ELISA

ELISA
(Enzyme-linked-immunosorbent assay)
Salah satu metode imunoassay yang digunakan untuk
deteksi:
•Antibodi
•Protein
•Peptida
•Biomolekul
 Imunoassay
• Immunoassay berasal dari kata “immuno”
(=secara imunologi) dan “assay” (=kemurnian
suatu substansi/jumlah konstituen dalam
suatu campuran).
 Kenapa disebut Enzyme Linked
Immunosorbent Assay?
1. Antigen/antibodi yang diinginkan diabsorbsi
ke permukaan plastik (‘sorbent’)
2. Antigen dikenali oleh antibodi spesifik
(‘immuno’)
3. Antibodi ini dikenali oleh antibodi kedua
(‘immuno’) yang ditempeli oleh enzim
(‘enzyme-linked’)
4. Substrat bereaksi dengan enzim untuk
memproduksi produk, berupa warna
Dalam pengertian sederhana:
•sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan
pada suatu permukaan  antibodi spesifik
dicucikan pada permukaan tersebut  sehingga
akan berikatan dengan antigennya.
•Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada
tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat
diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat
dideteksi.
Komponen Penting dalam Imunoassay
• Antibodi (antiserum)
• Antigen
• Labeling material
 Antibodi (antiserum)
• Antibodi: protein yg diproduksi oleh sistem
imun untuk melawan antigen
 Antigen
• Antigen: molekul yang menginduksi produksi
antibodi ketika dikenali oleh tubuh
• Apapun yang asing bagi sistem imun, misal:
bakteri, virus, dll
 Labeling Material
• Diperlukan adanya marker untuk mengetahui
ikatan antigen-antibodi
• Marker tidak boleh mengganggu ikatan
 Komponen kit
• Pre-coated, stabilized 96-well microtiter
• Plate
• Sample diluent
• Standard and controls
• Conjugated detection antibody
• 10x wash solution
• Substrate
• Stop solution
 Prinsip Dasar ELISA
1. Antigen/sampel ditambahkan ke plate
2. Blocking buffer ditambahkan untuk
menghalangi tempat pengikatan
protein
3. Tambahkan antibodi primer yang
sesuai
4. Tambahkan konjugat antibodi
sekunder-enzim yang sesuai yang
mengenali dan berikatan dengan
antibodi primer
5. Tambahkan substrat TMB yang akan
dikonversi oleh enzim menjadi bentuk
yang terdeteksi
 Keuntungan ELISA
• Reagen, waktu simpan lama
• Spesifitas dan sensitivitas ELISA tinggi
• Mudah dilihat hasilnya dan prosedur cepat
• ELISA dapat digunakan untuk berbagai infeksi
 Kekurangan ELISA
• Pengukuran aktivitas enzim jauh lebih kompleks
dibandingkan pengukuran aktivitas dengan
menggunakan radioisotop
• Aktivitas enzim dapat terpengaruh oleh
konstituen plasma
• Kit tersedia secara komersial, tapi tidak murah
• Sangat spesifik untuk antigen tertentu. Tidak
akan mengenali antigen lain
• Bisa terjadi positif/negatif palsu, terutama
dengan antigen yang termutasi.
 Tipe ELISA
1. Direct ELISA
2. Indirect ELISA
3. Sandwich ELISA
4. Competitive ELISA
 Tahapan ELISA
1. Inkubasi dengan sampel uji
100 μL sampel uji atau standar dalam buffer
ditambahkan ke tiap well.
Tutup plate dan inkubasi pada suhu ruang selama 2
jam.
2. Cuci
3. Lapisi well dengan antibodi
100 μL antibodi yang terlarut dalam buffer ditambahkan ke tiap
well.
Tutup plate dan inkubasi pada 4 °C semalaman.
4. Cuci
 Tahapan ELISA
5. Inkubasi dengan enzim-antibodi terkonjugasi
100 μL enzim-antibodi terkonjugasi dalam buffer ditambahkan ke tiap well.
Tutup plate dan inkubasi pada suhu ruang selama 1 jam.
6. Cuci
7. Pembentukan warna
100 μL substrat kromogenik ditambahkan pada tiap well.
Tutup plate dan inkubasi 15 menit, hingga terbentuk warna yang sesuai. Plate
sebaiknya dihindarkan dari cahaya selama inkubasi.
8. Penghentian pembentukan warna
Pengentian reaksi dengan menambahkan 100 μL 0.5M H2SO4 pada tiap well.
9. Membaca hasil
Baca hasil secara langsung melalui bagian bawah plate menggunakan fotometer
(ELISA reader) otomatis atau semi-otomatis. Panjang gelombang yang
direkomendasikan antara 620-650 nm.
 Fluoresensi dalam ELISA
• Saat cahaya dengan panjang gelombang  tertentu
disinarkan pada suatu sampel, kompleks
antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga
jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan
berdasarkan besarnya fluoresensi dengan
menggunakan spektrofotometer.
 Spektrofotometer
• Spektrofotometer : sebuah alat yang dapat mengukur
jumlah dari cahaya yang menembus sumuran dari
microplate.
• Kompleks antigen-antibodi yang kita buat pada well
microplate akan memberikan perubahan warna pada
cairan tersebut, sehingga akan memberikan optical
density yang berbeda.
• Optical density dapat dinyatakan meningkat atau
menurun berdasarkan pengenceran material standart,
sehingga akan menghasilkan kurva dose-response yang
nantinya akan digunakan untuk mengestimasi kadar
protein tersebut.
 Kurva Standar ELISA
• Bentuk kurva standar tergantung pada skala X dan Y.
• Kurva standar ELISA dibuat dengan memplot konsentrasi
standar pada X dan absorbansi pada Y, pada skala normal
akan terbentuk garis linier kecuali pada area dengan
konsentrasi rendah.
Hasil
TERIMA KASIH