ELEKTROFORESIS PROTEIN

(SDS-PAGE)
FINI AINUN QOLBI W, M.Si
 STRUKTUR
PROTEIN
• Struktur primer : ikatan-ikatan peptida dari

asam amino-asam amino pembentuk protein

• Struktur sekunder : ikatan hidrogen yang

terjadi antara gugus-gugus amina dengan

atom hidrogen pada rantai samping asam

 Struktur tersier : Interaksi struktur sekunder yang
amino sehingga membentuk lipatan-lipatan,
satu dengan struktur sekunder yang lain melalui
misalnya membentuk α-heliks.
ikatan hidrogen, ikatan ion, atau ikatan disulfida (-S-S).
 Struktur kuartener. Struktur yang melibatkan

beberapa peptida sehingga membentuk suatu protein.

Biasanya terdapat molekul lain.
 PAGE

 Poliakrilamid terbentuk dari reaksi polimerisasi akrilamid dan bisakrilamid

dibantu dengan agen polimerisasi yaitu Ammonium Persulfat (APS) dan
N,N,N,N’-Tetramethylendiamine (TEMED) sebagai katalisator
 Ukuran pori gel poliakrilamid tergantung dari konsentrasinya  pori PAGE 7% >
PAGE 12%
 Pembuatan PAGE dilarutkan dengan menggunakan Buffer  arus listrik mengalir
melalui matriks gel
PAGE

MUATAN,
Native
UKURAN DAN
PAGE BENTUK Mobilitas molekul melalui medan
listrik akan tergantung pada
faktor-faktor berikut:
SDS- - kekuatan medan,
MASSA
PAGE
- muatan pada molekul,
- ukuran dan bentuk molekul,
TITIK - kekuatan ionik,
2D-
ISOELEKTRIK - dan sifat-sifat matriks di mana
PAGE DAN MASSA
molekul bermigrasi
 Pemisahan berdasarkan : muatan akhir, ukuran dan bentuk
struktur asli protein.
 Tidak menggunakan denaturan, sehingga struktur protein
tidak berubah (dalam keadaan asli) atau dalam bentuk
kuartener dan masih memiliki aktivitas enzimatik (fungsi)
setelah pemisahan.
 Native-PAGE bisa digunakan untuk pemurnian protein
 Protein bisa diambil kembali dari gel setelah pemisahan
dengan difusi pasif atau elusi-elektro.
 Terdiri dari 2 dimensi : dimensi pertama
pemisahan protein berdasarkan titik isoelektrik
(pI) dengan menggunakan Isoelectrical Focusing
(IEF) sedangkan dimensi kedua dipisahkan
berdasarkan massa menggunakan SDS-PAGE
 IEF : media pemisahan menggunakan gradien pH
yang dibuat dalam tabung/strip gel mengunakan
campuran ampholyte
 Pemisahan kedua : strip IEF ditempelkan pada gel
SDS-PAGE
SDS
• SDS adalah Deterjen anionik  protein bermuatan negatif
dan mengubah struktur protein menjadi linear

Before After
 PRINSIP SDS-PAGE

• Prinsip SDS-PAGE : memisahkan protein sesuai dengan berat molekul, berdasarkan

perbedaan migrasi protein yang melalui matriks gel dibawah pengaruh medan listrik.
• Satuan berat molekul protein : Dalton (Da)
 ALAT 3. Clamp
4. Elektrode

2. Casting stand
1. Power Supply

5. Chamber

6. Comb
9. Sample
Loading 8. Short 7. Spacer
guide plate
1. Marker Protein
BAHAN
2. Gel SDS-PAGE
Acrylamide concentration Linear range of separation
(%) (kDa)
15 12-43
10 16-68
7.5 36-94
5.0 57-212

Gel SDS-PAGE terdiri dari separating gel dan stacking gel

Tris-HCl pH 6.8

Tris-HCl pH 8.8
BAHAN
3. Buffer Sampel : Tris-HCl 1 M (pH 6,5), gliserol 30%, SDS 10%, β-merkaptoetanol,
bromfenol biru 1%, dan akuades
4. Bufer Elektroforesis : Tris-base, glisin, dan SDS.
5. Larutan Pewarna : Comassie Blue R250, methanol, asam asetat glasial, dan
akuades.
6. Larutan destaining : metanol, asam asetat glasial, dan akuades.
 Video 1
 Video 2
FINI AINUN QOLBI W, M.Si
1. Penentuan kemurnian sampel protein
2. Penentuan berat molekul protein
3. Identifikasi ikatan disulfida antar molekul protein
4. Kuantifikasi protein
5. Blotting
SDS-PAGE analysis after purification via affinity Ni-NTA column chromatography, to
check the protein presence and purity (lanes 1, 2, 3 and 4 show eluted fractions from
the IMAC column and M shows the protein ladder)
 Migrasi protein yang mengandung SDS berbanding terbalik
dengan logaritma berat molekulnya
 Untuk memastikan penentuan akurat :
 Menggunakan standar yang tepat
 Gunakan bufer sampel yang mengandung zat pereduksi (DDT
atau beta-ME) untuk memutuskan ikatan disulfida dan
meminimalkan efek struktur tersier pada migrasi
 Penambahan SDS untuk mendenaturasi struktur sekunder, tersier
dan kuartener. Pengikatan SDS terhadap protein : 1,4 g SDS/ g
protein
 Penentuan jarak migrasi relatif (Rf = jarak
pita/jarak garis depan)
 Plot ke grafik log MW vs Rf
 Jarak migrasi sample protein : 45 mm
 Jarak garis depan pewarna : 67 mm
 Rf = 45mm/67mm = 0.67

 Persamaan Y = -1.9944x + 2.7824

 Y = log MW
 X = Rf  X = 0.67
 Maka MW = 10y = 10-1.9944x + 2.7824 = 28.1 kDa
 Metode kuantifikasi protein : spektroskopi UV 280 nm, reaksi warna, elektroforesis
 Kelebihan dengan elektroforesis  penentuan evaluasi kemurnian
 Ada 2 metode kuantifikasi protein dengan elektroforesis : kuantisasi relatif
(kuantifikasi berdasarkan kuantitas protein lain) dan kuantisasi absolut
(kuantifikasi menggunakan kurva kalibrasi dari protein standar)
 Syarat kuantifikasi absolut : protein murni
Identifikasi ikatan disulfida protein

Protein

Purified rSol g 4.1 protein : lane M - molecular weight A. Ekspresi protein. M - molecular weight standards; 1 - expression
standards; lane 1 - purified rSol g 4.1 protein; lane 2 - without IPTG; 2 - culture grown in the presence of 0.4 mM IPTG for 8
cleavage of the tagged protein by one unit of enzyme h.; 3 - cell extract in solution; 4 - cell extract in pellet
for 7 h
Kelebihan
Migrasi sebanding dengan berat molekul
Sensitifitas tinggi
Hanya membutuhkan sampel dalam jumlah
sedikit
Ikatan kimia gel yang stabil
Kekurangan
Resolusi pita kurang baik karena pH tinggi
Gel akrilamid berpotensi neurotoksik
Preparasi gel sulit dan membutuhkan waktu
lama
Harga mahal