Identifikasi cemaran secara mikrobiologis

pada makanan , obat dan kosmetik

 Cemaran/ kontaminan
• Cemar = kotor/ ternoda
• cemaran = yang tercemaran ( kbbi)
• Cemaran mikroba  yang mengotori sediaan obat/ makanan/
kosmetik
• Cemaran : 3
• Fisika => bahan bahan asing contoh: pecahan plastik. Gelas, kerikil ,
kawat dll
• Kimia => adanya zat kimia pada sedian obat. Contoh: residu pestisida,
• Biologis => adanya mikroba yang mengotori ( bakteri, jamur) pada
sediaan obat contoh pada produk jamu tradisional
 Untuk apa kita melakukan identifikasi cemaran
obat/ jamu/ makanan?
• Menjaga kualitas produk obat yang di produksi
• Melindungi Konsumen dari efek yang tidak diinginkan
• Memenuhi standar yang ditetapkan BPOM
( Persyaratan mutu obat tradisional ( CPOTB) dan
CPOB)
 Cemaran mikroba pada obat makanan dan
kosmetika
• Pada Obat dan Kosmetika
• Bakteri
• Aeromonas hydrophila Corynebacterium cloaceae
• Bacillus anthracis Diplococcus pneumoniae
• Clostridium batulinum Enterobacter cloaceae
• Cl. perfringens E. coli
• Cl. tetani Fusobacterium plantivincenti
• Haemophylus influenza Salmonella thypi
• Mycobacterium tuberculosis Serratia narcescens
• Mycoplasma hominis Staphylococcus aureus
• Neisseria meningitis Streptococcus pyogens
• Pseudomonas aeruginosa Vibrio cholerae
• P. fluorescens Yersinia pestis
• Salmonella enteridis
Mikroba yang biasa mengkontaminasi Makanan

Bakteri
• Acetobacter Corynebacterium Micrococcus
• Achromobacter Erwinia Pseudomonas
• Aerobacter Escherichia
• Paracolobacterium
• Alcaligenes Flavobacterium Proteus
• Bacillus Kurthia Sarcinia
• Clostridium Lactobacillus Salmonella
• Staphylococcus Listeria Shigella
• Moxarella Pantoea
• Ragi
• BrettanomycesMycoderma Pichia
• Candida Saccharomyces Rhodotulla
• Debaromyces Shizosacharomyces Torulaspora
• Hanseniospora Trichosporon Zygosacharomyces

Fungi
• Alternaria Geotrichum Fusarium
• Aspergillus Helminthosporium Penicillium
• Botrystis Monilia ( Neurospora) Trichothecium
• Cephalosporium Mucor Spootrichum
• Thamnidium Wallemia Xeromyces
SUMBER KONTAMINASI
• 1. Bahan baku
• 2. Air
• 3. Peralatan
• 4. Wadah dan kemasan
• 5. Udara/ lingkungn kerja
• 6. Personil/ pekerja
• Di industri Farmasi (tempat produksi obat)
makanan/ kosmetika, mikroba dapat
mengkontaminasi melalui 3 tahap :

SEDIAAN
BAHAN BAKU SEDIAAN JADI
DALAM PROSES

-Sumber bahan baku -Air -wadah/ kemasan

-Air/ lingkungan -Personil -personil
-Peralatan
-udara
 Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan
mikroba dalam substrat :

• 1. Besar kecilnya inokulum

• 2. Bahan-bahan nutrisi yang terdapat dalam sediaan
• 3. Kadar air
• 4. pH
• 5. Potensial redoks
• 6. Tekanan osmosis
• 7. Suhu
• 8. Zat antimikroba
• 9. Hal-hal yang dapat melindungi mikroba
• 1. Besar kecilnya inokulum
• Sediaan (obat, makanan, kosmetika) →terkandung mikroba
tinggi, kemungkinan rusak tinggi

• 2. Bahan-bahan nutrisi yang terdapat dalam sediaan

• Mikroba memerlukan makanan untuk tumbuh:
• Sumber energi : KH, Alkohol, lemak
• Sumber nitrogen : asam amino, nukleotida, peptida, protein
• Sumber vitamin dan faktor pertumbuhan: vitamin golongan B kompleks, asam
amino tertentu
• Mineral: ion-ion logam dalam konsentrasi kecil seperti K, Na, Mg, Ca, Fe, Cl.
• Oligoelemen seperti Cu. Mn, Zn, Mo, dan Va
• Sediaan farmasi banyak mengandung bahan-bahan yang dibutuhkan
mikroba → mudah terkontaminasi
• 3. Kadar air
• Semua sel hidup membutuhkan air
• Di dalam mikrobiologi, di kenal istilah aw = water activity
dimana aw = p/po p : tekanan uap air yang ada dalam
substrat
po: tekanan uap air murni

o Umum: Mikroba tumbuh baik pada harga aw yang tinggi

o Misal: bakteri Gram (-) kelompok bacil: aw = 0,95
o Staphyloccus, Micrococcus dan Lactobacilli, aw = 0,91
o Ragi (yeast) = 0,88
o Fungi pembentuk filament = 0,61 (mis: A. flavus)
o Pada sediaan yang dapat membentuk lapisan film dari
air → akan mudah dicemari oleh fungi
• 4. pH
– Umum: - bakteri tumbuh baik dalam suasana sedikit basa atau sekitar netral.
pH 7.0 – 7.2

– Bakteri patogen : tidak tahan pH > 7,5

pH < 6,2

– pH optimal bakteri patogen: 6,8 – 7,2

– Bakteri saprofit: pH 5 – 8,5

• 5. Potensial Redoks
– Potensial redoks bakteri ditentukan oleh:
• Kandungan oksigen pada substrat
• Kandungan bahan-bahan lain yang terdapat pada substrat
• Mikroba aerob obligat: memerlukan O2 untuk pertumbuhan
• Mikroba anaerob: tidak dapat hidup bila ada O 2
• Mikroba anearob fakultatif: bisa tumbuh bila ada/ tidak ada O 2
• 6. Tekanan osmosis
• Umum: bakteri hidup pada kandungan garam yang
encer (kecuali bakteri laut)
• Tekanan osmosis tergantung dari bahan yang
terlarut.
• Bakteri pada umumnya dapat tumbuh dalam range
tekanan osmosis yang cukup besar. Oleh karena
adanya enzim permease sehingga konsentrasi
garam dalam sel dapat di atur. Akan tetapi bila
konsentrasi ini cukup tinggi, maka air akan keluar
dari sel → pertumbuhan terhenti
• Bakteri yang dapat tumbuh pada konsentrasi
garam yang tingi disebut: Halofilik
• Ragi yang osmofil dapat berkembang biak di dalam
larutan gula dengan konsentrasi tinggi
• 7. Suhu
• Umum: bakteri tumbuh pada suhu di atas 350C
• Pertumbuhan mikroba dikenal adanya suhu
minimum dan suhu maksimum. Suhu optimum
terletak diantaranya
pertumbuhan

Daerah
eugenesik
suhu

Daerah disgenesik: pada daerah

ini mikroba tidak mati, tapi tidak
Memungkinkan untuk
pertumbuhannya
• Berdasarkan daerah eugenesik, bakteri
dapat dibagi menjadi 4 golongan:
– Bakteri kriofil: suhu min: -10 0C
suhu optimum:15 – 20 0C
suhu maksimum: 30 0C
– Bakteri mesofil: suhu min: 10 – 15 0C
suhu optimum:25 – 37 0C
suhu maksimum: 40 – 50 0C
– Bakteri termofil: suhu min: 45 – 50 0C
suhu optimum: 50– 55 0C
suhu maksimum: 60 – 75 0C
– Bakteri termoresisten : suhu optimum: 65 0C
– 8. Zat antimikroba
Adanya zat antimikroba dalam sediaan akan
mempengaruhi pertumbuhan mikroba.
Efektifitas zat antimikroba dipengaruhi oleh :
– Konsentrasinya
– Besarnya inokulum mikroba
– Komponen yang ada dalam substrat
– pH
– Suhu
– Efek wadah
– Stabilitas
– Sifat fisiko kimia
• 9. Hal-hal yang dapat melindungi mikroba:

– Selain zat anti mikroba, zat lain yang mempengaruhi

pertumbuhan bakteri dalam sediaan:
• Protein tertentu
• Zat-zat pengsuspensi
• Surfactan dalam konsentrasi rendah, seperti
polisorbat
• Adsorpsi mikroba pada partikel-partikel
tersuspensi seperti kaolin, Mg trisilikat/ atau
Al(OH)3 gel → dapat menaikkan daya resistensi
mikroba
NORMA KUALITAS MIKROBIOLOGI
OBAT, MAKANAN DAN KOSMETIKA

• STANDAR KUALITAS MIKROBIOLOGI

MAKANAN

• Tergantung pada masing-masing negara

• Di Indonesia, standar kualitas mikrobiologi
makanan dapat dilihat dalam laporan-
laporan Kodeks Makanan Indonesia

• TERBAGI 7 KELOMPOK MAKANAN

• Masing masing mempunyai norma batasan
cemaran mikroba tersendiri, yaitu :
– susu dan hasil olahannya
– ikan dan hasil olahannya
– Daging dan hasil olahannya
– Makanan bayi dan anak-anak
– Minuman ringan / sirop dan sari buah
– Makanan beku dan makanan kaleng
– Telur dan hasil olahannya

• Normanya meliputi: - bilangan kuman/ total bakteri

- batasan cemaran mikroba

KUANTITATIF  ALT DAN MPN

• Batas cemaran mikroba yang diperiksa:
– Bakteri bentuk coli/coliform
– E. coli
– Staphylococcus aureus
– Salmonella
– Enterococci
– Vibio cholerae
– Clostridium perfringens
– Fungi
– Ragi
 Pengujian batas cemaran
• PENENTUAN ALT
Bertujuan untuk menentukan jumlah bakteri dalam suatu sampel. Dalam test
tersebut diketahui perkembangan banyaknya bakteri dengan mengatur sampel,
di mana total bakteri tergantung atas formasi bakteri di dalam media tempat
tumbuhnya dan masing-masing bakteri yang dihasilkan akan membentuk koloni
Penentuan angka kapang dan khamir
Uji AKK adalah uji utk menetukan jumlah kapang dan khamir setelah sampel
diinokulasikan pada media yang sesuai

• PENENTUAN MPN
Penentuan MPN
 Teknik Identifikasi
• Bakteri yang telah diisolasi dari berbagai sampel
(makanan, obat, kosmetika) harus diketahui identitas
nya untuk memastikan spesies bakteri yang
mengkontaminasi sediaan farmasi
• Ada beberapa teknik identifikasi yang digunakan:
 Analisa secara kualitatif
• 1. Pewarnaan
– Pewarnaan Gram hanya dapat membagi 2 kelompok bakteri
berdasarkan komposisi dinding sel nya
• 2. Penggunaan media Selektif
• 3. Hasil reaksi biokimia
– Teknik API20E System
– Biolog
– enterotube
• 4. Deteksi Gen Spesifik
– Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).
Teknik pewarnaan dan uji biokimia
 Teknik API 20E System
• The API 20E system atau Enterotube II system are used
in the clinical laboratory for the identification of
enteric bacteria
• Among them are :
– Escherichia coli (opportunistic urinary tract infections),
– Proteus mirabilis (opportunistic urinary tract infections),
– Shigella dysenteriae (bacillary dysentery),
– Salmonella typhi (typhoid fever), and
– Yersinia pestis (plague).
 Principles
 The API 20E System is a standardized, miniaturized version of conventional
biochemical procedures used in the identification of Enterobacteriaceae and other
gram-negative bacteria.
 A total of 127 taxa can be identified with this system.
 It is a ready-to-use, microtube system that performs 22 standard biochemical tests on
pure bacterial cultures from appropriate, primary isolation media.
 This system consists of a strip containing 20 chambers (figure 35.1), each consisting of
a microtube and a depression called a cupule.
 The tubes contain dehydrated substrates.
 The substrates are rehydrated by adding a bacterial saline suspension.
 To create anaerobic conditions, sterile mineral oil is added to several of the
microtubes.
Teknik API 20E System
The strip of microtubes is then incubated for 18 to 24 hours at
35° to 37°C so that the bacterium can act on the substrates.
The strip is read by noting color changes after the various
indicator systems have been affected by the metabolites or
added reagents (table 35.1).
The identification of the unknown bacterium is
achieved by determining a seven-digit profile index number
and consulting the API 20E Profile Recognition System or the
API 20E Profile Index Booklet.

Charts can also be used to determine the unknown

bacterium (see appendix G).
 Biolog System
• Metoda Biolog dirancang untuk mengidentifikasi
bakteri, jamur dan yeast berdasarkan reaksi
biokimia yang terjadi karena perbedaan sumber
karbon yang terdapat didalam 95 lubang
mikroplate.
• Mikroplate Biolog pertama kali diperkenalkan
pada tahun 1989.
• Sumber karbon ini berasal dari polimer, gula, gula
fosfat, asam amino, alkohol, asam karboksilat.
• Disetiap lubang mikroplate terdapat indikator
tetrazolium yang akan tereduksi oleh reaksi yang
terjadi antara bakteri dengan sumber karbon yang
tersedia.
• Reaksi yang terjadi sangat khas untuk setiap jenis
bakteri oleh karena itu disebut “metabolic fingerprint”.
• Hasil ini akan dibandingkan dengan database yang ada
pada software MicroStation Reader (MicroLog™).
• Database Biolog mempunyai data 2.112 spesies bakteri
aerob, bakteri anaerob, yeast dan jamur.
 beberapa rangkaian pengujian yang harus
dilakukan:
1. Uji pengelompokan bakteri dengan menggunakan
pereaksi KOH 3%.
Suspensi berbentuk lendir menandakan bakteri gram negatif
sedangkan suspensi encer menandakan bakteri gram positif.
Prinsip reaksi ini yaitu perbedaan ketebalan dinding sel,
bakteri gram negatif dinding selnya lebih tipis sehingga
dengan hanya penambahan KOH 3% dinding selnya pecah.
Sedangkan gram positif memerlukan lisozim untuk memecah
dinding selnya.
2. Uji oksidase dengan menggunakan oxidase test-strip
Enzim sitokrom oksidase dapat aktif karena terjadinya
transfer elektron ke molekul oksigen.
Adanya molekul oksigen pada enzim oksidase mampu
mereduksi substan-substan organik seperti N,N-dimetil-1,4-
fenilen diamonium diklorida dan naftol yang terdapat dalam
oxidase test-strip.
Warna biru violet pada test strip menunjukan positif bakteri
non enterik dan untuk bakteri enterik tidak terjadi perubahan
warna pada oxidase test-strip.
3. Uji katalase dengan penambahan pereaksi
hidrogen peroksida
Uji ini bertujuan untuk mengelompokan bakteri aerob dan
anaerob dengan mendeteksi keberadaan enzim katalase.
Enzim ini hanya terdapat pada bakteri yang mempunyai
metabolisme aerobik.
Reaksi positif bakteri aerob ditandai dengan terbentuknya
gelembung gas setelah penambahan hidrogen peroksida.
Sedangkan bakteri anaerob tidak terbentuk gelembung gas
• 4. Pembacaan hasil dengan menggunakan
MicroStation Reader (MicroLog™)
– Sebelum kultur bakteri diinokulasikan ke mikroplat,
terlebih dahulu koloni bakteri tersebut disuspensikan
dengan larutan inokulasi gram negatif atau gram positif.
– Kemudian diukur transmitannya dengan menggunakan
Biolog Turbidimetri.
 TEKNIK PCR
• Pengertian PCR
• Apakah PCR itu ?
– PCR merupakan singkatan dari Polymerase Chain
Reaction atau reaksi rantai polimerase

– Ditemukan pertama kali oleh Kary B. Mullis tahun 1985

– Merupakan suatu teknik amplifikasi rantai DNA yang

diinginkan secara in vitro.

– PCR memungkinkan untuk dihasilkannya produk DNA

sebanyak mungkin dari hanya beberapa kopi DNA awal.
• Ini jelas terlihat bahwa PCR bisa digunakan
untuk menghasilkan sejumlah DNA yang
bisa dideteksi hanya dari satu molekul saja
pada awalnya.

• PCR bisa digunakan untuk mengidentifikasi,

mengkarakterisasi dan menganalisa bagian
spesifik dari DNA maupun RNA.

• Mikroorganisme dapat diidentifikasi secara

PCR karena mempunyai DNA.
• Prinsip terjadinya reaksi akibat adanya sifat komplementasi
(=berpadanan) rantai DNA dengan pasangannya dan dimanipulasi
melalui tiga tahapan suhu:

– denaturasi ( pemisahan rantai ),

– annealing ( penempelan primer ),
– extension :perpanjangan rantai oleh DNA Polimerase.
Primer :
adalah potongan pendek rantai DNA
Biasanya terdiri 18 – 24 nukleotida
Didesain berkomplemen dengan
rantai DNA templat ,
dan menjadi titik batas multiplikasi
segmen DNA target.

DNA target (template DNA ) :

adalah segmen DNA
yang dimultiplikasi dalam reaksi PCR
dengan titik batas primer kiri
dan primer kanan.
 Secara teoritis, jika efisiensi reaksi pelipatgandaan seratus persen,
Dan dilakukan putaran 30 siklus reaksi rantai
( denaturasi-penempelan-perpanjangan ) maka PCR akan dihasilkan
sebanyak kurang lebih satu milyar molekul DNA target.

Reaksi komplementasi DNA terjadi sangat spesifik

sedemikian rupa sehingga dapat dipakai dalam identifikasi
bakteri yang mengkontaminasi sediaan farmasi dan sampel
biologis lainnya. 
Mesin PCR
• Hasil perbanyakan DNA kemudian di elektroforesa
untuk memisahkan potongan-potongan gen.
• Silahkan lihat proses elektroforesis/ elektroforesa
 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 K- M

Bobot
molekul
10.000
bp

1500
1000 bp
bp

750 bp

500 bp
385 bp

250 bp

Gambar . Hasil elektroforesis amplifikasi gen ctx pada Vibrio cholerae

dengan metoda PCR pada gel agarosa 1.2%