ANALISA
REKOMBINAN
DETEKSI DNA REKOMBINAN
1. Deteksi kimia fisik
– Spektrofotometri UV
Spektrofotometri sinar UV digunakan untuk mengukur tingkat kemurnian DNA hasil isolasi.
Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi radiasi
elektromagnet
2.Elektroforesis gel agarosa
– Kebenaran ukuran
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan
ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Posisi molekul yang terpisah pada
gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi
dengan densitometer
3.DNA sekuensing
◦ Kebenaran urutan nukleotida (DNA sekuenser otomatis)
Quantifying DNA: Spectrophotometry
1 Metode Kjeldahl,
2. Metode titrasi formol,
3. Metode Lowry,
4. Metode spektrofotometri visible
(Biuret) dan spektrofotometri UV
Penentuan kadar protein:
Penetapan
nitrogen total
pada asam
amino, protein,
dan senyawa
yang
mengandung
nitrogen.
Penentuan Kadar Protein
Metode Kjeldahl
2.Spektrofotometri massa
Penentuan Urutan Asam Amino
1. Metode degradasi Edman
Residu pada ujung-N (ujung amino) protein DIPOTONG satu per satu DENGAN
REAKSI KIMIA.
Setelah setiap pemotongan, residu asam amino yang telah dipotong tersebut dapat
DIIDENTIFIKASI MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI.
Prosedur tersebut diulangi untuk setiap residu asam amino.
KELEMAHAN metode ini adalah bahwa polipeptida yang di-sekuensing TIDAK
DAPAT LEBIH PANJANG
DARI 50–60 RESIDU (dapat disiasati dengan memotong-motong polipeptida
berukuran besar menjadi
peptida-peptida berukuran lebih kecil sebelum dilakukan reaksi).
Penentuan Urutan Asam Amino
REAKSI EDMAN
Memotong dan menderivatisasi
asam amino yang terpenggal.
Derivat asam amino diidentifikasi
menggunakan kromatografi atau
elektroforesis dengan standar 20 asam
amino derivat.
Penentuan Urutan Asam Amino
Penentuan Urutan Asam Amino
2.Metode Spektrofotometri massa
-Spektrometri massa yang mampu mengukur massa peptida dengan tepat.
Berdasarkan :
dalam band (pita) spesifik yang tampak pada gel polyacrylamide. Teknik purifikasi
menggunakan chromatography.
Sodium Dodecyl Sulphate– Polyacrylamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Sodium Dodecyl Sulphate– Polyacrylamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Sodium Dodecyl Sulphate– Polyacrylamide
Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
Isoelectric focusing
• SEKUENSING UJUNG
AMINO (10-15 asam amino
pertama)
• SEKUENSING UJUNG
KARBOKSI
• PEMETAAN PEPTIDA
(Peptide mapping)
SEKUENSING UJUNG SEKUENSING UJUNG KARBOKSI (C-
terminal)
AMINO (N-terminal)
C
N
PEMETAAN PEPTIDA