ELISA

(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Kelompok 1 :
• Kiki Rahayu Mi’raj 1010181038
• Dewi Citra Astina 1010181027
• Dinda Nurlinda 1010181100
• Nada Sal Sabila 1010181177
 Definisi ELISA
Enzyme – Linked Immunosorbent Assay ( ELISA) adalah
suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam
bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau
antigen dalam suatu sampel.

tes immunochemical cepat yang melibatkan sebuah enzim

( protein yang mengkatalisis suatu reaksi biokimia ) dan
melibatkan antibodi atau antigen ( kekebalan molekul )

Tes ELISA digunakan untuk mendeteksi zat yang memiliki

sifat antigenic , terutama protein (sebagai lawan dari
molekul kecil dan ion seperti glukosa dan kalium . Beberapa
di antaranya adalah hormon , bakteri dan antibodi
 Tujuan ELISA
1. Mampu memahami dan menjelaskan mengenai teknik ELISA.
2. Memahami prinsip kerja teknik ELISA
3. Mampu melakukan metode pemeriksaan kuantitatif plasma dan serum darah
dengan teknik Elisa.
4. Mampu melakukan pemeriksaan kuantitatif human preAlbuminterhadap plas
ma darah dengan teknik ELISA
5. Mampu membuat grafik dari pengenceran standar dan memperoleh rumus pe
rsamaan perhitungan konsentrasi sampel dengan regresi linier.
 Aplikasi teknik ELISA

- Pemeriksaan donor darah untuk pembuktian adanya kontaminasi virus :

 HIV-1 dan HIV-2 (keberadaan antibody anti-HIV)
 Hepatitis C (presence of antibodies)
 Hepatitis B (tes untuk keberadaan antibody dan antigen virus)
 HTLV-1 dan HTLV-2 (keberadaan antibody)

- Pengukuran level hormone :

 hCG (sebagai test kehamilan)
 LH (menentukan waktu ovulasi)
 TSH, T3, dan T4 (untuk fungsi thyroid)
 Aplikasi teknik ELISA

- Pendeteksian infeksi :
 Agen penularan secara seksual, HIV, syphilis, dan Chlamydia
 Hepatitis B dan C
 Toxoplasma gondii

- Pendeteksian bahan allergen pada makanan dan debu rumah

- Pendeteksian keberadaan zat obat-obatan terlarang, seperti:

 Cocain
 Opium
 -9-tetrahydrocannabiol, campuran aktif pada marijuana
 Prinsip ELISA
1. Antigen/sampel ditambahkan ke plate
2. Blocking buffer ditambahkan untuk menghalangi
tempat pengikatan protein
3. Tambahkan antibodi primer yang sesuai
4. Tambahkan konjugat antibodi sekunder-enzim
yang sesuai yang mengenali dan berikatan
dengan antibodi primer
5. Tambahkan substrat TMB yang akan dikonversi
oleh enzim menjadi bentuk yang terdeteksi
Reaksi metode ELISA :
Ag(serum) + AbE  Ag- AbE komplek  cuci
 Tipe metode ELISA

1.Direct ELISA
• Biasanya digunakan dengan kompetensi dan inhibisi ELISA
• Deteksi antigen
2.Indirect ELISA
• Ag terikat pada plete , deteksi antibodi
3. ELISA kompelitif
• Antihuman terikat pada plate ,deteksi Ab
 Tipe metode ELISA

4. Sandwich ELISA
• Ab terikat pada plete , Deteksi Ag
• Antigen dilekatkan pada permukaan benda padat
• Spesimen yang mengandung antibodi direaksikan dengan antigen tersebut
• Antiimunoglobulin yang dilabel enzim dimasukkan kemudian diinkubasi.
• Dimasukkan substrat kromogenikyang selanjutnya dihidrolisis oleh enzim
yang terdapat pada komplek. Banyaknya substrat yang hidrolisis sesuai
dengan banyaknya enzim yang terdapat kompleks,sehingga dapat dipakai
sebagai parameter kadar antibodi dalam spesimen.
 Tahap Pra-Analitik

 Identitas pasien (nama,umur, jenis kelamin)

 Persiapan pasien (puasa, istirahat, makan yang cukup)
 Pengecekan form pemeriksaan yang diminta
 Teknik pengambilan sampel
 Persiapan alat dan bahan pemeriksaan ELISA
 Kompenen ELISA

•Plate mikrotiter /solid phase portion of assay.

•Konjugate (suatu AB yang berlabel enzim)
•Substrate ( Substansi yang akan mengaktifkan enzim setelah
berkaitan dengan bagian aktif enzim terjadi perubahan warna ).
•Buffer pencuci /detergen (washing buffer)
•Stop solution
 Kompenen Kit ELISA :

•Pre-coated,stabilized 96-well microtiter

•Plate
•Sampel diluent
•Standar dan kontrol
•Conjugated detection antibody
•Substrate
•Stop solution
 Tahap Analitik

 Melakukan pemeriksaan secara otomatis ataupun manual

 Pengiriman sampel secara tertutup
 Reagen harus telat diuji dengan baik sesuai dengan standart
yang ditentukan
 Peralatan dikalibrasi secara berkala
 Hasil dikeluarkan dan dilakukan pembacaan
 Prosedur kerja

a. Pendeteksian antibody dengan ELISA indirect:

1.   Melapisi mikrotiter plate dengan antigen yang sudah dimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan
selama 30-60 menit.
2.  Membilas antigen yang tidak terikat dengan buffer.
3.  Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen
dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik (seperti larutan susu
bubuk).
4.  Membilas protein yang tidak melekat.
5.  Menambahkan sampel serum yang akan dideteksi antibodinya dan
membiarkan antibody spesifik untuk berikatan dengan antigen.
6.  Membilas antibody yang tidak terikat.
 Prosedur Kerja

7.  Menambahkan anti-Ig yang akan berikatan pada daerah Fc pada antibody yang spesifik
(sebagai contoh, anti-rantai gamma manusia yang berikatan dengan IgG manusia). Daerah
Fc pada anti-Ig akan berikatan secara kovalen dengan enzim.
8.  Membilas kompleks antibody-enzim yang tidak terikat.
9.  Menambahkan substrat chromogenic:substrat yang tidak berwarna yang terikat ke enzim
akan dikonversi menjadi produk.
10. Inkubasi sampai muncul warna, dan
11. Ukur dengan spectrometer. Jka semakin pekat warna yang dideteksi, maka makin besar
kadar antibody spesifik dalam sampel.
 Prosedur Kerja

b. Pendeteksian antigen dengan ELISA sandwich:

1.   Melapisi mikrotiter plate dengan antibodi yang sudah dimurnikan dengan
membiarkan larutan berisi antigen menempel pada dinding/ permukaan
selama 30-60 menit.
2.  Membilas antibodi yang tidak terikat dengan buffer.
3.  Melapisi sisi-sisi tertentuyang mungkin tidak spesifik dilekati oleh antigen
dengan protein yang tidak berhubungan/ tidak spesifik.
4.  Membilas protein yang tidak melekat.
5.  Menambahkan sampel yang akan dideteksi antigennya dan membiarkan
antibodi untuk berikatan dengan antigen spesifik dari sampel.
6.  Membilas antigen yang tidak terikat.
 Prosedur Kerja

7.  Menambahkan antibody yang telah terlabeli dengan enzim dan bersifat
spesifik untuk epitope yang berbeda pada antigen sampel, sehingga
terbentuk sandwich.
8.  Membilas antibody-enzim yang tidak terikat.
9.  Menambahkan substrat chromogenic: substrat yang tidak berwarna yang
terikat ke enzim akan dikonversi menjadi produk.
10.   Inkubasi sampai muncul warna.
11. Ukur dengan spektrofotometer. Jika semakin pekat warna yang terdeteki,
maka makin besar kadar antigen spesifi dalam sampel.
 Tahap pasca Analitik
 Pembacaan dan pencatatan hasil pemeriksaan
 Pelaporan hasil pemeriksaan kepada dokter / yang bersangkutan
 Hasil terbaca di alat secara otomatis/computer
 Komputer dapat memantau pasien terhadap nilai acuan
 Komputer dapat memantau semua informasi termasuk hasil, QC, dan pemeliharaan
serta pekerjaan alat

INTERPRETASI HASIL PEMERIKSAAN ELISA

o Hasil secara kualitatif  perubahan warna pada well plate yang mengindikasikan bahwa
terjadi reaksi yang spesifik antara antigen dengan antibody. Perubahan warna tersebut
dihasilkan oleh reaksi antara substrat dengan enzim yang terdapat di anti-antibody.
o Hasil secara kuantitatif  OD (optical density)
KEUNTUNGAN METODE ELISA
1. Reagen, waktu simpan lama
2. Spesifitas dan sensitivitas ELISA tinggi
3. Mudah dilihat hasilnya dan prosedur cepat
4. ELISA dapat digunakan untuk berbagai infeksi
5. ELISA jenis immunoassay yang bersifat kuantitatif
6. ELISA dapat mengetahui konsentrasi antigen dan anttibodi secara tepat

KEKURANGAN METODE ELISA

1. Pengukuran aktivitas enzim jauh lebih kompleks dibandingkan pengukuran
aktivitas dengan menggunakan radioisotop
2. Aktivitas enzim dapat terpengaruh oleh konstituen plasma
3. Kit tersedia secara komersial, tapi tidak murah
4. Sangat spesifik untuk antigen tertentu. Tidak akan mengenali antigen lain
5. Bisa terjadi positif/negatif palsu, terutama dengan antigen yang termutasi
6. Waktu pengerjaan pemeriksaan ELISA cukup lama
THANK YOU