Standar Mikrobiologi dan

Uji Mikrobiologi untuk

Bahan
dan Produk Farmasi

Bahan Farmasi

Bahan baku
Air murni (Purified Water)
Produk Farmasi Steril (Sterile
Pharmaceuticals)
Produk Farmasi Non-Steril (NonSterile Pharmaceuticals)

BAHAN BAKU FARMASI

Bahan baku untuk produk farmasi
dapat berupa bahan kimia atau
bahan yang berasal dari alam
Bahan yang berasal dari alam lebih
cenderung terkontaminasi
mikroorganisme lebih berat
dibandingkan bahan sintetik kimia

Kategori Bahan Baku Alam (Grigo,

1976)
1. Bahan baku hasil sintesis atau ekstrak
bahan alam yang sudah dimurnikan (ratarata 10 cfu/g atau mL)
2. Bahan baku hasil sintesis dan dari bahan
alam (rata-rata 102 cfu/g atau mL)
3. Ekstrak tanaman (rata-rata 103 cfu/g atau
mL)
4. Produk hewan atau tanaman yang sedikit
mengalami proses (rata-rata 104 cfu/g
atau mL)
5. Produk hewan atau tanaman yang tidak
mengalami proses (rata-rata 105 cfu/g
atau mL)
5

Mikroorganisme kontaminan yang

sering dijumpai dalam bahan baku
alam

Bacillus
Enterobacteriaceae
Staphylococcus
Aspergillus
Penicillium
Mucor
Rhizopus

E.coli

Salmonella

AIR

Air minum (potable water) : tidak boleh ada

Coliform bacilli per 100 ml
Air untuk injeksi :

< 0,25 endotoksin unit (EU) per ml.

Batas mikroba < 10 cfu per 100 ml
Tidak ada Pseudomonas

Air untuk sediaan non-steril :

o Kisaran dari <10 sampai < 100 cfu per 100

ml
o Tidak ada Pseudomonas

Produk Farmasi Steril

Untuk produk parenteral, sediaan obat mata,
termasuk larutan lensa kontak , dan produkproduk yang diberikan pada luka terbuka atau
untuk proses irigasi rongga tubuh.
Uji sterilitas perlu dilakukan
Syarat Steril : Sterility Assurance Level
dengan probabilitas sama atau lebih baik dari
10 -6, artinya dalam satu juta sediaan steril
hanya boleh maksimum 1 yang tidak steril.
Analisis sterilitas adalah berdasarkan tidak
adanya pertumbuhan mikroba pada media
Fluid Thioglycollate (FTM) dan Soyabean
Casein Digest (SCD)pada 30-35C (bakteri)
dan 20-25C (fungi) selama 7 dan 14 hari.
8

Produk Farmasi Non-Steril

Tidak ada aturan tunggal yang mengatur,
tergantung pada farmakope negara
masing-masing
Tidak mengandung mikroba yang dapat
menyebabkan infeksi akibat penggunaan
obat tersebut (medication-borne infection)
TVC (Total Viable Count) dalam jumlah
tertentu dan tidak adanya patogen enterik
dalam bahan baku nya.
9

Persyaratan Kualitas Mikrobiologi

Sediaan Farmasi versi FIP (1976)
Gol. Jenis Sediaan

Persyaratan

1a
1b

Injeksi
Steril Farmakope
Obat mata, sed.utk bgn tubuh
Bebas mikroba yang memp.daya hidup/g atau
yg bebas mikroba, sed.utk luka mL
bakar, tukak berat

Sed. topikal pada lesi kulit,

hidung, tenggorokan (resiko
tinggi)

Mikroba yg memp.daya hidup maks 102 /g atau

mL, dan tidak mengandung Enterobacteriaceae,
P.aeruginosa, S.aureus

Sediaan lain

Mikroba yg memp.daya hidup maks 103 104

bakteri anaerob, 102 ragi dan kapang /g atau mL,
Batas mikroba spesifik : tdk ada E.coli, dan tidak
mengandung Salmonella, P.aeruginosa,
S.aureus,
Enterobacteriaceae lain maks. 102 /g atau mL
10

Batas kontaminan mikroba pada

bahan dan sediaan obat asal tanaman
(versi UNIDO,1990)
Bahan/
Sediaan

Bakteri

Ragi dan
kapang

Baketri
coliform

Salmonella

Staphylococcus

Sediaan
obat asal
tanaman

< 104 /g

< 102 /g

Bahan
obat asal
tanaman

< 107 /g

< 104 /g

Ket.: (-) tidak boleh ada

UNIDO (United Nation Industrial Development Organization)
11

Uji Mikrobiologi yang Tercantum

pada Farmakope Indonesia edisi IV
Uji secara Mikrobiologi
<51> Uji Batas Mikroba
<61> Uji Efektivitas Pengawet
<71> Uji Sterilitas

Uji dan Penetapan secara Biologi

<91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12
<121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat
<131> Penetapan Potensi Antibiotik secara
Mikrobiologi
12

<51> Uji Batas Mikroba

Dilakukan untuk memperkirakan jumlah
mikroba aerob viabel di dalam semua jenia
perbekalan farmasi, mulai dari bahan baku
hinga sediaan jadi
Untuk menyatakan bahwa perbekalan farmasi
tersebut bebas dari spesies mikroba tertentu
Pengerjaan harus dilakukan secara aseptik
Jika tidak dinyatakan lain, inkubasi adalah
menempatkan wadah di dalam ruang
terkendali secara termostatik pada suhu
antara 30 35C selama 24 48 jam
Istilah tumbuh ditujukan untuk pengertian
adanya dan kemungkinan adanya
perkembangan mikroba viabel
13

<61> Uji Efektivitas Pengawet

Pengertian Pengawet Antimikroba : zat yang
ditambahkan pada sediaan obat untuk melindungi
sediaan terhadap kontaminasi mikroba.
Pengawet terutama digunakan pada wadah dosis
ganda
Pengawet tidak boleh digunakan semata-mata
untuk menurunkan jumlah mikroba viabel sebagai
pengganti cara produksi yang tidak baik
Kadar yang digunakan harus serendah mungkin
Pengujian dalam farmakope dimaksudkan untuk
menguji efektivitas pengawet yang ditambahkan
pada sediaan dosis ganda yang dibuat dengan
dasar atau bahan pembawa cairan
Pengujian dan persyaratan hanya berlaku pada
produk di dalam wadah asli yang belum dibuka ,
yang didistribusikan oleh produsen
14

<71> Uji Sterilitas

Digunakan untuk menetapkan apakah bahan
atau produk farmasi yang harus steril memenuhi
syarat berkenaan dengan uji sterilitas seperti
yang tertera pada masing-masing monografi
bahan atau produk
Untuk penggunaan prosedur uji sterilitas sebagai
bagian dari pengawasan mutu di industri, tertera
pada <1371> Sterilisasi dan Jaminan
Sterilitas Bahan Kompendia
Mengingat kemungkinan hasil positif dapat
disebabkan oleh pengerjaan yang salah atau
kontaminasi lingkungan, diberlakukan pengujian
2 tahap seperti yang tertera pada bagian :
Penafsiran Hasil Uji Sterilitas
15

 Prosedur alternatif dapat digunakan asal hasil

yang diperoleh sekurang-kurangnya setara
keandalannya Lihat Prosedur pada Uji
dan Penetapan dalam Ketentuan Umum
Jika timbul perbedaan, dan adanya
kontaminasi terdapat pada hasil dari prosedur
Farmakope, maka hasil harus dinyatakan
sebagai tidak memenuhi syarat.

16

<91> Penetapan Aktivitas Vitamin

B12
Dilakukan menggunakan bakteri uji
Lactobacillus leichmanii dengan metode
turbidimetri
Pembanding larutan baku Sianokobalamin
BPFI berkisar antara 0,01 0,04 ng per mL.
Blanko menggunakan air.
Metode spektrofotometri pada panjang
gelombang 530 nm.
Penetapan kadar dihitung melalui kurva
baku
17

<121> Penetapan Kadar Kalsium

Pantotenat
Dilakukan menggunakan bakteri uji
Lactobacillus plantarum dengan metode
turbidimetri
Pembanding larutan baku Kalsium
pantotenat BPFI berkisar antara 0,01 0,04
g per mL. Blanko menggunakan air.
Metode spektrofotometri pada panjang
gelombang 660 nm.
Penetapan kadar dihitung melalui kurva
baku
18

<131> Penetapan Potensi Antibiotik

secara
Mikrobiologi
Aktivitas (potensi) suatu antibiotik dapat
ditunjukkan pada kondisi sesuai dengan
efek daya hambatnya terhadap mikroba uji
Perbedaan kadar dan potensi
Dua metode umum : cara lempeng dan
cara tabung
Cara lempeng : menggunakan kertas
cakram atau selinder baja, efek difusi
antibiotik pada medium agar.
Cara tabung : turbidimetri, efek larutan
antibiotik terhadap turbiditas mikroba
19

ANALISIS MIKROBIOLOGI
Metode pemeriksaan harus
memperhitungkan sifat-sifat dari
bahan atau sediaan yang akan
diperiksa, terutama terhadap :
Kelarutan
Adanya zat antimikroba
Derajat kontaminasi

 Tergantung dari sifat dan macamnya,

bahan tersebut harus :

Di
Di
Di
Di

encerkan
larutkan
suspensikan
emusikan

dalam cairan pendispersi yang sesuai.

Jika mengandung zat antimikroba,
maka harus dihilangkan dengan
jalan:di encerkan, di netralisasi atau di
saring.

Prinsip Kerja

Sejumlah tertentu sediaan yang

akan diperiksa:- dilarutkan, atau di
suspensikan, atau di emulsikan
dengan cairan pendispersi, kalau
perlu memakai alat mekanik.
Setelah pengenceran, diuji batas
mikroba yang ada untuk
menentukan bebas tidaknya dari
mikroba tertentu

METODE
1. Metode Lempeng
Medium padat
Dalam cawan petri
Hasil : penghitungan koloni, misal dengan
colony counter

2. Metode Tabung
medium cair
Dalam tabung reaksi
Hasil : kekeruhan/ turbidimetry (Spectrometry)

 3. Metode Membran Filter

untuk cairan yang bisa disaring
Hasil : penghitungan koloni

4. Metode Tabung Ganda ( FI ed IV)

Prinsip kerja sama dengan no. 2

MEDIUM
1. Metode Lempeng:
Medium Isolasi
NA (Nutrient Agar)
bakteri
SCA (Soybean Casein Agar)
SDA ( Sabouraud Dextrose Agar)Jamur/ ragi
PDA ( Potato Dextrose Agar
Medium Identifikasi dan Konfirmasi
Jenis bakteri yang harus bebas dari sediaan:
Staphylococcus aureus VJA. BPA, MSA
Pseudomonas aeruginosa CETA, PAF, PAP
Salmonella spp FLM, FSCM, FTM, Rainbow Agar,
XLD
Escherichia coli MCA, LEMBA
Hasil

: Angka

mikroba aerob total

 Prosedur Kerja
1 ml

1 ml

1 ml
9 ml

Stok
10%

10-1

9 ml

10-2

1 ml

9 ml

10-3

bakteri

jamur

1 ml

9 ml

10-4

9 ml

10-5

15 ml 20 ml
NA/SCDA

15 ml 20
ml
SDA/PDA

 Cawan petri di inkubasi pada suhu 37

oC selama 48-72 j
Jika tidak ditemukan koloni pada
cawan yang enceran 1: 10, di
nyatakan : Kurang dari 10
mikroba per gram atau ml
specimen

 2. Metode Tabung Ganda

Medium Isolasi
FSCD / FCDSLP

Prosedur Kerja

Prosedur kerja
1 ml sampel

1 ml
sampel

9 ml
media

1 (100)

2 (10)

100 mg 1 ml

Kontrol
Media FSCD
steril

3 (1)

B
10 mg sampel

 1. Sampel di masukkan ke dalam kelompok 1 (100)

dan A
2. Ambil 1 ml dari A tabung B
3. Ambil 1 ml dari A kelompok 2 (10) buang sisa
tabung A
Ambil 1 ml dari B kelompok 3 (1) buang sisa
tabung B
Inkubasi semua tabung ( setelah ditutup)
Hasil : lihat Tabel MPTC/ MPN
kontrol harus tetap jernih

Tabel Nilai Dugaan terdekat

Jumlah specimen (mg/ml)

Nilai Duga Terdekat

Mikroba tiap g/ml

100 mg
(0,1 ml)

10 mg
(0,01 ml)

1 mg
(0,01 ml)

> 1100

1100

500

200

290

210

150

90

160

120

70

40

TAHAP-TAHAP UJI BEBAS MIKROBA

1. Pre enrichment jika perlu

2. Enrichment media selektif/ tidak selektif
3. Isolasi media selektif : jika tumbuh
positif
Jika negatif percobaan stop
bebas mikroba

4. Konfirmasi test biokimia test gen

DNA

5. Identifikasi

jika perlu

Beberapa parameter yang

berpengaruh pada teknik analisis
mikrobiologi
1. Sampel
Jumlah sampel : - representatif, - mewakili
batch
MAKANAN

Tergantung tingkat bahaya :

Salmonella 100 g
Bakteri lain 25 g
OBAT / KOSMETIKA
10 g
MAHAL 1 atau 5 g

 Penyiapan sampel
Homogenkan gerus dalam lumpang steril
homogenizer lain

Buat larutan/ suspensi/ emulsi 10 % b/v cairan

pendispersi
Komposisi cairan pendispersi :
Syarat: 1. memungkinkan terjadinya suspensi dari
mikroba yang
ada dispersi dalam fasa air
2. melindungi bentuk vegetatif mikroba
3. tidak memperlambat penyaringan dengan
membran
filter
4. menginaktifkan bahan penghambat
pertumbuhan
mikroba

 Contoh : - NaCl 0,9% isotonis

- cairan Ringer
- Dapar Fosfat berpepton
Pengadukan
Tujuan: membebaskan bakteri dari sampel
tetapi tidak merusak mikroba lainnya
Umum: kecepatan sampai 20.000 rpm
selama 2 3 menit
Lama mikroba dalam cairan pendispersi
Paling lama 2 jam sebelum inokulasi

 Beberapa pedoman untuk sediaan

kosmetika
1. Patokan
Harus dilakukan segera begitu sampel tiba.
Jika tidak mungkin, simpan dalam suhu kamar
suhu dingin
suhu inkubasi
Periksa kemasan
Lakukan desinfektan kemasan sebelum dibuka;
dengan cara: campuran alkohol 80v/v dengan
HCl 1%v/v keringkan dengan kasa steril

 Untuk analisis: ambil 10 g sampel jika > 10

g/ml
Jika < ambil seluruhnya
Jika hanya 1 sampel, padahal harus melakukan
uji mikrobiologi, uji biokimia, uji toksikologi dll
yang lebih dulu dilakukan : uji mikrobiologi
Jika sampel hanya 5 g (ml), maka:
Untuk uji mikrobiologi: 1 2 g
Uji yang lain: sisanya

Penyiapan sampel

A. Cairan
10 ml sampel + 90 ml cairan pendispersi ad
100 ml

B. Padat/ serbuk
Timbang 10 g gerus dengan 10 ml Tween 20
steril
Buat suspensi ad 100 ml

C.Krim/ sediaan dasar minyak

Timbang sesuai kebutuhan
+ 1 ml minyak mineral steril
Gerus homogen

 + 1 ml Tween 80 steril pasta

+ kan sedikit demi sedikit cairan pendispersi
encerkan
ad sampai konsentrasi 0,1 g/ml

D. Aerosol dari serbuk sabun, cairan dll

Dekontaminasi mulut aerosol, semprotkan isi
aerosol sejumlah tertentu kedalam botol berisi
cairan pendispersi/ media yang telah di tara

E. Campuran sediaan A s/d D

Buat pengenceran 10

10

-4

Uji Mikrobiologi yang ada di

BPOM

Uji sterilitas langsung, sterilitas alat kesehatan.

Uji sterilitas cara penyaringan, sterilitas obat.
Uji antibiotik.
Uji angka lempeng, kapang/khamir total.
Uji Most Probably Number coliform, faecal
coliform.
Identifikasi Salmonela, E.Coli, C.albicans, B.
cereus, Aspergilus flavus, Shigella sp metode
pengkayaan.

 Identifikasi Enterococci, S.aureus,

B.anthracis,
P.aeruginosa, V.cholerae, V.parahaemolyticus
metode pengkayaan.
Identifikasi C.perfringens, C.tetani,
C.botulinum, Listeria monocytogenes
metode
pengkayaan.
Uji koefisien fenol.
Uji efektifitas pengawet.
Uji cepat bakteriologi menggunakan kit.