PERCOBAAN IV: PENENTUAN KADAR KOLESTEROL

(METODA CHOD-PAP)

I. TUJUAN PERCOBAAN
Setelah menyelesaikan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat:
1. Menyiapkan pasien untuk pemeriksaan kolesterol dalam darah.
2. Menginterpretasikan hasil laboratorium yang diperoleh.

II. PRINSIP PERCOBAAN

Kolesterol total ditetapkan langsung di dalam plasma atau serum dengan

satu sisi reaksi dimana ester kolesterol dihidrolisis, gugus 3-OH kolesterol
dioksidasi, kemudian hydrogen peroksida yang merupakan salah satu hasil
reaksi ditetapkan secara enzimatis.

Kolesterol esterase
Ester kolesterol + H20 kolesterol + asam-asamlemak
Kolesteroloksidase
Kolesterol + O2 kolestenon + H2O2
peroksidase
2 H2O2+ fenol + 4-aminoantipyrine quinoneimine + H20

Absorbansi warna diukur pada panjang gelombang 500nm

III. TEORI

Kolesterol atau yang disebut juga dengan lemak tak jenuh merupakan
substansi seperti lilin yang warnanya putih, kolesterol secara alami sudah ada
dalam tubuh kita. Hati adalah yang memproduksi kolesterol, kolesteorol
berfungsi untuk membangun dinding sel dan juga untuk membuat hormon-
hormon tertentu. Sebenarnya tubuh manusia sudah bisa menghasilkan
kolesterol sendiri, namun karena manusia mengkonsumsi makan-makanan yang
mengandung lemak sehingga menyebabkan seseorang kadar lemak dalam
tubuhnya sangat berlebih.Penyakit jantung dan penyakit pembuluh darah
merupakan penyakit yang disebabkan oleh kadar kolesterol yang berlebihan
dalam darah. Hal itubisa terjadi karena kolesterol yang berlebih akan
membentuk bekuan dan plak yang akan menyumbat arteri dan akhirnya
memutuskan aliran darah ke jantung yang akan menyebabkan serangan
jantung, dan ke otak akan menyebabkan stroke. Jadi agar terhindar dari
serangan jantung sangat disarankan untuk mengontrol kadar kolesterol dalam
tubuh kita. Jika seseorang pernah mengalami serangan jantung atau pembedahan
baypass,kadar kolesterolnya harus diperiksa secara rutin. dengan
menjaga kolesterol agar tetap wajar merupakan jaminan terbaik untuk
terhindar dari penyumbatan pembuluh darah arteri. Kadar kolesterol sendiri
terbagi menjadi dua bagian yaitu:

 Kolesterol HDL singkatan dari High-Density Lipoprotein, HDL adalah

“kolesterol baik” karena mempunyai kemampuan untuk
membersihkan pembuluh darah arteri.
 Kolesterol LDL singkatan dari Low-Density Lipoprotein, LDL adalah
“kolesterol jahat” yang membuat endapan dan menyumbat
pembuluhdarah arteri
(Ridwanaz, 2010 )

Kolesterol adalah lemak yang sebagian besar dibentuk oleh tubuh

sendiri terutama di dalam hati. Fungsi kolesterol adalah sebagai bahan
pembentuk berbagai jenis hormonsteroid antara lain hormon
estrogen,progesteron, dan androgen. Juga merupakan prvitamin D yang
terdapat di jaringan bawah kulit. Dengan pertolongan sinar matahari, terutama
sinar ultravioletnya, pro vitamin D itu diubah menjadi vitamin D. Fungsi
kolesterol berikutnya adalah sebagai bahan pembentuk asam empedu
dangaram empedu. Bila kadar kolesterol dalam darah tinggi dapat
menyebabkan timbulnya atherosklerosis yaitu kolesterol mengendap di
dinding pembuluh darah membentuk plak, sehingga saluran darah menyempit
dan mengeras lama-lama terjadi penyumbatan. Apabila penyumbatan terjadi
di pembuluh nadi yang mensuplai darah ke dinding jantung maka
menyebabkan penyakit jantung koroner (Soeharto, 2004).

Kolesterol total sebenarnya merupakan susunan dari banyak

zat,termasuk trigliserida, kolesterol HDL dan kolesterol LDL. Kategori
kadarkolesterol total: Normal < 200 mg/dL, Batas tinggi 200 – 239
mg/dL,Tinggi <240 mg/dL (Soeharto, 2004).

Hiperlipidemia

Yang dimaksud dengan Hiperlipidemia adalah suatu keadaan yang

ditandai oleh peningkatan kadar lipid/lemak darah. Berdasarkan jenisnya,
hiperlipidemia dibagi menjadi 2 yaitu:

 Hiperlipidemia Primer
Banyak disebabkan oleh karena kelainan genetik. Biasanya kelainan ini
ditemukan pada waktu pemeriksaan laboratorium secara kebetulan. Pada
umumnya tidak ada keluhan, kecuali pada keadaan yang agak berat tampak
adanya xantoma (penumpukan lemak di bawah jaringan kulit).

 Hiperlipidermia Sekunder
Pada jenis ini, peningkatan kadar lipid darah disebabkan oleh suatu
penyakit tertentu, misal : diabetes mellitus, gangguan tiroid,penyakit
 hepar, dan penyakit ginjal. Hiperlipidemia sekunderbersifat reversible (
berulang ) (Fredrickson, 1967).

Berdasarkan fenotip lipoproteinnya hiperlipidemia primer dibedakan

berdasarkan 6 tipe.

Fraksi lipoprotein Lipid utama yang

Tipe Sinonim utama yang meningkat
meningkat
I Hiperkilomkronemia Kilomikron Trigliserid

II A Hiperbetalipoprotenemia LDL Kolesterol

II B Hiper-β & pra-β-LPP LDL dan VDL Kolesterol dan

lipoprotenemia trigliserid

III Hiper broad band LPPemia IDL

Trigliserid dan
IV Hoperpralipoprooteinemia VLDL kolesterol

V Hiperprabetalipoproteinem VLDL dan Trigliserid

ia kilomikron
Trigliserid dan
kilomikron

(Fredrickson, 1967)
 Kolesterol merupakan substansi lemak, yang secara normal dibentuk
di dalam tubuh. Kolesterol dibentuk di hati dari lemak makanan. Kolesterol
memainkan banyak peran penting dalam fungsi sel tubuh(antara lain produksi
hormon). Kolesterol darah dapat dibagi menjadi 2 bagian utama: kolesterol
LDL (Low Density Lipoprotein) yang dikenal sebagai kolesterol jahat dan
kolesterol HDL (High Density Lipoprotein)yang dikenal sebagai kolesterol
baik. LDL membawa kolesterol dari hatike sel, dan HDL berperan membawa
kolesterol dari sel ke hati(Satriaperwira, 2008 ).

Kadar kolesterol LDL yang tinggi akan memicu penimbunan

kolesterol di sel, yang menyebabkan munculnya atherosclerosis(pengerasan
dinding pembuluh darah arteri) dan penimbunan plak didinding pembuluh
darah. Hal ini dihubungkan dengan penngkatan risikopenyakit akibat
gangguan pembuluh darah (misalnya: penyakit jantungkoroner, stroke,
gangguan pembuluh darah tepi) (Satriaperwira, 2008 ).

Kadar kolesterol darah yang tinggi dapat disebabkan oleh berbagai

faktor. Faktor-faktor penyebab kadar kolesterol yang tinggi adalah
genetic,diet tinggi lemak, kelebihan berat badan, kurangnya aktivitas fisik,
dan merokok. Merokok meningkatkan kadar kolesterol LDL dan menurunkan
kadar kolesterol HDL. Kadar kolesterol LDL yang tinggi dapat
puladisebabkan oleh konsumsi alkohol atau obat-obatan (misalnya: steroid
atau pil kontrasepsi) (Satriaperwira, 2008 ).
IV. ALAT DAN BAHAN
Alat
1. Spektrometer

2. Kuvet

3. Pipet piston

4. Sentrifuga

5. Tabung reaksi dan rak tabung reaksi

6. Spuit 3ml
Bahan
1. Serum, plasma-heparin atau EDTA
2. Alkohol 70%

Reagensia mengandung:

1. Reagen :

4-aminoantipyrin 0.30 mmol/l

Phenol 6 mmol/l
Peroksidase >0.5 U/ml
Kolesterol esterase > 0.15 U/ml
Kolesterol oksidase > 0.1 U/ml
Pipes buffer 80 mmol/l ; pH 6.8

2. Standard:
Kolesterol 5.17 mmol/l (200 mg/dl)

Persiapan dan stabilitas larutan:

1. Reagen:
Larutan siap untuk digunakan. Reagen ini stabil sampai waktu
kadaluarsa bila disimpan pada 2-8 °C, tidak terkontaminasi dan
terlindung dari cahaya langsung.

2. Standar:
Larutan siap untuk digunakan. Larutan standar stabil sampai waktu
kadaluarsa bila disimpan pada 2-8 °C
V. PROSEDUR

Ke dalam kuvet dipipetkan :

Blangko Standar Sampel (µl)
Reagen (µl) (µl)
Aquadest 10 - -
Standar - 10 -
Sampel - - 10
Reagen 1000 1000 1000

Dicampurkan dan diinkubasikan selama 10 menit pada suhu ruangan.

Kemudian baca absorbansi sampel (Asampel) terhadap BR pada panjang
gelombang 500 nm. Diencerkan 0.1ml sampel dengan 0.2ml larutan NaCl
0.9% jika hasil melebihi 1000mg/dl (25.9mmol/I) Setelah itu dihitung
konsentrasi kolesterol dalam sampel, dengan persamaan:

Asampel
Ckolesterol = x 200 mg/dl
Astan dar

Asampel

Ckolesterol = x 5.17mmol/I
Astan dar

Percobaan ini dilakukan secara triplo.


VI. DATA PENGAMATAN

Kelompo Blanko Standar Sampel I Sampel II Sampel III Rata-rata

k (A) d (A) (A) (A) (A)
(A)
I 0,000 0,762 0,328 0,366 0,591 0,428

II 0,000 0,762 0,943 0,937 0,939 0,940

III 0,000 0,762 0,191 0,110 0,632 0,311

Perhitungan
Kelompok Konsentrasi Konsentrasi mg/100ml Mmol/l
(mmol/l) (mg/dl) (553X A sampel) (14.3X A
sampel)
I 0,428/0,762 0,428/0,726 X C= 553 X 0,428 C=14,3 X 0,428
X5.17 200 =236,68 =6,12
= 2,90 = 110,236
II 0,940/0,762 X 0,9401/0,762 X C= 553 X 0,940 C=14,3 X 0,440
5,17 200 = 519,82 = 13,442
=6,38 =246,72
III 0,311/0,762 X 0,311/0,762 X200 C= 553 X 0.311 C= 14,3 X0,311
5,17 = 81,63 = 171,98 = 4,45
=2,11
VII. PEMBAHASAN

Kolesterol adalah metabolit yang mengandung lemak sterol yang

ditemukan pada membran sel dan disirkulasikan dalam plasma darah.
Merupakan sejenis lipid yang merupakan molekul lemak atau yang
menyerupainya. Kolesterol ialah jenis khusus lipid yang disebut steroid.
Steroids ialah lipid yang memiliki struktur kimia khusus..

Tubuh manusia dan hewan yang normal akan berusaha memelihara

konsentrasi plasma kolesterol dengan cara mengatur sintesis dan ekskresi
kolesterol. Kolesterol yang melebihi kebutuhan tubuh akan dieliminir melalui
empedu, tetapi walapun begitu jika pasok kolesterol dari makanan berlebih
yang akhirnya melebihi kebutuhan tubuh, maka akan berakibat kurang baik
bagi tubuh dan dapat menimbulkan berbagai gangguan fisiologi seperti
artherosklerosis yang manifestasinya dapat menjadi penyakit jantung koroner
atau stroke.

Pada praktikum kimia klinik pertemuan ketiga adalah menentukan

kadar kolesterol pada darah. Hal ini dilakukan agar mahasiswa dapat
menyiapkan pasien untuk pemeriksaan kolesterol dalam darah, kemudian
mahasiswa dapat menginterprestasikan hasil laboratorium yang diperoleh.
Pada manusia, 60-70% diangkut oleh LDL, 20-35% oleh HDL dan 5-12% ole
VDL. Maka dari itu, praktikan ingin mengetahui seberapa banyakkah
kolesterol di dalam darah manusia, yakni dengan cara pemeriksaan kolesterol
pada sampel darah tertentu.

Preparasi pertama yang harus dilakukan adalah dengan cara

mempersiapkan segala alat dan bahan yang diperlukan untuk praktikum ini
diantaranya yaitu sampel darah. Adapun sampel darah yang akan digunakan
disimpan di dalam tabung darah khusus. Dalam pelaksanaannya harus dengan
hati-hati agar darah tidak terkontaminasi oleh zat lain, sehingga tidak akan
mengganggu dalam hal pemeriksaan.

Serum merupakan darah yang telah dipisahkan dari sel-sel darah

merah dan zat-zat koagulan serta biasanya berwarna kuning pucat. Larutan
reagen merupakan campuran dari beberapa enzim yang dapat mengubah
kolesterol menjadi suatu senyawa berwarna sehingga dapat dideteksi oleh
spektrofotometri UV-Vis.

Pada proses pengambilan larutan, yaitu aquadest, reagen, dan sampel

dilakukan dengan menggunakan mikropipet (pipet piston). Hal ini disebabkan
jumlah larutan yang diambil sangat sedikit (10 μL). Sebelum pipet piston
digunakan, bagian atas pipet yang disebut thumb knob sebaiknya ditekan
berkali-kali untuk memastikan lancarnya mikropipet. Setelah itu tip bersih
dimasukkan ke dalam nozzle / ujung pipet piston sampai pas (tidak jatuh).
Thumb knob ditekan sampai hambatan pertama / first stop, jangan ditekan
lebih ke dalam lagi karena cairan yang terambil akan lebih besar daripada
jumlah yang sebenarnya. Setelah itu, tip dimasukkan ke dalam cairan sedalam
3-4 mm karena jika kurang dari nilai tersebut dikhawatirkan cairan tidak
terambil sempurna (ada gelembung udara yang terambil), sedangkan jika lebih
dari nilai tersebut dikhawatirkan terdapat kontaminan dari tip pipet.
Selanjutnya pipet ditahan dalam posisi vertikal kemudian tekanan dari thumb
knob dilepaskan sehingga cairan masuk ke tip. Ujung tip dipindahkan ke
dalam kuvet. Untuk mengeluarkan cairannya, thumb knob ditekan sampai
hambatan kedua / second stop atau ditekan semaksimal mungkin sehingga
semua cairan keluar dari ujung tip. Pipet piston digunakan dalam percobaan
ini karena memiliki ketelitian, sensitivitas, dan spesifisitas yang tinggi bila
dibandingkan dengan pipet gelas.

Pada kuvet blanko, setelah dimasukkan aquadest dan larutan reagent,

kuvet digoyang agar larutan tercampur secara sempurna. Setelah itu kuvet
diinkubasikan pada suhu ruang yaitu 27 oC selama 10 menit. Proses inkubasi
ini bertujuan memberikan waktu untuk terjadinya reaksi antara kedua larutan
dalam campuran tersebut. Inkubasi ini juga dilakukan untuk kuvet standar dan
kuvet sampel. Pengukuran blanko perlu dilakukan karena dikhawatirkan
terjadi perubahan reagen pada saat inkubasi dan memberikan serapan pada
panjang gelombang pengukuran.

Saat proses inkubasi, terjadi reaksi antara reagen dengan kolesterol

yang terdapat pada larutan standar dan sampel. Setelah diinkubasi, kedua
larutan yang tadinya berwarna bening dalam masing-masing kuvet berubah
menjadi warna merah rosa. Warna merah tersebut menandakan telah
terjadinya reaksi antara enzim dengan kolesterol. Warna merah tersebut
berasal dari senyawa quinoneimine, yang merupakan hasil reaksi antara
reagen dan kolesterol. Reaksi yang terjadi yaitu sebagai berikut :

→
 →

Perubahan warna (menjadi berwarna merah) diperlukan agar campuran

larutan dapat diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer
UV-Vis, khususnya dengan sinar visibel. Quinoeimine akan terukur
absorbansinya pada panjang gelombang 546 nm dan nilai absorbansi tersebut
sebanding dengan kadar kolesterol dalam darah. Setelah inkubasi selesai,
masing-masing larutan blanko, standard dan sampel diukur absorbansinya
dengan spektrofotometer. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang
546 nm yang merupakan panjang gelombang maksimum untuk quinoeimine.
Untuk larutan sampel, pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali (triplo) agar
kesalahan pada saat pengukuran dapat dihindari sehingga hasilnya lebih
akurat. Ketiga hasil yang didapat dirata-ratakan dan dihitung kadar kolesterol
dalam sampel.

Larutan blanko yang sudah dimasukkan ke dalam tabung reaksi

kemudian disimpan (inkubasi) selama 10 menit minimal pada suhu ruangan
(15-25 oC).

Blanko yang sudah disimpan kemudian diperiksa oleh instrumen

spektofotometri untuk mengetahui panjang gelombang (λ) yang nantinya
akan digunakan dalam pemeriksaan sampel. Absorbansi yang diperoleh pada
saat pengukuran larutan sampel adalah 0,328 ; 0,366 ; dan 0,591. Rata-rata
absorbansi larutan sampel adalah 0,28. Sedangkan absorbansi larutan standar
adalah 0,762. Karena larutan blanko memberikan absorbansi yaitu 0,001 maka
absorbansi masing-masing sampel dan standar dikurangi dengan nilai
absorbansi blanko agar diperoleh absorbansi sampel dan standar yang
sebenarnya. Nilai dari kedua absorbansi tersebut dapat digunakan untuk
menghitung kadar kolesterol dalam sampel dengan menggunakan rumus :

[ ] [ ]

Konsentrasi kolesterol standar (normal) adalah dibawah 200 mg/dl.

Nilai konsentrasi kolesterol dalam sampel yang diperoleh dari perhitungan
sebesar 112,34 mg/dl. Nilai tersebut merupakan nilai standar buat normal

Penentuan kadar kolesterol dilakukan dalam beberapa tahap,

diantaranya yakni mempersiapkan larutan baku pembanding (standar) atau
biasa kita kenal sebagai larutan Blanko. Larutan blanko diambil dari reagen
kit kolesterol untuk perbandingan sampel dengan larutan baku standar.

Setelah itu lalu masuk ke dalam perlakuan sampel darah yang akan
digunakan dalam pemeriksaan kali ini. Sampel terbaik adalah serum.
Kolesterol dalam serum stabil selama 1 minggu pada suhu kamar (18-30 oC)
dan 6 bulan pada keadaan beku. Adapun nilai kolestrol yang normal pada
tubuh manusia yakni < 200 ml/dl.

Seperti halnya pada larutan blanko, sampel darah dimasukkan kedalam

tabung reaksi menggunakan clinipette sebanyak 10 µl kemudian masukkan
reagen glukosa sebanyak 1,0 µl setelah itu sample di inkubasi selama 10
menit. Setelah penambahan reagen pada sampel terbentuk larutan berwarna
merah muda (pink). Sampel yang sudah di inkubasi kemudian di uji
menggunakan Spektrofotometer untuk mengetahui panjang gelombang (λ)
dan absorban pada sampel.
 Setelah dilakukan pemeriksaan terhadap sampel, tahapan selanjutnya
yakni dengan melakukan perhitungan nilai absorban standard dan nilai
absorban sampel dengan konsentrasi standar. Hal ini dilakukan agar nilai
kolesterol dalam sampel dapat diketahui. Perhitungan nilai konsentrasi
kolesterol dapat dilakukan dengan menggunakan rumus, yakni :
Csampel = x Cstandar

Adapun nilai konsentrasi kolesterol dalam darah (serum) yang didapat

adalah sebesar 112,34 mg/dl.

VIII. KESIMPULAN

Daripada percobaan yang dilakukan,didapati konsentrasi kolestrol

dalam sampel adalah 2,90 mmol/l dan 112,43 mg/dl manakala konsentrasi
kolestrol dalam sampel dengan panjang gelombang 500 nm adalah 236,68
mg/100ml dan 6,12 mmol/l.Pasien didapati pada tahap perbatasan.Pasien
untuk pemeriksaan kolestrol dalam darah telah disiapkan dan data telah
diintepretasikan.
DAFTAR PUSTAKA

Fridrickson.1967.Hyperlipidemia.http://medicastore.com/nutracare/isi_choles
s.php?isi_choless=hiperlipid (akses tanggal 30 maret 2013

Ridwanaz. 2010. Pengertian kolesterol. http://ridwanaz.com/http://

ridwanaz.com/kesehatan/pengertian-kolesterol/akses tanggal(30 Maret
2013)

Satriaperwira. 2008. Patofisiologi Pembentukan Plaque from various sources.

http://satriaperwira.wordpress.com/2008/12/26/patofisiologi-
pembentukan-plaque/ (akses tanggal 31 maret 2012)

Soeharto, I. 2004.Serangan Jantung dan Stoke Hubungannya Dengan Lemak

dan Kolesterol. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama