Western Blot

Teknik Western blot biasanya digunakan untuk medekteksi protein yang diinginkan berdasarkan
gabungan protein dan penggunaan teknik ini sangat banyak digunakan sebagai sarana diagnostic
bermacam penyakit infeksi
Seperti HIV dapat didiagnostik menggunakan western Blot, Jadi western blot menjadi sangat penting
dalam penelitian dasar

- Cara kerja western blot :

 Ambil sel yang sudah dilisiskan atau ektraksi protein atau ektraksi bakteri dari apapun yang
akan diambil proteinnya
 protein terpisahkan berdasarkan berat molekul di dalam gel SDS-page,pemisahan tingkat
pertama dilakukan SDS page dalam kondisi ini protein terpisah menurut berat molekulnya
sehingga didapatkan pita yang berbeda-beda dari sampel protein untuk menegtahui
ketepatannya setelah running diwarnai dengan coomassie blue.
 Tahap kedua yaitu transfer protein ke PVDF membrane sehingga dapat mendetekdi protein
yang diinginkan.misalnya ukurannya kira-kira 75 kb protein yang diinginkan telah dikataui,
tapi jika ada protein lain ukuranya sama75 kb bisa ada pada sampel protein.Hal tersebut dapat
ditangani dengan cara gel diletakkan dalam transfer apparatus simpan SDS gel dan diatasnya
letakkan pvdf membrane kemudian transfer dilakukan secra kimia atau medan listrik,yang
paling banyak menggunakan medan listrik atau darah yang berikan dengan electron sebagai
hasilnya protein akan ditransfer dan berada dimembran.Semua protein yang berada dalam
membrane mulai dapat didteksi sesuai dengan protein target dilakukan dengan antibody
spesifik. Dimana antibodyspesific tersebut dapat mendeteksi protein target.Antibody yang
dugunakan adalah anitoby monoclonal dan tidak spesifik untuk protein lain tapi hanya
spesifik untuk protein target saja
 Pada membrane terdapat beberapa tipe protein,antibody akan mengikat protein tertentu sesuai
target.Ikatan protein dapat menngunakan
-colorimetric
-Chemiluminescense
-flourescence

Tujuan dari poliakrilamida gel elektroporesisi atau page adalah memisahkan protein menurut
ukuran,bentuk dan muatan
Matrik terdiri dari protein yang dapat lewat,protein yang lebih kecil melewati matriks lebih cepat
dibandingkan dengan protein yang ukurannya lebih besar.Suatu matriks ada catalis dan agen polymerase
ditambahkan kelarutan yang mengandung dua camouran acrilamida berbeda yaitu acrilamida dan
bisacrilamida.katalis dan agen polymerase mempercepat formasi dari single cain polymerase dari
asrilamida,formasi gel terdiri dari bisakrilamida menghubungkan antar molekul polikramida
Ukuran ruang yang dibuat dalam matriks gel adalah kebalikan dengan jumlah dari acrilamida yang
digunakan di dalam gel solution.percentasi akrilamida yang sedikit di gel solution menghasilkan jarak
yang luas di matrik poliakrilamida dan pemisahan protein besar yang lebih besar,untuk memisahkan
protein yang kecil dengan persentasi akrilamida yang tinggi di gel solution,mengahasilkan jarak yang
kecil di matriks dan terpisah lebih bagus dari protein dengan berat molekul rendah.
Dalam PAGE,gel solution berisi senyawa akrilamida,katalis dan agen polimerase terdapat sumuran.Gel
yang sudah dibuat dimasukkan kedalam chamber diisikan buffer untuk mengkonduksi arus melewati
gel,dibagian atas terdapat elektroda bermuatan negative dan bermuatan positif berada di bawah
Beberpa jenis gel poliacrilamida elektroporesis atau PAGE yang sering digunakan ada 2 yaitu
1.tidak denaturasi atau native PAGE
2.Denaturasi atau SDS-PAGE
Prosedur SDS PAGE:
-masukkan sampel protein dalam diding(sumuran)
-tambahkan buffer mengandung gliserol,bermuatan negative,bromophenol blue
-proses elektroforesis berlangsung membutuhkan protein ladder untuk menentukan ukuran protein dan
sampel protein akan bermigrasi di gel dari kutub negative ke kutub positif
-gel menjadi terwarnai dapat memvisualisasikan protein yang terpisah
Transfer bloting dan visualisai adalah proses lanjutan untuk memdekteksi dan visulisasi protein atau
molekul spesifik. Transfer diperlukan antibody untuk mengikat protein,metode transfer yang banyak
digunakan dalam western blotting adalah alectroelution yang memiliki medan elektrik yang memfasilitasi
migrasi protein dari gel ke membran dari kutub negative pada gel ke kutub posisti yang ada pada
membrane.
2D gel elektroforesis terdiri dari 2 parameter yaitu
1. 1D Gel elektroforesis yaitu memisahkan berdasarkan titik isoelektrik
Kekurangannya ukuran protein yang diharapkan kemungkinan memiliki ukuran yang hampir
sama dengan protein lain,untuk itu dibutuhkan parameter kedua untuk mengakuratkan ukuran
protein tersebut
2. 2D gel elektroforesis yaitu memisahkan berdasarkan berat molekul,muatan keseluruhan protein
adalah fungsi pH lingkungan tetap pada pH= PI dengan mobilitas protein adalah 0.
-Protein akan terpisah sesuai dengan berat molekulnya karena adanya medan listrik
-protein akan terkonsentrasi berdasarkan ukuran dan muatan
- protein yang sudah terpisah di IPG strip dimasukkan ke gel kedua akan terbentuk noda
HPLC(Hight Peformance liquid Chromatography)
HPLC biasanya kromatografi kollom yang dimodifikasi di kromatografi yang diinginkan
Komponen dari HPLC :

- Kolum yang terbuat dari stainless yang dapat menahan tekanan

- Fase diam terbuat dari bahan absorbent merupakan partikel dengan ukuran yang kecil,silica gel
dan benzene yang dimodifikasi secara kimia
- Fase gerak terdiri dari campuran larutan yang berbeda(polar dan non polar) tergantung jenis
sampel
- Detector akan mendekteksi sampel pada kolom, jenis- jenis detertor beragam seperti
UV,IR,Fluoresence detector,dll.Biasanya deteltor terhubung dengan computer untuk menyimpan
data
 Mekanisme kerja HPLC
 Larutan sampel diinjeksikan melalui injektor dan terbawa oleh fase gerak melewati fase diam
pada kolom , kemudian hasilnya dibaca oleh detektor dan ditampilkan pada pengolah data sebagai
kromatogram
- HPLC running the standard biasanya dapat digunakan untuk mendeteksi sampel sukrosa,glukosa
dengan syarat harus memiliki standart dan HPLC menunetukan kosentasi sampel
Jenis – jenis HPLC :
a. Normal fasa :Senyawa polar dalamcampuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika
yang polar dibanding dg senyawa senyawa non polar,sehingga senyawa non polar akan lebih cepat
melewati kolom.
- Fase diam => polar
- Fase gerak => non polar
b. Terbalik fasa :adalah kebalikan dari Normal fasa,molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui
kolom
- Fase diam => non polar
- Fase gerak => polar
c. Size exclusion :molekul kecin memasuk pori-pori sedangkan molekul besar tetat diluar
- Fase diam => berpori
-