ANALISA PRODUK

REKOMBINAN
 DETEKSI DNA REKOMBINAN
1. Deteksi kimia fisik
– Spektrofotometri UV
Spektrofotometri sinar UV digunakan untuk mengukur tingkat kemurnian DNA hasil isolasi.
Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi radiasi elektromagnet
2.Elektroforesis gel agarosa
– Kebenaran ukuran
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan
ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Posisi molekul yang terpisah pada gel dapat
dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer
3.DNA sekuensing
◦ Kebenaran urutan nukleotida (DNA sekuenser otomatis)
 Quantifying DNA: Spectrophotometry

• Maximum absorption of DNA at 280 nm

• Convert absorption to OPTICAL DENSITY
(OD)
• OD = absorption X dilution factor
• 1 OD = 50 mg dsDNA per ml
• Generally need large sample size

Images from Wikipedia

Analisa produk DNA rekombinan
 Berbasis protein
 Berbasis asam nukleat (DNA/RNA)
1.Berbasis protein
Analisa berbasis Protein
 Penentuan kadar,
 Penentuan urutan asam amino,
 Pemetaan peptida
 Elektroforesis (SDS-PAGE PAGE natif,
elektrofocusing, dua dimensi
 Western blot.
Analisa berbasis DNA
 Sekuensing,
 Hibridisasi.
I.Penentuan Kadar Protein

1 Metode Kjeldahl,
2. Metode titrasi formol,
3. Metode Lowry,
4. Metode spektrofotometri visible
(Biuret) dan spektrofotometri UV
Penentuan kadar protein:

 Analisis protein dapat digolongkan menjadi dua metode, yaitu:

Metode konvensional, yaitu metode Kjeldahl (terdiri dari
destruksi, destilasi, titrasi), titrasi formol. Digunakan untuk
protein tidak terlarut.

 Metode modern, yaitu metode Lowry, metode

spektrofotometri visible, metode spektrofotometri UV.
Digunakan untuk protein terlarut.
 Penentuan Kadar Protein
Metode Kjeldahl

Penetapan
nitrogen total
pada asam
amino, protein,
dan senyawa
yang
mengandung
nitrogen.
 Penentuan Kadar Protein
Metode Kjeldahl

Ada 3 tahapan dlm metode ini:

 Tahap destruksi
 Tahap Destilasi
 Tahap Titrasi
 Penentuan Kadar Protein
Metode Kjeldahl : Tahap Destruksi

• Tujuan : melepaskan nitrogen dari protein

• Sampel dipanaskan dalam larutan asam sulfat
pekat
• Unsur C dan H teroksidasi menjadi H2O, CO2, CO
• Unsur N berubah menjadi ammonium sulfat
(NH4)2SO4
• Asam sulfat juga mendestruksi Karbohidrat dan
lemak
 Penentuan Kadar Protein
Metode Kjeldahl : Tahap Destilasi

• Dilakukan dengan menambahkan NaOH

• Pada tahap ini ammonium sulfat dipecah
menjadi ammonia.
• Amonia yang dibebaskan ditampung dalam
larutan asam standar biasanya HCl atau asam
borat 4% yang jumlahnya berlebihan.
 Penentuan Kadar Protein
Metode Kjeldahl : Tahap Titrasi

• Jika larutan asam penampung yang digunakan HCl,

Sisa asam klorida yang tidak bereaksi dengan ammonia
• (membentuk NH4Cl) dititrasi dengan NaOH.
Jika digunakan indicator Phenolptalein (PP) akhir titrasi
• adalah perubahan larutan menjadi merah muda permanen
(dari asam ke basa). Atau jika digunakan indicator Metil red
• larutan berubah menjadi kuning. Buat titrasi untuk blanko
(tanpa sampel)
Penentuan Kadar Protein
Metode Kjeldahl : Tahap Titrasi
 Penentuan kadar protein secara Spektrofometri UV
 Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan
fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik.

 Triptofan mempunyai absorbsi maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin
mempunyai absorbsi maksimum pada 278 nm.

 Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada panjang gelombang lebih
pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk estimasi
konsentrasi protein dalam larutan.
 Penentuan kadar protein secara Spektrofometri UV

 Supaya hasilnya lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam

nukleat dengan pengukuran absorpsi pada 260 nm.

 Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontaminasi oleh

asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang ada
dalam suatu tabel.

 Kadar protein mg/ml = A280 x faktor koreksi x pengenceran

II.Penentuan Urutan Asam Amino

Sekuensing protein atau sekuensing peptida :

PENENTUAN URUTAN ASAM AMINO pada suatu
protein atau peptida (oligopeptida maupun
polipeptida).
Peptida : molekul yang terbentuk dari dua atau lebih asam amino.
Jika jumlah asam amino <50 molekul disebut peptida,
namun jika >50 molekul disebut dengan protein.
 Penentuan Urutan Asam Amino
Metode untuk sekuensing (penentuan urutan asam amino) pada
protein umumnya melibatkan pemutusan ikatan yang diikuti dengan
identifikasi asam amino.
Ada tiga metoda yaitu
1. Degradasi edman
2. Spektrofotometri massa
 Penentuan Urutan Asam Amino
1. Metode degradasi Edman
Residu pada ujung-N (ujung amino) protein DIPOTONG satu per satu DENGAN
REAKSI KIMIA.
Setelah setiap pemotongan, residu asam amino yang telah dipotong tersebut dapat DIIDENTIFIKASI
MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI.
Prosedur tersebut diulangi untuk setiap residu asam amino.
KELEMAHAN metode ini adalah bahwa polipeptida yang di-sekuensing TIDAK DAPAT LEBIH PANJANG
DARI 50–60 RESIDU (dapat disiasati dengan memotong-motong polipeptida berukuran besar menjadi
peptida-peptida berukuran lebih kecil sebelum dilakukan reaksi).
Penentuan Urutan Asam Amino
REAKSI EDMAN
Memotong dan menderivatisasi
asam amino yang terpenggal.
Derivat asam amino diidentifikasi
menggunakan kromatografi atau
elektroforesis dengan standar 20 asam
amino derivat.
Penentuan Urutan Asam Amino
 Penentuan Urutan Asam Amino
2.Metode Spektrofotometri massa
-Spektrometri massa yang mampu mengukur massa peptida dengan tepat.

- Protein yang hendak disekuensing dipotong-potong secara enzimatik

maupun kimia menjadi peptide-peptida yang kemudian dianalisis
menggunakan spektrometri massa.

-Dalam proses spektrometri massa, peptida-peptida tersebut dipecah secara

ionisasi, misalnya dengan bantuan laser pada metode matrix).
Pemetaan Peptida
Peta peptida dapat dilihat
sebagai sidik jari dari protein dan
merupakan produk akhir dari
beberapa proses kimia yang
memberikan pemahaman yang
komprehensif dari protein yang
dianalisis.
Pemetaan Peptida
Empat langkah utama yang diperlukan
untuk pengembangan prosedur:
 isolasi dan pemurnian protein,
 jika protein yang merupakan bagian
dari formulasi; pembelahan selektif
dari ikatan peptida;
 Pemisahan kromatografi dari peptida;
dan
 Analisis dan identifikasi peptida.
DIUJI SECARA PARALEL DENGAN STANDARD
REFERENCE
Karakterisasi protein :

 Berdasarkan :

- bobot molekul : SDS-PAGE

- muatan : Isoelectric focusing
- reaksi imunokimia : Western blot, ELISA
Elektroforesis
Teknik pemisahan komponen
atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan
tingkat migrasinya dalam
sebuah medan listrik
 Electroforesis protein

 Metode yang paling umum untuk memisahkan protein adalah dengan cara
electrophoresis menggunakan discontinuous polyacrylamide gel
sebagai medium penyangga dan sodium dodecyl sulfate (SDS) untuk
mendenaturasi protein.

 Metode ini disebut Sodium Dodecyl Sulfate polyacrylamide gel ectrophoresis

(SDS-PAGE). • Metode ini disebut juga “Laemmli method” karena penemunya
U.K. Laemmli, adalah yang pertama kali menggunakan metode SDS-PAGE
 Sodium Dodecyl Sulphate– Polyacrylamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
 Teknik elektroforesis yang menggunakan polyacrylamide sebagai bahan pemisah.
 SDS-PAGE biasanya digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan
sifat electrophoretic mobility (pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasi dan berat
molekulnya (BM) DALAM SEBUAH MEDAN LISTRIK).

Protein yang dipisahkan dengan SDS-PAGE dapat dikarakterisasi berdasarkan
berat molekulnya dengan satuan Kilo Dalton (kDa). Satu dalton sama dengan
satu hidrogen molekul.
 Sodium Dodecyl Sulphate– Polyacrylamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
SDS-PAGE merupakan teknik purifikasi skala
kecil yang menghasilkan pemisahan suatu protein berdasarkan berat
molekulnya dalam band (pita) spesifik yang tampak pada gel
polyacrylamide. Teknik purifikasi dalam skala besar kita dapatkan dengan
menggunakan chromatography.
Sodium Dodecyl Sulphate– Polyacrylamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Sodium Dodecyl Sulphate– Polyacrylamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Sodium Dodecyl Sulphate– Polyacrylamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Isoelectric focusing

 Karakterisasi protein berdasarkan muatan total

 Menggunakan gel poliakrilamid

 Elektroforesis dengan gradien pH antara katoda dan anoda

menggunakan larutan amfolit

 Titik isolelektrik (pI) : pH dimana muatan total protein adalah nol

 Muatan total nol  protein tidak bermigrasi pada medan listrik

Western blot

proses pemindahan protein dari gel hasil

elektroforesis ke membran. Membran ini
dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada
gel sehingga protein yang terblot pada
membran dapat dideteksi dengan cara
visual maupun fluoresensi.
Western blot
o Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk
memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida
atau berdasarkan struktur 3D-nya.
o Protein tersebut ditransfer ke sebuah membran,
biasanya nitroselulosa atau PVDF, kemudian dilacak
dengan menggunakan antibodi yang spesifik pada
protein target.

Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan

sangat banyak protein lain, dapat memberikan informasi mengenai
UKURAN dan EKSPRESI protein tersebut.
 Western blot
• DETEKSI EKSPRESI PROTEIN pada organisme dilakukan DENGAN
PRINSIP IMUNOLOGI menggunakan antibodi primer dan antibodi
sekunder.
• Setelah pemberian antibodi sekunder, DETEKSI dilakukan
secara VISUAL DENGAN PEMBERIAN KROMOGEN ATAU SECARA
FLUORESENSI.
• Pada DETEKSI SECARA FLUORESENSI, reaksi antara antibodi
primer dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens
yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini
dilakukan di kamar gelap.
Western blot
 KARAKTERISASI STRUKTUR PRIMER PROTEIN

• SEKUENSING UJUNG
AMINO (10-15 asam amino
pertama)

• SEKUENSING UJUNG
KARBOKSI

• PEMETAAN PEPTIDA
(Peptide mapping)
 SEKUENSING UJUNG SEKUENSING UJUNG KARBOKSI (C-
terminal)
AMINO (N-terminal)

C
N

PEMETAAN PEPTIDA

Metode Sequencing protein

KEGUNAAN PEPTIDE MAPPING
 IDENTITAS
 KONFIRMASI STABILITAS GENETIK
 KONSISTENSI LOT KE LOT
 PEPTIDE TERGLIKOSILASI (MAB)
 ASAM AMINO YANG SALAH (1 ATAU >1)
2.Berbasis asam nukleat
(DNA/RNA)
DNA Sequensing
proses atau teknik penentuan
urutan basa nukleotida pada suatu
molekul DNA.
Urutan tersebut dikenal sebagai
sekuens DNA
Nukleotida adalah bahan penyusun dua makromolekul
penting asam nukleat dalam organisme yang hidup yang
disebut DNA dan RNA.
DNA Sequensing

Sekuensing DNA dapat

dimanfaatkan untuk menentukan
identitas maupun fungsi gen
atau fragmen DNA lainnya
dengan cara membandingkan
sekuens-nya dengan sekuens
DNA lain yang sudah diketahui.
Hibridisasi DNA
Teknik mendeteksi asam
nukleat tertentu dengan
probe RNA atau DNA
 Hibridisasi DNA
• Dalam pengujian hibridisasi DNA, DNA dari sel
akan
didenaturasi dengan larutan basa sehingga
• kedua
untai DNA-nya terpisah.
• Untai–untai tunggal DNA dilekatkan pada
medium
solid, misalnya membran nitroselulosa atau
nilon,
Hibridisasi DNA
• Untuk mengkarakterisasi atau mengidentifikasi DNA
target,
maka pada membran ditambahkan molekul DNA dan
• RNA
untai tunggal yang disebut probe dan didalam larutan
buffer.
• Probe yang dinamai sedemikian rupa karena untu
Akibatnya,
digunakan akan terbentuk ikatan hidrogen di antara
k
basa–
mencari sekuens DNA, diberi label dengan
basa
suatuyang komplementer.
gugus
•
reporter.
Reporter bisa berupa isotop radioaktif atau
 Hibridisasi DNA
• Setelah mengidentifikasi klon sel
yang
diinginkan, kemudian ditumbuhkan
dalam
kultur cair dalam tangki besar dan
• selanjutnya dengan mudah mengisolasi
gen
tersebut dalam jumlah besar.
Selain itu juga dapat digunakan
CONTOH ANALISIS INSULIN MANUSIA
HASIL TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
BERDASARKAN USP 37 TAHUN 2014
Label klaim etiket :
Potensi insulin tidak kurang dari 95% dan tidak lebih dari
105% yang tertera pada label , dinyatakan dalam unit insulin
manusia per mL .
Baku pembanding yang digunakan :
USP insulin manusia satu unit setara 0.00347 mg insulin
murni manusia.
Identifikasi :
1.Uji Identifikasi
Analisis dengan HPLC.
Persyaratan : Waktu retensi uji sama dengan waktu retensi pembanding.

2. Uji bakteri endotoksin

Persyaratan : < 80 USP endotoksin untuk 100 insulin manusia USP
 3. Uji sterilitas
Persyaratan :Tidak ditemukan adanya pertumbuhan mikroorganisme
(larutan jernih)

4. Uji batasan protein berbobot tinggi

Persyaratan : < 1.7%

5. Uji penetapan kadar :

Menggunakan HPLC , kolom yang digunakan C8, detektor UV 214 nm.
Persyaratan : 95.0% -105.0%