ELEKTROFORESIS

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.
Kcepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan
ukuran.dengan demikian elektroforesis dapat di gunakan untuk separasi makromolekul (seperti
protein dan asam nukleat).posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan
pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencega

terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan
agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam
nukleat elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida
(PAGE=poli-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi
medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik,
molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya.
Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul
berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan
bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika sistem koloid
bermuatan negative, maka pertikel itu akan menuju elktrode positif

Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh

medan listrik. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-
sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik
Elektroferesis adalah peristiwa pergerakan partikel koloid yang bermuatan ke salah satu
elektroda.
Elektrotoresis dapat digunakan untuk mendeteksi muatan partikel koloid. Jika partikel koloid
berkumpul di elektroda positif berarti koloid bermuatan negatif dan jika partikel koloid
berkumpul di elektroda negatif berarti koloid bermuatan positif.
Prinsip elektroforesis digunakan untuk membersihkan asap dalam suatu industri dengan alat
Cottrell

1. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE)

Prinsip:

Elektroforesis ditakrifkan sebagai migrasi molekul bercas didalam satu larutan melalui suatu
medan elektrik. Jenis elektroforesis yang paling lazim digunakan untuk protein ialah
elektroforesis zonan (zonal electrophoresis) di mana protein dipisahkan dari satu campuran yang
kompleks kepada jalur (band) melalui migrasi didalam larutan penimbal berair melalui satu
matrik polimer dipanggil gel. Gel poliakrilamid merupakan matrik yang paling lazim didalam
elektroforesis protein, walaupun matrik lain seperti kanji dan agaros juga digunakan. Matrik gel
boleh dibentuk sama ada didalam tiub kaca atau keping (slab) diantara dua kepingan kaca.

Protein boleh bercas positif atau negatif, bergantung kepada pH larutan dan pI nya. Suatu
protein bercas negatif sekiranya pH larutan diatas pI nya, manakala suatu protein itu bercas
positif sekiranya pH larutan dibawah pI nya. Banyaknya cas dan voltan yang diberikan akan
menentukan berapa jauhnya suatu protein itu akan bergerak didalam suatu medan elektrik.
Semakin tinggi voltan dan semakin besar cas yang terdapat pada protein, maka semakin besarlah
pergerakan didalam medan elektrik. Saiz dan bentuk molekul yang menentukan jejari Stokes
suatu protein, juga menentukan jarak pergerakan didalam matrik gel tersebut. Pergerakan protein
perlahan apabila pergeseran molekul meningkat akibat dari mertambahnya jejari Stokes; dengan
demikian, protein yang lebig kecil bergerak lebih pantas didalam matrik gel. Bagitu juga,
pengurangan dalam saiz liang (pore) matrik gel akan memperlahankan pergerakan.

Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis natif, protein

dipisahkan dalam bentuk aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk molekul tersebut. Satu lagi
bentuk elektroforesis yang selalu digunakan bagi pemisahan protein ialah elektroforesis
penyahaslian. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE) dengan suatu detergen anion, sodium
dodesil sulfat (SDS) digunakan untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein
dilarutkan didalam suatu larutan penimbal yang mengandungi SDS dan agen penurun,
merkaptoetanol atau ditiotreitol, untuk menceraikan protein menjadi subunit dan menurunkan
ikatan disulfat (Rajah 1). Protein bergabung dengan SDS lalu bercas negartif, dan dipisahkan
hanya berdasarkan saiz.

Tatakerja:

Sebuah pembekal kuasa dan radas elektroforesis mengandungi matrik gel poliakrilamid dan dua
takungan (reservoir) larutan penimbal adalah diperlukan ubtuk menjalankan satu pemisahan.
Contoh gel keping dan unit elektroforesis ditunjukkan didalam Rajah 2. Sumber kuasa digunakan
untuk menwujudkan medan elektrik dengan menyediakan suatu sumber arus, voltan atau kuasa
yang konstan. Penimbal elektrod mengawal pH bagi mengekalkan cas yang sesuai pada protein
dan menkonduksikan arus melalui gel poliakrilamid. Sistem penimbal yang biasa digunakan
termasuklah penimbal anionik tris-(hidroksimetil)amino metan dengan gel pelerai (desolving
gel) pada pH 8.8 dan penimbal asetat yang kationik pada pH 4.3.

Matrik gel poliakrilamid terbentuk melalui pempolimeran akrilamid dengan sedikit (selalunya
5% atau kurang) reagen pempaut silang (cross-linking) N.N’-metilen-bisakrilamid dengan
kehadiran satu mangkin, tetrametiletilendiamin (TEMED) dan sumber radikal bebas, amonium
persulfat seperti ditunjukkan didalam Rajah 3. Gel boleh disediakan didalam makmal atau dibeli
siap diacu (pre-cast).

Matrik gel tak selanjar (discontinuous) selalunya digunakan untuk memperbaikki peleraian
(resolution) protein didalam campuran yang kompleks. Matrik tak selanjar terdiri dari satu gel
penimbun (stacking gel) dengan saiz liang yang besar (selalunya 3-4% akrilamid) dan satu gel
pelerai (resolving gel) yang mempunyai saiz liang yang kecil. Gel penimbun, seperti yang
dimaksudkan dengan namanya, digunakan untuk menimbunkan atau memekatkan protein
menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasukki gel pelerai (Rajah 4). Pada pH
6.8, satu kecerunan voltan terbentuk diantara ion klorid (cas negatif tinggi) dan glisin (cas negatif
rendah) didalam penimbal elektrod yang bertujuan menimbunkan protein menjadi jalur-jalur
sempit diantara ion-ion. Migrasi kedalam gel pelarian (running gel) yang mempunyai pH
berlainan (pH 8.9) mengganggu kecerunan voltan ini lalu membenarkan pemisahan protein
menjadi jalur-jalur yang diskrit.

Saiz liang gel pelarian dipilih berdasarkan berat molekul protein yang hendak dipisahkan dan
boleh diubah dengan cara menukar kepekatan akrilamid didalam larutan. Protein selalunya boleh
dipisahkan pada gel pelarian yang mengandungi 4 ke 15 peratus akrilamid. Kepekatan akrilamid
15 peratus selalunya digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul
dibawah 50,000. Protein yang mempunyai berat molekul lebih besar dari 50,000 lazimnya
dipisahkan pada gel yang kepekatan akrilamidnya dibawah 7 peratus. Satu gel kecerunan
(gradient gel) dimana kepekatan akrilamis meningkat dari atas kebawah gel selalunya digunakan
untuk memisahkan satu campuran protein yang mempunyai banjaran berat molekul yang luas.

Bagi menjalankan sesuatu pemisahan, protein didalam penimbal yang sesuai pHnya dimuatkan
disebelah atas gel penimbun. Pewarna penjejak (tracking dye) bromofenol biru ditambahkan
kedalam larutan protein. Pewarna ini molekul kecil yang migrasi terdahulu daripada dan
digunakan untuk memonitor kemajuan sesuatu pemisahan. Selepas sesuatu larian (run)
elektroforesis, jalur-jalur yang terdapat pada gel umumnya divisualkan dengan menggunakan
pewarna (stain) protein seperti Coomassie Brilliant Blue atau pewarna timah (silver stain).
Pewarna enzim spesifik atau antibodi boleh juga digunakan untuk mengesan sesuatu protein.

Kegunaan:

Elektroforesis selalunya digunakan untuk menentukan komposisi protein sesuatu produk

makanan. Sebagai contohnya, perbezaan yang terdapat didalam komposisi protein dari protein
pekatan kacang soya dan pekatan protein weiyang dihasilkan melalui teknik pemisahan yang
berlainan boleh dikesan. Elektroforesis boleh juga digunakan untuk menentukan ketulenan
sesuatu ekstrak protein.

SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk
menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bercas
tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan
dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein piawai yang diketahui berat
molekulnya (Rajah 5). Piawai protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam
beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat
molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak
diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.

2. Pemfokusan Isoelektrik (Isoelectric Focusing)

Prinsip:
Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam kes ini, protein
dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel yang telah diwujudkan
kecerunan pH menggunakan amfolit (ampholytes). Protein difokuskan atau migrasi ke lokasi
didalam kecerunan dimana pH sama dengan pI protein tersebut (Rajah 6). Peleraian yang
diperolehi adalah diantara yang paling tertinggi untuk sebarang teknik pemisahan protein dan
boleh digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai pI berbeza kurang dari 0.02 unit
pH.

Tatakerja:

Satu kecerunan pH diwujudkan menggunakan amfolit, iaitu polimer kecil (berat molekul kira-
kira 5000 dalton) yang mengandungi kedua-dua kumpulan bercas positif dan negatif. Suatu
campuran amfolit terdiri dari beribu-ribu polimer yang mempamirkan satubanjaran nilai pK.
Amfolit ditambahkan kedalam larutan gel sebelum pempolimeran dijalankan. Selepas gel
terbentuk dan arus dialirkan, amfolit ini bermigrasi lalu membentuk kecerunan pH; amfolit yang
bercas negatif akan migrasi kearah anod, manakala yang bercas positif kearah katod. Campuran
amfolit boleh diperolehi yang merangkumi banjaran pH yang sempit (2-3 unit) atau satu banjaran
yang lebar (pH 3-10) dan perlulah dipilih untuk digunakan berdasarkan ciri-ciri protein yang
hendak dipisahkan.

Kegunaan:

Pemfokusan isoelektrik merupakan kaedah pilihan untuk menentukan titik isoelektrik sesuatu
protein dan sZt. Pemfokusan isoelektrik juga digunakan untuk membedakan spesis ikan yang
berhubungan rapat dengan berdasarkan corak proteinnya.

ELEKTROFORESIS GEL

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip
dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.
Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya
gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul
bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula
digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam
metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-
blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam
bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi:
memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel,
pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda
(menggunakan prinsip dalam elektroforesis

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang
porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat
yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida
dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih
besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut)
yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada
gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-
molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik
sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda
positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk
menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam
nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium
dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul
sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie"
(Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam
sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar
ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.