50
 FILMARRAY™ (Biomerieux Ltd)
Alat automated in vitro diagnostic (IVD) dengan
kantong reagen spesifik untuk mendeteksi
berbagai target asam nukleat yang terdapat dalam
spesimen

Prinsip : Nested multiplex PCR

www.BioFireDX.com, 2014 51
 The FilmArray Pouch

Reagent
Storage

Chemical
Circuit
Board
Lysis

Purification
Sample First Second stage
Extraction & stage PCR
purification Multiplex
PCR
52
www.BioFireDX.com, 2014
www.BioFireDX.com, 2014 53
 Matrix-assisted laser
desorption/ionization time of flight
mass spectrometry (MALDITOF-MS)
54
 MALDI-TOF principles are simple.
Once the sample slide has been prepared, it is
introduced into a high vacuum environment.

The sample is ionized with a precise laser burst, releasing a

“cloud” of proteins. These proteins are accelerated using an
electric charge, and the time of flight is recorded; lighter
proteins travel faster, heavier proteins travel slower.

55
• WHO mengumumkan 12 superbug (prioritas patogen) yang
bisa menjadi ancaman terbesar dalam kehidupan manusia :

Prioritas 1 : kritis
1. Acinetobacter baumannii, carbapenem-resistant
2. Pseudomonas aeruginosa, carbapenem-resistant
3. Enterobacteriaceae, carbapenem-resistant, ESBL-producing

56
 Prioritas 2 : tinggi

4. Enterococcus faecium, vancomycin-resistant

5. Staphylococcus aureus, methicillin-resistant, vancomycin-
intermediate and resistant
6. Helicobacterpylori, clarithromycin-resistant
7. Campylobacter spp., fluoroquinolone-resistant
8. Salmonella, fluoroquinolone-resistant
9. Neisseria gonorrhoeae, cephalosporin-resistant,
fluoroquinolone-resistan
57
 Prioritas 3 : medium

10. Streptococcus pneumoniae, penicillin-non susceptible

11. Haemophilus influenza, ampicillin-resistant
12. Shigella spp., fluoroquinolone-resistant

58
 KESIMPULAN

1. Identifikasi dan tes kepekaan antibiotik (TKA) merupakan komponen kunci

dalam pelaporan laboratorium klinis yang diperlukan oleh para klinisi.
2. Metode TKA konvensional disk diffusion masih sering digunakan namun
perhatikan berbagai kelemahannya.
3. Uji baku emas yang digunakan untuk TKA adalah broth microdilution
berdasarkan nilai minimal inhibitory concentration (MIC).
4. Sistem otomatisasi memiliki keterbatasan masing-masing, khususnya
dalam pelaporan fenotipe resistensi antibiotika (misal MRSA harus
diperiksa mec a gene nya untuk konfirmasi)

59
 Simpulan (2)
Media
Spesimen Inkubator Identifikasi AST
transport

Darah, Semi-otomatis Manual

urine, pus,
TDR 300B (Mindray)
sputum,
Cairan tubuh API (BioMerieux)
steril dll. BBL-Crystal (BD)
Conventional
Continous monitoring
BHI, Amies/
stuart dll system
TDR (Mindray) Otomatis (ID+ AST)
BacT/Alert (BioMerieux) VITEK2 (BioMerieux)
PHOENIX (BD)
BACTEC (BD)
Sensititer (Dipa)
VersaTrek (Dipa) Microscan (Beckman Coulter)
Pra-Analitik
ALFRED
Analitik 60
Simpulan (3)
Teknik identifikasi molekuler → tidak dapat TKA
•CLART
•Film Array
•Malditof MS

61
THANK YOU

62