Standar dan Aspek Teknis

Laboratorium Mikrobiologi

SRI KARTIKA SARI

Workshop SURAMADENUSRA
MERRUMATA HOTEL, 24 AGUSTUS 2022
 OUTLINE

• Manajemen keselamatan laboratorium dan

spesimen
• Pendekatan diagnosis penyakit infeksi
• Evaluasi aktivitas antibiotik
Laboratory Safety and Specimen Management
Keselamatan Laboratorium

Program keselamatan :
1. penanganan yang tepat dari bahaya biologis yang dihadapi
dalam pemrosesan spesimen pasien dan penanganan
mikroorganisme menular
2. keamanan kebakaran dan listrik
3. penanganan, penyimpanan, dan pembuangan bahan kimia
dan zat radioaktif secara aman
4. teknik untuk mengangkat atau memindahkan benda berat
dengan aman
Institusi dan supervisor diharuskan memberikan
pelatihan keselamatan
untuk membiasakan staf mikrobiologi dengan
bahaya yang diketahui di tempat kerja dan untuk
mencegah paparan.

Keselamatan laboratorium dianggap sebagai bagian

integral dari keseluruhan laboratorium
Staf mikrobiologi harus berpengetahuan, terlatih dengan baik,
dan dilengkapi dengan APD yang tepat dan ada kontrol kerja
saat melakukan tugas di laboratorium.

Investigasi penyebab kecelakaan menunjukkan bahwa paparan

yang tidak perlu terhadap agen infeksi terjadi ketika individu
ceroboh dalam melakukan tugasnya atau ketika mereka
menyimpang dari tindakan pencegahan keselamatan standar.
Komponen biosafety
1. Praktik dan prosedur mikrobiologi yang baik
2. Kompetensi dan pelatihan personel
3. Desain fasilitas
4. Penerimaan dan penyimpanan sampel
5. Dekontaminasi dan pengelolaan limbah
6. Alat pelindung diri
7. Peralatan laboratorium
8. Rencana tanggap darurat / insiden
9. Kesehatan kerja
Praktik dan prosedur mikrobiologi yang baik
Fasilitas bangunan
• Ruangan dinding massif
• Lantai tidak berpori, waterproof (mis. Lantai vinyl)
• Plafon dari materi tidak berpori dan mudah dibersihkan
• Pintu :
• Buka keluar
• Paling tidak satu dapat dikunci
• Dapat ditutup otomatis
• Jendela
• Sangat dianjurkan untuk tempat penerimaan sampel
(passthru)
• Dapat dikunci
• Tidak dapat dibuka dari luar
• Ada wastafel dekat pintu masuk untuk cuci tangan dan
beberapa wastafel tambahan
• Ada bak pencucian (area kerja )
• Akses terkontrol (ruangan dapat dikunci, jendela dapat
dikunci)
• Persediaan APD dan perlengkapan dekontaminasi selalu
tersedia
Engineering control
• Laboratory environment
Power
HVAC
Air
• Biosafety cabinet
General Concepts for Specimen Collection and
Handling
• Appropriate Collection Technique
• Specimen Transport
• Specimen Storage
• Specimen Labeling
• Specimen Requisition
• Rejection of Unacceptable Specimens
• Specimen Processing
PENDEKATAN DIAGNOSIS PENYAKIT INFEKSI
Deteksi
Gejala Klinis Mikrobiologi Penyebab infeksi
~ Bakteri

Pemeriksaan laboratorium
Pengambilan spesimen

Mikroskopis ~ direct stain

CBC, LED/CRP,
Procalsitonin Identifikasi bakteri
Serologi lain HASIL
Kultur
Uji sensitivitas thd
antibiotik
Identifikasi bakteri

• Metode pemeriksaan langsung mikroskopis memberikan

informasi awal tentang bakteri yang terlibat dalam
infeksi, tetapi untuk identifikasi dan karakterisasi
definitive diperlukan pertumbuhan bakteri

• Identifikasi selanjutnya dapat identifikasi fenotip,

identifikasi genotip maupun identifikasi dengan metode
imunologi.
Peran Pemeriksaan Mikroskopis

• Direct and Indirect Smears

• Pewarnaan Gram
• Pewarnaan ZN
• KOH
Kultur

• Tujuan kultivasi bakteri :

• Menumbuhkan dan mengisolasi semua bakteri yang ada
dalam spesimen klinis
• Menentukan apakah bakteri yang tumbuh penyebab infeksi
atau lebih pada kontaminan atau kolonisasi (normal
microbiota)
• Untuk mendapatkan pertumbuhan yang cukup dari bakteri
yang relevan secara klinis untuk memungkinkan identifikasi,
karakterisasi, dan pengujian sensitivitas.
Media pertumbuhan

• bakteri memiliki banyak kebutuhan nutrisi yang

mencakup berbagai gas, air, berbagai ion, nitrogen,
sumber karbon, dan energi.
• sumber karbon dan energi umumnya dipasok dalam
karbohidrat (misalnya, gula dan turunannya) dan
protein
• Phase media : broth, agar
• Klasifikasi media : Enrichment media, Nutritive media,
Selective media, Differential media
Media Pertumbuhan
• Media komersial tersedia
• Pembuatan media
• Ikuti petunjuk package insert manufacture
• Sterilisasi media
• Agar hanya bakteri dari specimen pasien yang tumbuh,
BUKAN KONTAMINAN dari air/powdered media
• Broth media dibagi dalam tabung tabung sebelum masuk
autoklaf.
• Media agar biasanya disterilkan dalam labu besar atau botol
yang ditutup dengan tutup ulir atau sumbat plastik sebelum
dimasukkan ke dalam autoklaf.
Waktu sterilisasi autoklaf harus dimulai dari saat suhu mencapai
121°C dan biasanya membutuhkan minimal 15 menit.
Setelah siklus sterilisasi selesai, agar cair dibiarkan dingin sampai
kira-kira 50 °C sebelum didistribusikan ke masing-masing cawan
petri (kira-kira 20 hingga 25 mL agar cair per cawan).

kontrol kualitas yang ketat sebelum digunakan.

QC Media
• QC Form
• jumlah yang disiapkan, • harus diperiksa untuk warna
• sumber setiap bahan, yang tepat,
• lot nomor, • konsistensi,
• kedalaman,
• metode sterilisasi,
• kehalusan,
• tanggal persiapan, • hemolisis,
• tanggal kedaluwarsa • gelembung berlebihan, dan
(biasanya 1 bulan untuk • kontaminasi
pelat agar-agar dan) 6
bulan untuk media tabung),
dan nama pembuatnya.
• Kontrol Sterilitas :
• 5% dari setiap batch (100 unit/kurang)
• 10 unit bila batch besar
• Uji sterilitas dilakukan dengan menginkubasi media selama 48
jam pada suhu dimana media akan digunakan

• Kontrol mutu lainnya :

• memastikan bakteri yang diharapkan tumbuh akan tumbuh
dan yang tidak diharapkan tumbuh.
• pH
Environmental Requirements

• O2 dan CO2
• Temperature
• pH
• Kelembaban
Kultivasi bakteri
• Isolasi bakteri dari specimen
• Inokulasi pada media (primary plating media) (BA, MCA, CLED)
• Streaking.
Streaking dengan jumlah terukur spesimen, menggunakan loop
yang dikalibrasi untuk mengukur (CFU) dalam kultur urin
(biasanya loop kalibrasi 1 microliter )
jumlah koloni yang teridentifikasi dikalikan dengan faktor
pengenceran untuk menentukan CFU per milimeter dalam
spesimen (10³ untuk loop 1 mikroLiter dan 10² untuk 10
mikroLiter ).
• Inkubasi
Morfologi koloni

• Ukuran koloni (biasanya diukur dalam milimeter atau dijelaskan

dalam istilah relatif seperti pin point, kecil, sedang, besar)
• Pigmentasi koloni
• Bentuk koloni (meliputi bentuk, elevasi, dan margin)
• Penampilan permukaan koloni (misalnya, berkilau, buram, kusam,
kering, transparan)
• Perubahan media agar akibat pertumbuhan bakteri (misalnya, pola
hemolitik pada agar darah, perubahan warna indikator pH)
• Bau (bakteri tertentu menghasilkan bau berbeda yang dapat
membantu dalam identifikasi awal )
Indirect Gram Stain and Subcultures

• Pengecatan Gram pada koloni yang tumbuh , penting

untuk menentukan Langkah selanjutnya.
• Terkadang subkultur dilakukan.
Pentingnya identifikasi bakteri
• Menentukan signifikansi klinis dari patogen tertentu
(misalnya, apakah isolat itu patogen, kontaminan, atau mikrobiota normal?)
• Memandu perawatan dokter pasien melalui metode identifikasi dugaan dan final
• Menentukan apakah pengujian laboratorium untuk mendeteksi resistensi
antimikroba diperlukan
• Menentukan jenis terapi antimikroba yang sesuai
• Menentukan apakah profil kerentanan antimikroba tidak biasa atau menyimpang
untuk spesies bakteri tertentu
• Menentukan apakah organisme yang menginfeksi merupakan risiko bagi pasien lain
di rumah sakit, masyarakat, atau pekerja laboratorium (yaitu, apakah atau masalah
pengendalian infeksi, kesehatan masyarakat, atau keselamatan laboratorium?)
• Mengumpulkan data epidemiologi untuk memantau pengendalian dan transmisi
organisme
Identifikasi fenotipe
Kriteria fenotipe yang paling umum digunakan adalah
sebagai berikut:
• Karakteristik dan morfologi pengecatan mikroskopis
• Makroskopis morfologi koloni, bau dan pigmentasi
• Lingkungan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan
• Sensitivitas terhadap antibiotik
• Nutrisi yang dibutuhkan
• Reaksi biokimia, reaksi enzimatik dan profil kimia
Pemeriksaan untuk bakteri Gram Positif,
mendeteksi adanya katalase
Menggunakan H2O2 3% untuk aerob, 15%
untuk anaerob
Membedakan :
• Staphylococci dan Streptococci
• Bakteri aerob dan obligate anaerob
Tes biokimia yang secara standar digunakan antara lain :

• Utilisasi karbohidrat
• Utilisasi protein/asam amino
• Metabolisme glukosa dan hasilnya
• Motilitas
Utilisasi karbohidrat

TSIA / KIA HARUS DIINKUBASI 18 to 24 JAM

LF (+), enzim galactosidase LF (-), enzim (-) dLF (+),
dan galactosidase permease galactosidase
Salmonella
Escherichia coli Proteus Shigella sonnei
Enterobacter Yersinia Citrobacter
Klebsiella Pseudomonas
Shigella
Metabolisme Glukosa Piruvat mixed acid
Methyl Red (MR) test : Mixed acid fermentation
Voges-Proskauer (VP) test : butylene glycol

MR (+), VP (-) : Escherichia coli

MR (-), VP (+) : Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae
MR (-), VP (-) : Pseudomonas aeruginosa
 Bakteri diinokulasi pada triptopan
atau pepton broth.

Bacteria with tryptophanase are capable of hydrolyzing

tryptophan to pyruvate, ammonia, and indole. Kovac’s reagent
(dimethylamine-benzaldehyde and hydrochloride), when added
to the broth culture, reacts with the indole, producing a red color

Indole (+) : Escherichia coli

Indole (-) : Klebsiella pneumoniae
Urea is the product of decarboxylation of amino acids. Hydrolysis
of urea produces ammonia and CO2 . The formation of ammonia
alkalinizes the medium, and the pH shift is detected by the color
change of phenol red from light orange at pH 6.8 to magenta
(pink) at pH 8.1

Urease (+) : Proteus spp

Urease (-) : Escherichia coli
 Media simmon’s
citrate

Media Simmon’s Citrate :

mengandung garam amonium sebagai sumber
nitrogen ammonia – pH basa biru
Evaluation of Antimicrobial Activity
Mode of Action of Antibacterial Agents
• Inhibitors of Cell Wall Synthesis
• Inhibitors of Protein Synthesis
• Inhibitors of Cell Membrane Function
• Inhibitors of Deoxyribonucleic Acid and Ribonucleic Acid Synthesis
• Inhibitors of Other Metabolic Processes
Laboratory Methods and Strategies for
Antimicrobial Susceptibility Testing

• The primary goal of antimicrobial susceptibility testing is to

determine whether the bacterial isolate is capable of
expressing resistance to the antimicrobial agents selected for
treatment. Because intrinsic resistance is usually known for
most organisms, testing for intrinsic resistance is not
necessary, and organism identification is sufficient.
• In essence, antimicrobial susceptibility tests are assays
designed to determine acquired resistance in any clinically
important organism for which the antimicrobial susceptibility
profile is unpredictable.

CLSI
Standarisasi
mengoptimalkan kondisi mengoptimalkan kondisi mempertahankan
pertumbuhan bakteri untuk menjaga integritas reproduktifitas dan
dan aktivitas antimikroba konsistensi dalam
profil resistensi
sehingga penghambatan suatu organisme
pertumbuhan dapat sehingga kegagalan untuk
dikaitkan dengan agen menghambat pertumbuhan
antimikroba terhadap bakteri dapat dikaitkan
organisme yang sedang dengan mekanisme
diuji dan bukan akibat dari resistensi terkait organisme
keterbatasan nutrisi, suhu, daripada inaktivasi obat krn
atau kondisi lingkungan lain kondisi lingkungan
yang dapat menghambat
pertumbuhan organisme
The standardized components of antimicrobial
susceptibility testing include
• Bacterial inoculum size
• Growth medium (typically a Mueller-Hinton base)
• pH
• Cation concentration
• Blood and serum supplements
• Thymidine content
• Incubation atmosphere
• Incubation temperature
• Incubation duration
• Antimicrobial concentration
Limitations of Standardization

• Antibiotic diffusion into tissues and host cells

• Serum protein binding of antimicrobial agents
• Drug interactions and interference
• Status of patient defense and immune systems
• Multiple simultaneous illnesses
• Virulence and pathogenicity of infecting bacterium
• Site and severity of infection
Metode konvensional

• Broth dilution, Agar dilution, Disk

diffusion
• Hal yang menjadi perhatian :
• Persiapan inoculum.
Gunakan pure cultur dan standard-sized inoculum

• Pemilihan antibiotic (panel antibiotic)

Gunakan CLSI
TERIMAKASIH