Uji Sterilitas

Uji Sterilitas
• Pada proses validasi
• Pada routine release testing, selain
dengan prosedur parametric release
• Uji sterilitas tidak didesain untuk menjamin
bahwa suatu bets seluruhnya steril.
Penjaminan sterilitas dilakukan dengan
validasi siklus sterilisasi (baca kembali
konsep SAL).
 Uji Sterilitas
• Uji sterilitas hanya menunjukkan sterilitas
dari sampel yang diuji.
• Meskipun tidak memberikan jaminan
sterilitas, apabila dari uji sterilitas
ditemukan adanya bakteri maka hasil
tersebut konklusif menunjukkan kegagalan
proses sterilisasi.
 Positif Palsu
• Uji sterilitas merupakan prosedur yang sulit,
yang hrs didesain dan dilaksanakan sedemikian
rupa sehingga tidak memunculkan hasil positif
palsu.
• Hasil positif palsu terjadi jika suatu sampel yang
(sebenarnya) steril ternyata menunjukkan
adanya pertumbuhan m.o. pada uji sterilitas.
• Hasil positif palsu terjadi karena pencemaran
laboratorium,yaitu dari lingkungan uji dan dan
kesalahan pekerja.
 Positif Palsu
• Apa akibatnya kalau tjd positif palsu?
• Uji sterilitas merupakan prosedur yang eksak.
Jika ditemukan pertumbuhan bakteri mk produk
ditolak.
• OKI, perlu:
– Dilakukan di bawah kondisi aseptis dan prosedur
kerja yang aseptis
– Monitoring lingkungan dlm hal: cemaran mikroba di
udara dan di permukaan (viable microbial air and
surface count).
 Positif Palsu
• Faktor kritis yang berkontribusi pada
terjadinya hasil positif palsu adalah:
– Pekerja
– Lingkungan
 Pekerja
• Memenuhi kualifikasi
• Terlatih
• Tervalidasi (Melakukan simulasi uji
sterilitas tanpa terjadi positif palsu.
Simulasi dilakukan di bawah kondisi yang
kurang ideal)
 Lingkungan
• Scr ketat dikendalikan sbg lingkungan
aseptis.
• Merupakan clean room,
– dialiri udara laminar yg telah difilter dg HEPA
filter yg microbial retentive.
– bertekanan udara positif thd lingkungan
– memiliki spesifikasi pertukaran udara ruang
per jam (room air changes)
 Clean Room
• Kualifikasi pd instalasi Clean Room baru
– Room air filter integrity tests.
– Determination of air velocity at the face of
each air inlet filter.
– Room air change rate.
– Room air particle counts.
– Room air pressure differentials and air flow
patterns.
– Lighting, heating, humidity.
 Clean Room
• Kualifikasi pd instalasi
Clean Room baru (lanj.)
– Work station(s) air filter
efficiency tests.
– Determination of air velocity
at face of work station air
– Particle counts within work
station areas.
 Clean Room
• Regular Re-test Program
– Room and Work Station Air Filter Tests: Repeat at
least annually, unless results of normal in-process
monitoring indicates a need for more frequent, or
additional testing.
– Air Velocity and Room Air Changes: Repeat at least
twice a year.
– Air Particle Counts: Determine as part of regular in-
process monitoring, with formal certification by a
competent specialist agency 3 times per year.
 Clean Room
Maintenance
• Room pressure differentials should be
monitored on a continuous, on-going,
basis
• Walls, floors, work stations and surfaces
generally should be subject to a
predetermined program of cleaning and
disinfection.
 Clean Room
Maintenance
• In-process Control and Monitoring
– Environmental Particulate
– Microbiological
– Filter Integrity Testing
 Negatif Palsu
• Hasil negatif palsu terjadi jika suatu
sampel yang tidak steril ternyata tidak
menunjukkan adanya pertumbuhan m.o.
pada uji sterilitas.
• Hal ini bisa terjadi jika media yang
digunakan pada uji sterilitas tidak
mendukung pertumbuhan bakteri yang
ada dalam sampel.
Media
Bakteri Aerob dan Anaerob
--Media pertumbuhan

• Bakteri akan tumbuh subur bila berada

dlm medium cair yg cocok yg
mengandung makanan yg sesuai
• Media cair dpt dibuat padat dg
penambahan gelatin atau, yg lbh umum,
agar
• Media pertumbuhan yg “canggih”
mengandung ekstrak daging, ekstrak
yeast, glukosa dan garam2
Bakteri Aerob dan Anaerob
--Media pertumbuhan
• Uji sterilitas mensyaratkan organisme
pencemar tumbuh sampai medium cair
terlihat jelas berkabut (cloudy)
• Biasanya inkubasi 24 jam pd atau
mendekati suhu 37oC cukup utk
menghasilkan bukti adanya pertumbuhan
• TAPI, bakteri terdiri atas dua golongan
besar: bakteri yg tumbuh baik pd kondisi
adanya oksigen atau udara (aerob) dan yg
tdk (anaerob)
Bakteri Aerob dan Anaerob
--Media pertumbuhan
• Sebagian mikroorganisme patogen yg sgt
berbahaya, spt Clostridium sporogenes,
adalah anaerobik shg perlu ada uji thd
kemungkinan keberadaannya  perlu
media anaerobik
• Media anaerobik awal dibuat dg
menginkubasinya dg gas nitrogen
• Media anaerobik yg lebih mutakhir dibuat
dg penambahan Na tioglikolat utk
memberi kondisi anaerobik
 Media
(USP <71> Sterility Tests)

Media sodium tioglikolat

utamanya utk menumbuhkan bakteri
anaerob, tp jg bs mendeteksi bakteri aerob
Soybean casein digest
menumbuhkan bakteri aerob dan fungi

Uji sterilitas akan mendeteksi baik bakteri maupun

fungi sehingga tidak diperlukan uji tersendiri
untuk mendeteksi fungi
 Media – suhu inkubasi
USP <71> states that
• the Fluid Thioglycollate Medium must be
incubated between 30°C and 35°C, and
that
• the Soybean-Casein Digest Medium must
be incubated at a temperature between
20°C and 25°C.
 Media
(Suitability Test)
Sebelum digunakan, media harus lolos
Suitability Test
• Media harus steril pada inkubasi dengan
suhu yg ditentukan selama 14 hari
• Media harus mendukung pertumbuhan
kurang dari 100 m.o. viabel—the Growth
Promotion Test.
 Media
Suitability Test
• Jika digunakan pre-made growth media,
produsen harus memberikan Certificate of
Quality yang menunjukkan bahwa batch
media tersebut telah lolos suitability test,
• tapi, akan lebih baik jika laboratorium
pengguna melakukan melakukan cek
ulang dengan Growth Promotion Test
mereka sendiri.
Media - Validasi
--Inhibitor
• Validasi perlu dilakukan dlm uji sterilitas
• Validasi hrs bisa menunjukkan bahwa produk yg
diuji tdk menginhibisi (menghambat)
pertumbuhan m.o. pencemar yg umum, spt:
Bacillus subtilis, Candida albicans,
Staphylococcus aureus, Serratia marcescens
atau Pseudomonas sp
• Jika terdapat inhibisi (misal, pd produk
antibiotika), maka perlu ada cara utk mengatasi
aktivitas antibakteri tsb dan divalidasi dg
menunjukkan bahwa pertumbuhan kontaminan
tdk terhambat
Media - Validasi
--Inhibitor
• Dlm banyak kasus, pengenceran thd
produk cukup memadai, namun biasanya
juga digunakan senyawa antagonis
– Bahan pengawet merkuri dihambat oleh
tioglicolat sendiri
– Penisilin2 dihambat oleh penambahan
penisilinase steril
Senyawa inhibitor Senyawa inaktivasi
Fenol Pengenceran
Alkohol Pengenceran
Paraben Pengenceran
Merkuri -SH
Amonium kuarterner Lesitin dan tween
Benzilpenisilin Beta laktamase
Ampisilin Beta laktamase
Kloramfenikol Kloramfenikol
asetiltransferase
Antibiotik lain Membran filtrasi
Media - Validasi
--Inhibitor
Definisi
• Stasis: inability of m.o. to grow and
proliferate in microbiological media.
• Media that is bacteriostatic does not
necessarily kill bacteria; it simply may
retard bacterial growth and proliferation.
Media - Validasi
--Inhibitor
• Uji validasi mirip dengan Suitability Test,
hanya sampel produk ditempatkan di
media bersama dengan mikroorganisme.
• Pertumbuhan m.o. yg tjd dg adanya
sampel dibandingkan dg kontrol tanpa
sampel uji.
• Jika hasil uji menunjukkan adanya
pertumbuhan pada sampel dan pada
kontrol, maka uji tersebut valid.
• Suitability, validation and sterility tests can
be performed simultaneously.
 Media
(Penyimpanan)
• Jika media disimpan di dalam wadah unsealed,
maka media tsb bisa digunakan lagi dalam 1
bulan of the time of use asalkan media tsb diuji
growth promotion dan asalkan memenuhi
persyaratan indikator warna.
• Jika disimpan di dalam wadah yang kedap,
media bisa digunakan dalam jangka 1 tahun,
asalkan dilakukan uji growth promotion dalam 3
bulan of the time of use.dan asalkan memenuhi
persyaratan indikator warna.
Jumlah sampel uji
Jumlah sampel uji (lanjutan)
 Jumlah sampel yg diuji dlm
kaitannya dg jumlah tiap batch
Metode Pengujian
• Cara lama (pd dressing):
– Mengambil dressing dr bungkus dg forsep
dan merendamnya di dlm medium, kmd
menginkubasinya
– Blm digunakan cara khusus spt penggunaan
laminar flow hood
– Sering tjd hasil positif palsu (false positive)
– Jika tjd hasil positif dilakukan resampling thd
lot tsb dg sampel yg lebih besar
– Jika tjd lagi hasil positif pd re-tes, lot tsb
dianggap terkontaminasi
• Cara mutakhir
– Lebih tdk ambigu (lebih pasti)
– Identifikasi spesies kontaminan
• Bakteri dpt ditumbuhkan pd media ttt dan bbrp jenis
mpy bentuk koloni yg khas atau pigmentasi yg
karakteristik ketika ditumbuhkan pd media padat
• Yg paling umum adl uji berdasarkan kemampuan
iodin mewarnai dinding sel, yi uji Gram
• Dg uji gram bakteri terbagi mjd dua kelompok besar:
bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif
• Dengan mengembangkan seri pengujian:
bentuk koloni, pertumbuhan menyebar
atau homogen, warna, produksi gas,
kemampuan memfermentasi glukosa,
warna gram, aerob atau anaerob dll,
bakteria bisa diidentifikasi scr luas dan
cepat.
 Metode Pengujian
Membrane Filtration
• USP <71> menyatakan, “The technique of
membrane filtration is used whenever the nature
of the product permits.”
• Kebanyakan preparat sediaan farmasi bisa diuji
dengan teknik filtrasi membran karena
tersedianya berbagai jenis filter yang kompatibel
dan suitable untuk berbagai produk.
• Bahkan sediaan krim atau padat yang larut
dalam rinsing fluid yang ditentukan atau dalam
isopropil miristat steril dipersyaratkan untuk diuji
dengan menggunakan filtrasi membran.
 Metode Pengujian
Membrane Filtration
• Konsepnya adalah bahwa mikroorganisme
akan terkumpul pada filter membran
dengan ukuran pori 0,45 µm. Filter tsb
kemudian ditransfer ke media.
• Media:
– Fluid thioglycolate medium (FTM) (anaerob)
– Soybean casein digest medium (SCDM)
(aerob)
 Metode Pengujian
Membrane Filtration
• Filter yang digunakan kemudian diinkubasi di
dalam kedua media kultur (aerob dan anaerob)
pada suhu yang ditentukan selam 14 hari.
• Pengujian yang diakhiri kurang dari 14 hari
dianggap tidak valid kecuali dalam kasus
terjadinya hasil positif, yaitu terdapatnya
pertumbuhan mikroorganisme yang
menunjukkan bahwa preparat yang diuji tidak
steril.
 Metode Pengujian
Direct Transfer
• Method of choice for medical devices.
• The entire product should be immersed in
test fluid. With large devices, patient
contact area should be immersed.
• Large catheters can be syringe filled with
test media prior to immersion, or cut to
allow for complete immersion.
 Metode Pengujian
Direct Transfer
• Media: FTM and SCDM in separate
containers.
• The USP limits the media volume to 2500
mL.
• After transferring, the samples are
incubated for 14 days.
Validasi
--Kekeruhan
• Pertumbuhan bakteri termanifestasi dg
meningkatnya turbiditas (kekeruhan)
medium
• Perlu diketahui apabila produk yg diuji
menyebabkan reaksi presipitasi dg
medium
• Misalnya pd preparat2 fosfat
Validasi
--Kekeruhan
• Jika ada keraguan thd hal ini, medium bisa
diuji dg mencelupkan kawat loop ke dlm
medium dan mengoleskan tetesan cairan
medium tsb ke atas medium padat steril
sebelum inkubasi lebih lanjut utk
menetapkan ada-tidaknya mikroorganisme
• Atau, pada interval ttt selama masa inkubasi
(biasanya 3, 7 dan 14 hari), kedua media
diamati kalau terbentuk kekeruhan dan/atau
pertumbuhan m.o.
• Jika preparat uji menyebabkan media mjd keruh
shg ada atau tidak adanya pertumbuhan m.o.
sukar ditentukan secara visual, maka 14 sejak
mulai inkubasi sebagian dari medium ditransfer
ke wadah yang berisi medium yang sama,
kemudian media asal dan media yg ditransfer
diinkubasi selama tidak kurang dari 4 hari.
• Jika tidak teramati adanya pertumbuhan
m.o. Maka preparat tsb memenuhi syarat
uji sterilitas (lolos).
• Jika teramati adanya pertumbuhan m.o.
maka preparat tsb tdk memenuhi syarat
sterilitas dan gagal dalam uji sterilitas tsb.
Uji sterilitas dianggap tidak valid jika terdapat
situasi sbb:
• Monitoring mikrobiologis thd fasilitas yg ada
menunjukkan kondisi yang jelek.
• Telaah/tinjauan terhadap prosedur pengujian
selama pengujian menunjukkan hasil yang jelek.
• Ditemukan pertumbuhan bakteri pada kontrol
negatif
• Identitas mikroba yang diisolasi dari pengujian
secara menyakinkan menunjukkan adanya
kegagalan dalam prosedur uji.
Dalam kasus demikian, pengujian bisa diulang.
Metode lain

• Perlunya bakteri pencemar utk tumbuh

sampai bisa terlihat oleh mata telanjang,
baik krn meningkatnya kekeruhan pd
medium cair atau koloni pd medium padat
berarti diperlukan bbrp hari inkubasi
sebelum bisa didapatkan hasil  alternatif
Metode lain

• ATP-luciferin/luciferase
– Adanya ATP sbg sumber energi sel bisa
menjadi indikator kontaminasi bakteri melalui
reaksi dg luciferin/luciferase yg menghasilkan
cahaya yg bisa diukur
– Perlu minimum 2000 sel bakteri untuk bisa
terdeteksi  perlu konsentrasi dr volume
bahan yg besar
– Luciferin/luciferase berasal dari kunang2
(fireflies)
Metode lain

• Radiolabelling
– Penggunaan glukosa berlabel 14C oleh
organisme dan deteksi 14CO2 selama waktu
inkubasi
– Digunakan pd kontaminasi bakteri pd sampel
darah
– Sensitif
– Problem: disposal of the label, shg tdk
digunakan scr luas
Metode lain

• Jejak pirogen
– Banyak bakteri yg melepaskan bahan2
pirogenik, berupa pirogen atau endotoksin
– Bahan2 tsb menimbulkan reaksi demam
– Aktivitas biologis bahan2 tsb tdk hilang oleh
sterilisasi
– Shg, priogen merupakan indikator yg sensitif
bagi keberadaan bakteri