UJI KONTAMINAN MIKROBA

DALAM PANGAN

D E WA AY U I K A P R A M I T H A , S . S I . , M . S I

P RO G R A M S T U D I S A R J A N A FA R M A S I
FA K U L T A S FA R M A S I
1
U N I V E R S I T A S M A H A S A R A S W A T I D E N PA S A R
MIKROBIA PADA BAHAN MAKANAN

• Terdiri dari berbagai spesies yang berasal dari berbagai lingkungan

• Populasinya tergantung dari penerapan proses sanitasi, proses pengolahan dan kontrol yang
digunakan untuk membunuh mikrobia (metoda preservasi)
TUJUAN MELAKUKAN ANALISA
MIKROBIOLOGI

• Menentukan jenis dan sumber kontaminan

• Evaluasi proses sanitasi, penanganan bahan dasar
dan proses pengolahan
• Menentukan kualitas mikrobiologis makanan
• Menentukan umur simpan makanan
MICROORGANISMS IN FOOD
(food-borne microorganisms)

• Beneficial/ desirable
– e.g. Lactic acid bacteria in fermented food
• Deteriorated/ undesirable
– Pathogenic or Toxigenic
– Non-pathogenic
• Spoilage m.o. but can cause diseases e.g. Bacillus sp.in milk
• Indicator of pathogens e.g. Escherichia coli
SISTEM PENGAWASAN MAKANAN OLEH BPOM-RI

• Pemberian Nomer Registrasi BPOM-RI

- Makanan/Minuman : MD (dalam), ML (import) 12 digits
- Obat-obatan : D (dalam), DL (obat import)
- Kosmetika : CD (dalam), CL (kosmetik import)
- Alat kesehatan : KD (dalam), KL (alat import)
- Obat tradisional :TR

• Melakukan uji laboratorium sampel makanan

- Uji kandungan (komposisi) gizi
- Uji fisika kimia
- Uji mikrobiologi
- Uji bahan berbahaya dan beracun
SOURCES OF BACTERIAL CONTAMINATION

P PEOPLE
Staff, customers

R
RAW FOOD
Vegetables, meat,
shellfish, water

E ENVIRONMENT
Soil, dust

P PESTS
Insects, rodents,
animals, birds
7
8
FOOD-BORNE PATHOGENS

• Bacteria
! Salmonella spp.
! Shigella spp.
! Staphylococcus aureus
! Enteropathogenic E. coli
! Clostridium botulinum, Cl. perfringens
! Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus
! Bacillus cereus
! Campylobacter jejuni
! Yersinia enterocolitica
FOOD BORNE PATHOGENS

! Fungi – produce mycotoxins

– Aspergillus sp.
– Penicillium sp.
– Fusarium sp.

! Parasites ! Toxocara canis

! Amoebae
FOOD-BORNE DISEASES
• Food poisoning
– Pathogen’s cells
– Toxin
• Botulism: Clostidium botulinum
• Campylobacteriosis: Campylobacter jejuni
• E. coli infection: E. coli O157:H7
• Salmonellosis: Salmonellae
• Shigellosis: Shigellae
• Other diseases
• caused by viruses: Hepatitis A, poliomyelitis, etc.
FOOD POISONING
• Symptoms
• abdominal cramps
• nausea
• vomiting
• diarrhoea
• fever
• dehydration
• Diagnosis
• examination of the faeces and suspected food samples
 TESTING METHODS
Total heterotrophic
plate count Growth on detection
media
Most Probable
Number
Culture-dependent techniques

Sample
with Bugs

Culture-independent techniques

Optical
Nucleic Acid-Based

Chemical Immunological
Methods
KRITERIA MIKROBIOLOGIS MAKANAN

• Standard – bagian dari regulasi

• Spesifikasi – untuk spesifikasi purchasing
• Guideline – digunakan untuk monitoring proses
atau sistem
PENGENALAN ALAT-ALAT LABORATORIUM
MIKROBIOLOGI

1. Peralatan sterilisasi
a. Sterilisasi kering : alat gelas, cawan Petri, pipet.
Alat yang digunakan berupa oven yang suhunya dapat mencapai 180 oC.
b. Sterilisasi basah : untuk sterilisasi media, larutan, kapas, lap, dsb.
Peralatan yang umum digunakan adalah autoklaf.
c. Sterilisasi saring. untuk sterilisasi cairan yang rusak bila kena panas
(misal larutan vitamin)
2. Alat menghitung koloni
Quebec Colony Counter
3. Laminar flow (untuk memindahkan mikrobia secara aseptis)
4. Spektrofotometer : untuk mengukur kekeruhan yaitu dengan cara
mengukur sinar yang lewat pada media cair à mengukur konsentrasi
mikrobia pada media cair.
5. Mikroskop
KETRAMPILAN DASAR

• Persiapan/pembuatan media
• Sterilisasi dan penanganan/pembuangan limbah
• Metoda aseptik (aseptic transfer – untuk memindahkan kultur)
• Penyimpanan mikrobia
– Kultur dalam agar miring
– Deep freeze (dg cryoprotectant)
– Liofilisasi (dalam ampul)
STERILISASI
• Sterilisasi – basah, kering, filtrasi
• Sterilisasi basah / uap panas kombinasi suhu,
tekanan dan waktu (121°C, 15 mnt, 15 lbs/square
inch)
• Sterilisasi kering untuk alat-alat gelas
• Sterilisasi dengan uap panas dilakukan pada media
yang akan digunakan baik sebelum dan sesudah
inokulasi dengan mikrobia
 METODE ASEPTIS DAN TEKNIK ISOLASI

Kultur murni: apabila kultur ini hanya terdiri dari satu spesies mikrobia saja.
Jika spesies mikrobia yang lain secara tidak sengaja masuk ke dalam kultur murni, kultur
tersebut dikatakan telah terkontaminasi, dan tidak lagi dikatakan sebagai kultur murni tetapi
kultur campuran.
ISOLASI DENGAN CARA GORESAN

Hasil goresan yang baik Cawan - terkontaminasi

Goresan yang berasal dari

dua jenis bakteri

Koloni kurang terpisah Cara goresan yang salah

 KOLONI BAKTERI :
MORFOLOGI (BENTUK DAN STRUKTUR)

Bentuk dan ukuran koloni : irreguler

Margin/edge : undulate/wavy
Elevataion : umbonate
Warna : putih
Tekstur : dry (rough)
METODA KUANTITAIF

• Enumerasi atau estimasi langsung atau tidak langsung

• Aerobic Plate Counts (standard plate counts untuk dairy products), anaerobic counts,
psychrotrophic counts, thermoduric counts, coliform counts, S. aureus counts, yeast and mold
counts.
ENUMERASI LANGSUNG

• Microscopic Counts
• CFU – Colony Forming Unit
– Nonselective agar media (PCA)
– Nonselective differential agar media
– Selective agar media
– Selective differential agar media
ENUMERASI TIDAK LANGSUNG

• MPN
• Dye reduction test
• Pengenceran - nonselective media cair – jarang digunakan
METODA KUALITATIF

• Bakteri patogen (positif atau negatif)

• Salmonella, E. coli O157:H7, Clostridium botulinum, Listeria dll
METODA CEPAT

• ELISA
• Nucleic Acid Probe
 DETEKSI MIKROBIA PADA MAK ANAN

• Total mikrobia (bakteri, yeast, jamur/mold)

• Bakteri indikator
• Coliform, fecal coliform, E. coli, Grup Enterobacteriacea
Enterococci
• Bakteri pathogen
• Classical pathogen (Salmonella, Shigella, EPEC E. coli
• Emerging pathogen (Vibrio, Listeria monocytogenes, Yersinia, Campylobacter
jejuni, dll)

Kriteria bakteri indikator dan pathogen

Berkaitan dengan feses dan pathogen enterik
Level/rasio eksistensinya pada feses, bakteri indikator dan enterik
Resistensinya terhadap lingkungan (habitat) alami (feses dan makanan)
Resistensinya terhadap berbagai kondisi (proses dan penyimpanan makanan)
Waktu yang dibutuhkan untuk deteksi
PENGHITUNGAN MIKROBIA DALAM BAHAN PANGAN

• Uji coliform dengan MPN

– Pencemaran air mengapa
coliform ?

– Pengujian :
• Uji pendugaan
(presumptive tests)
• Uji penetapan
(confirmation tests)
• Uji lengkap (completed
tests)
 Uji mikrobiologi pada bahan makanan

7 Total mikrobia (bakteri, jamur, yeast)

6 Plate Count
5
4
3
2 Bakteri indikator : Coliform/E.coli
1 MPN
0
-1 Bakteri patogen
-2 Media resusitasi
-3 Media diperkaya
-4 Media selektif
-5 Isolasi dan identifikasi
-6
Log jumlah sel
ADA BEBERAPA VARIASI PADA ENUMERASI DENGAN
CARA INI, YAITU :

1.Pour plates
2.Spread plates
DILUTION AND PLATE COUNT (1)
Dilution and Plate Count (2)
PROSEDUR SAMPLING

• Gunakan wadah yang steril

• Jaga tangan selalu bersih dan kering
• Jangan membalik atau menjatuhkan tutup botol
• Jangan memasukkan plastik sampel yang belum steril kedalam saku baju
• Jangan mengkontaminasi bagian atas ataupun bagian dalam plastik sampel.
• Cuci peralatan sampling sebelum digunakan
• Isi didalam wadah tidak lebih dari 2/3 atau 3/4 –nya
• Jangan memegang wadah (belum tertutup) melewati permukaan sampel ketika sampel tersebut
dipindahkan
• Dinginkan sampel pada suhu 0-4,4oC
• Pindahkan sampel dalam wadah untuk pengiriman ke laboratorium
• Setelah digunakan, kembalikan wadah sampel ke laboratorium untuk disterilkan kembali
Standard Plate Count (SPC)

Standard di dalam equipment, material dan inkubasi

Equipment – tempat kerja, kabinet, refrigerator, termometer, transfer pipet,
botol untuk pengenceran, cawan Petri, timbangan, waterbath, autoclave,
inkubator, dll
Penyimpanan sampel suhu 4,4 C, waktu pengujian < 36 jam
Media – Standard method agar (Plate count Agar)
Pancreatic digest of casein (tripton)5,0 g
Yeast extract 2,5 g
Glucose 1,0 g
Agar 15,0 g
DW s/d 1 liter
pH (setelah sterilisasi) 7.0 + 0,2

Inkubasi 32 + 1C, 48 + 3 jam untuk mesofilik

Untuk termofilik : 55 + 1 C selama 48 jam, sebagai TBC/ml atau g
Untuk psikrofilik : 7 + 1 C selama 10 hari, sebagai PBC/ml atau g
CONVENTIONAL TECHNIQUES
• Standard plate count: SPC
• Homogenised food sample
• Dilutions
• Plate on suitable selective media
• Incubate at ….oC, for… h.
• Colony count

Shelf-life analysis
SPC = 106 CFU/ g or ml of product

= spoilage or nearly spoilage

 CONVENTIONAL TECHNIQUES

• Most probable number: MPN

– Growth in liquid medium
– Based on 3 decimal dilutions (5 or 3 tubes at each dilution)
– Number of positive (growth) tubes of each dilution
– Find the MPN values in Table reference
• Ex. Sample 1.0g, 0.1g, 0.01g=1,0,2
MPN/g = 11
Most probable number: MPN

! Selecting 3 dilutions for Table reference

! when more than 3 dilution are used, select
only 3 dilutions according to 2 cases
! 1. One or more dilution show all tubes positive
! 2. No dilutions show all tubes positive

! Conversion of Table units

! Approximation of an unusual series of
dilutions
! Confidence interval
RAPID TESTS
• Commercial kits: many
• Faster than conventional method
– e.g. the MMO-MUG method for coliform testing

Negative Positive Negative Positive

Total coliform E. coli

MOLECULAR DETECTION
• Method
• Food-->liquid/ solid media--o/n(16-24 h)--->DNA extraction-->PCR--->
Hybridisation with specific probe

• Has been used to detect

• enteroinvasive E. coli and Shigella spp., V. vulnificus Hepatitis A virus, and V. cholerae in
foods
MOLECULAR DETECTION

• Hybridisation
– Probe = DNA or RNA
– Probe design: specific genes such as
– probe labelling: radioactive, non-radioactive
• No direct detection from food
• Requires 105-106 copies of the target sequence to yield a clear, positive result

• Polymerase Chain Reaction (PCR)

 Bakteri coliform

Bentuk batang pendek, Gram negatif, aerob dan fakultatif anaerob,

tidak membentuk spora dapat menfermentasi laktosa & menghasilkan
gas pada suhu 32 C selama 48 jam

Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae,

Citrobacter, Erwinia

Bakteri indikator- berasosiasi dengan jalur intestin, keberadaannya

dalam makanan – merupakan kontaminasi dari jalur intestin (feses)
Uji coliform – terjadinya (re)kontaminasi & evaluasi proses sanitasi,
baik pada proses pemerahan susu, setelah pasteurisasi, penyimpanan,
dan proses-proses berikutnya
Presumptive test – Positive
1. Koloni berwarna merah gelap, diameter 0,5 mm muncul setelah 24
+ 2 jam inkubasi suhu 32 C pada media VRBA (violet red bile agar)
2. Pada media 2% brilliant green lactose bile broth (BGLB) terbentuk
gas setelah fermentasi 48 + 3 jam pada suhu 32 C

Complete test – Positive

Pada Eosin Metilen Blue (EMB) agar, 32 C, 24 jam – koloni
berwarna hijau metalik
Pada laktosa cair, 32 C, 48 jam – memproduksi asam dan gas
Pada nutrien agar, 32 C, 24 jam - Gram negatif, batang pendek, dan
tidak membentuk spora
Coliform test – pada media padat

Media yang digunakan VRBA (Violet red bile agar)

1 ml sampel (atau diencerkan terlebih dahulu) dimasukkan ke dalam
cawan dan ditambah 10-15 ml media yang masih mencair (atau 4 ml
sampel ditambah 15-20 ml media), tergantung dari perkiraan populasi
coliform
Dilapisi lagi dengan media VRBA untuk mencegah pertumbuhan koloni
di permukaan
Inkubasi (posisi terbalik) selama 24 + 2 jam pada 32 C
Koloni coliform berwarna merah gelap diameter 0,5 mm
Pemeriksaan bakteriologis meliputi : penghitungan
TPC, penghitungan MPN dan Identifikasi E.coli dan
penentuan Strain E.coli O157:H7

Metode pemeriksaan bakteriologi dilakukan secara:

a. Kualitatif:
- presumptive test
- comfirmed test
- completed test
b. Kuantitatif:
-Total Plate Count (TPC)
- MPN (Most Probable Number):
yaitu perkiraan jumlah kuman yang mendekati
per ml /gram
A.Cara pengambilan sampel:

1. Persiapkan wadah steril

2. Siapkan formulir tentang lokasi pengambilan,
tanggal pengambilan dan kode sampel
3. Masukkan sampel ke dalam wadah steril
tersebut
4. Wadah diberi kode, lokasi sampling dan tanggal
pengambilan sampel dengan menggunakan
spidol tahan air
5. Masukkan ke dalam box es yang telah
disiapkan sebelumnya
6. Kirim sampel ke laboratorium untuk diperiksa
45
B. CARA KERJA DI LABORATORIUM :

(1).Persiapan sampel mikroba.

- Masing-masing sampel ditimbang 10 gram dimasukkan

ke dalam gelas ukur, kemudian ditambahkan larutan
buffer phosphat pH.7.0 hingga mencapai volume 100
ml, kemudian dikocok sampai homogen .
- Dengan menggunakan pipet steril, pindahkan 1 ml
suspensi di atas ke dalam larutan buffer Phosfat
Lakukan pengenceran sampai di dapat (pengenceran
10-1) , kemudian sebanyak 1 ml dari tiap pengenceran
tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam 9 ml buffer
phosphat (pengenceran 10-2), demikian seterusnya
sampai pengenceran yang diinginkan.
47
48
2). Penentuan Nilai TPC Bacteria dengan Pour
Plate Methods ( Metode Tuang)

Metode ini bertujuan menghitung nilai Total Plate Count

Bacteria /TPC ( Angka Lempeng Total/ALT) suatu bahan

Prinsif : pertumbuhan bakteri pada media setelah

diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 2 x 24 jam

Nilai TPC ditentukan dengan cara menanam tiap contoh :

a. 1 ml contoh bahan dan
b. 1 ml contoh bahan dengan penipisan 1 : 101 ,
10 2 dan 1 : 103 masing- masing pada lempeng nutrient
secara pour plate .

Hasil pertumbuhan koloni dihitung dengan quibec coloni

counter dan dinyatakan dalam jumlah kuman per ml bahan.
- Masing-masing pengenceran diambil 1 ml
diinokulasikan pada media Nutrient Agar
dengan sistem tuang, Kemudian
diinkubasikan pada suhu 370 C selama 24-
48 jam.

- Koloni yang tumbuh dihitung sebagai Total

Plate Count (TPC).

- Dari pengenceran 10-1, diambil 0,1 ml

diinokulasikan pada media Mac Conkey
agar untuk pengujian E.coli.
54
3).Konfirmasi untuk Coliform dan F.
coliform

Sampel dari setiap pengenceran (10-1, 10-2,10-3)

diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 3 tabung
yang berisi lactose broth dan Brilliant Green Bile
(BGB) 2%.

Broth diinkubasikan selama 24 jam pada suhu

370C. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya
gas pada tabung tersebut dan selanjutnya
dihitung
 4). PEMBIAKAN SAMPEL
(1).Nutrien Agar
(2).SS Agar
(3).Mac Conkey Agar
(1).Nutrien Agar
- Dari tiap pengenceran di atas diambil 1 ml dan dimasukkan
ke dalam petridish
- Tuangkan sebanyak 15-20 ml nutrien agar ke dalam
petridish tersebut di atas
- Goyangkan cawa petridish sedemikian rupa sehingga
sampel dan agar tercampur merata
- Setelah agar membeku, balikkan cawa petridish dan
inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam
- Hitung koloni yang tumbuh
56
(2). SS Agar
- Ambil satu sengkelit sampel dari pengenceran di
atas dan goreskan pada permukaan media SS Agar
secara zigzag
- Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam
- Amati koloni yang tumbuh
- Bila ditemukan koloni tidak berwarna/ bening, maka
koloni tersebut tersangka sebagai Salmonella

57
(3). Mac Concey Agar
- Ambil satu sengkelit sampel dari pengenceran di
atas dan goreskan pada permukaan media MC Agar
secara zigzag
- Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam
- Amati koloni yang tumbuh
- Bila ditemukan koloni berwarna merah jambu, bulat
dan besar, maka koloni tersebut tersangka sebagai
E.coli

58
B. Metode MPN (Most Probably Number)
1. Penentuan MPN presumptive coliform
- Pada pemeriksaan ini dipakai laktosa broth
- Siapkan 7 tabung reaksi yang berisi LB sebanyak 10 ml
- Pipet sampel 10 ml, lalu masukkan ke dalam tabung 1-5
- Pipet sampel 1 ml, lalu masukkan ke tabung 6
- Pipet sampel 0,1 ml, lalu masukkan ke dalam tabung 7
- masing-masing tabung dihomogenkan
- Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam
- Hasil (+) dinyatakan dengan terbentuknya gas pada tabung durham dan
dilanjutkan dengan tes penegasan
- Hasil (-) berarti coliform negatif dan tidak perlu dilakukan tes penegasan
Prosedur pengujian total coliform dengan metode MPN (FDA, 1995)
2. Test Penegasan

-Dari tiap tabung yang positif pada test awal, dipindahkan

1-2 ose ke dalam tabung yang berisi 10 ml BGLB 2 %. Dari
masing-masing tabung penegasan diinokulasikan ke dalam
dua seri
Satu seri tabung BGLB 2 % diinkubasikan pada suhu 37o
C selama 24 jam untuk coliform. Satu seri tabung BGLB
lainnya diinkubasikan pada suhu 44 o C selama 24 jam
untuk colifecal

- Pembacaan dilakukan setelah 24- 48 jam dengan melihat

jumlah tabung BGLB yang menunjukkan (+) gas.
- Kemudian dicocokkan dengan tabel MPN Hoskin
J.K dan hasilnya dinyatakan dalam faecal coliform /gr
sampel.
Tabung positif : 5 4 1
63
Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu
hitung tabung positif untuk tiap seri.
Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka
tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga
diperoleh jumlah mikroba sebenarnya.

Misalkan . Diperoleh kombinasi jumlah tabung positif :

321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.

64