Artikel ini menyoroti sepuluh jenis teknik elektroforesis yang digunakan dalam biokimia.

Sepuluh jenis teknik elektroforesis yang digunakan dalam biokimia adalah: (1) Sistem
Elektroforesis Gel Horisontal dan Vertikal (2) Agarose Gel Elektroforesis (3) gel Polyacrylamide
(4) Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Elektroforesis (5) Gel asli (Buffer) 6) Sel
Gradien (7) Elektroforesis Kapiler (8) Elektroforesis Selulosa Asetat (9) Elektroksimat
Isoelektrik dan Elektroforesis Gel Dua Dimensi dan (10) Elektroforesis Microchip.
Teknik # 1. Sistem Elektroforesis Gel Horizontal dan Vertikal :
Peralatan yang dibutuhkan untuk elektroforesis pada dasarnya terdiri dari dua item, paket tenaga
dan unit elektroforesis. Unit elektroforesis tersedia untuk menjalankan sistem gel vertikal atau
horizontal. Unit gel slab vertikal tersedia secara komersial dan rutin digunakan untuk
memisahkan protein dalam gel akrilamida.
ADVERTISEMENTS:

Gel tersebut terbentuk di antara dua pelat kaca yang dijepit bersama namun dipegang oleh spacer
elektrik.
Unit yang paling umum digunakan adalah aparatus gel mini yang disebut. Dimensi gel biasanya
berukuran 8,5 cm x 5 cm, dengan ketebalan 0,5-1 mm. Sisir plastik ditempatkan dalam larutan
gel dan dikeluarkan setelah polimerisasi untuk menyediakan sumur pemuatan sampai 10
sampel. Ketika peralatan dipasang, penyangga tangki elektroforesis yang lebih rendah
mengelilingi pelat gel dan memberi beberapa pendinginan pelat gel. Sistem gel horisontal khas
ditunjukkan pada Gambar 8.1.

Gel dilemparkan pada kaca atau lembaran plastik dan ditempatkan pada piring pendingin
(permukaan terisolasi yang melaluinya air pendingin dilewatkan untuk menghasilkan panas yang
dihasilkan). Sambungan antara gel dan penyangga elektroda dibuat dengan menggunakan
gumpalan tebal kertas saring basah. Namun, perlu dicatat bahwa gel agarose untuk elektroforesis
DNA dilarutkan dalam buffer.
ADVERTISEMENTS:

Paket daya memasok arus searah antara elektroda pada unit elektroforesis. Semua elektroforesis
dilakukan dalam buffer yang sesuai, yang penting untuk mempertahankan keadaan konstan
ionisasi dari molekul yang dipisahkan. Setiap variasi pH akan mengubah muatan keseluruhan
dan karenanya mobilitas (tingkat migrasi di bidang terapan) dari molekul dipisahkan.

Teknik # 2. Agarose Gel Elektroforesis :

Agarose adalah polisakarida linier (massa molekul relatif rata-rata sekitar 12000) yang terdiri
dari unit pengikat dasar agarobiose, yang terdiri dari unit bolak-balik galaktosa dan 3, 6-
anhidrogalaktan (Gambar 8.4).
Agarose adalah salah satu komponen agar-agar yaitu campuran polisakarida yang diisolasi dari
rumput laut tertentu. Agarose biasanya digunakan pada konsentrasi antara 1% dan 3%. Gel
Agarose dibentuk dengan cara menangguhkan agarosa kering dalam buffer berair, lalu
mendidihkan campuran sampai larutan bening terbentuk. Ini dituangkan dan dibiarkan dingin
sampai suhu kamar membentuk gel yang kaku.
Sifat gelling dihubungkan dengan ikatan hidrogen antar dan intermolekul di dalam dan di antara
rantai agarosa yang panjang. Struktur cross-linked ini memberi gel sifat anti-konvensional yang
baik. Ukuran pori dalam gel dikontrol dengan konsentrasi awal agarosa; Ukuran pori-pori besar
terbentuk dari konsentrasi rendah dan ukuran pori-pori yang lebih kecil terbentuk dari
konsentrasi yang lebih tinggi.
Meskipun pada dasarnya bebas dari muatan, penggantian residu gula bergantian dengan
kelompok karboksil, metoksil, piruvat dan khusus sulfat terjadi pada berbagai tingkat. Substitusi
ini dapat menyebabkan elektroendoosmosis selama elektroforesis dan interaksi ionik antara gel
dan sampel dalam semua kegunaan, keduanya merupakan efek yang tidak diinginkan. Agarose,
oleh karena itu, dijual dalam nilai kemurnian yang sangat berbeda, berdasarkan konsentrasi sulfat
- semakin rendah kadar sulfat semakin tinggi kemurniannya.
Gel agarosa digunakan untuk elektroforesis protein dan asam nukleat. Untuk protein, ukuran pori
gel agarose 1% berukuran besar relatif terhadap ukuran protein. Gel Agarose digunakan dalam
teknik seperti Immunoelectrophoresis atau fokus isoelektrik bedeng datar, dimana protein
diminta untuk bergerak tanpa hambatan dalam matriks gel sesuai dengan muatan aslinya.
ADVERTISEMENTS:

Gel pori besar seperti itu juga digunakan untuk memisahkan molekul yang jauh lebih besar
seperti DNA atau RNA, karena ukuran pori dalam gel masih cukup besar untuk molekul DNA
atau RNA untuk melewati gel. Namun, sekarang, ukuran pori dan ukuran molekul lebih
sebanding dan efek gesekan mulai berperan dalam pemisahan molekul ini.
Keuntungan lebih lanjut dari penggunaan agarose adalah tersedianya suhu lelehan rendah
agarose (62-65 ° C). Seperti namanya, gel ini dapat dicairkan ulang dengan pemanasan sampai
65 ° C dan dengan demikian, misalnya, sampel DNA yang dipisahkan dalam gel dapat dipotong
dari gel, dikembalikan ke larutan dan dipulihkan.

Karena elastisitas gel agarosa yang buruk dan akibatnya menghilangkannya dari tabung kecil,
sistem batang gel kadang-kadang digunakan, karena gel akrilamida tidak digunakan. Gel
lempengan horisontal selalu digunakan untuk fokus isoelektrik atau immunoelectrphoresis pada
agarose. Gel horisontal juga digunakan secara rutin untuk gel DNA dan RNA, walaupun sistem
vertikal telah digunakan oleh beberapa pekerja.

Agarose Gel Elektroforesis Asam Nukleat :

Asam nukleat adalah polimer yang terdiri dari unit nukleotida individu. Unit terhubung melalui
pengikat fosfat diester dari tulang punggung gula. Efek bersih dari keterkaitan ini adalah
memberi muatan negatif bersih kepada polimer. Dari hari-hari awal elektroforesis, aksiomatik
bahwa molekul yang membawa muatan listrik akan bermigrasi di medan listrik dengan cara yang
dapat diprediksi.
Ketika mengalami medan listrik, sebuah molekul yang membawa muatan negatif bersih akan
bermigrasi ke arah kutub positif dan sebuah molekul dengan muatan positif bersih akan
bermigrasi ke kutub negatif. Dalam matriks semi padat seperti agarosa, persamaan yang
menggambarkan mobilitas dapat diinterpretasikan kembali, paling tidak secara heuristik, dengan
menentukan kerapatan gel gas atau konsentrasi dan r sebagai panjang molekul.
Jadi, ketika mereka ditempatkan dalam matriks semi-padat gel, asam nukleat akan bermigrasi ke
kutub positif dengan cara yang dapat diprediksi dan dapat direproduksi yang dapat digambarkan
sebagai fungsi eksponensial negatif panjang. Artinya, molekul yang lebih pendek akan
bermigrasi lebih cepat dan molekul yang lebih lama akan bermigrasi lebih lambat. Memang,
dalam kasus asam nukleat dalam gel di medan listrik, setiap elemen ekspresi migrasi lainnya
adalah konstan dan mobilitas benar-benar ditentukan oleh panjang molekul.
Sebagai soal latihan, sulit untuk secara akurat menyelesaikan asam nukleat untai ganda yang
lebih kecil dari sekitar 100 basa dalam gel agarosa karena sifat pengayakan agarosa tidak cukup
baik. Di ujung lain dari skala, molekul lebih panjang dari sekitar 25.000 bp tapi lebih pendek dari
sekitar 2.000.000 bp semua akan berjalan pada tingkat yang sama. Ini disebut mobilitas terbatas.

Molekul asam nukleat lebih panjang dari 2.000.000 bp bahkan tidak akan memasuki gel
agarosa. Dengan demikian, kisaran ukuran efektif untuk elektroforesis gel agarose dari asam
nukleat terdampar ganda adalah antara 100 bp dan 25.000 bp. Dalam rentang ini, perilaku
molekul tepat dan dapat diprediksi. Perilaku ini ditunjukkan pada Gambar 8.8. Seperti yang bisa
dilihat ada pemisahan minimal fragmen yang lebih besar namun resolusi membaik saat fragmen
semakin kecil.

Sementara fenomena ini telah diketahui selama bertahun-tahun, yang tidak diketahui adalah
bagaimana molekul asam nukleat benar-benar bergerak dalam matriks gel. Pada tahun 1980an
sebuah teori diajukan bahwa asam nukleat bermigrasi melalui gel dengan cara yang sama seperti
gerakan ular. Artinya, ujung tombak bergerak maju dan menarik sisa molekul dengan itu.
Dalam model ini, karena molekul semakin tahan lama ditarik seiring pertambahan. Resistensi ini
semakin meningkat dengan interaksi molekul dengan matriks gel. Peningkatan resistansi adalah
non linier. Model ini, yang disebut "replikasi bias", cukup untuk menjelaskan semua perilaku
asam nukleat dalam matriks semi-padat (Lerman et al, 1982; Lumpkin et al., 1985).
Pada tahun 1989 sebuah kelompok di University of Washington menguji teori ini. Mereka
memfilmkan molekul DNA yang bergerak melalui gel agarosa. Film mereka menunjukkan baik
reptasi dan interaksi matriks asam nukleat / gel (Smith et al., 1989).
Pada pertengahan 1980an sejumlah metode dikembangkan untuk menganalisis secara
elektroforesis molekul asam nukleat dalam kisaran ukuran mobilitas yang membatasi. Solusinya
melibatkan artifisial memasukkan mobilitas tergantung ukuran pada molekul asam nukleat
dengan mengubah medan elektroforesis. Perubahan pertama yang terjadi hanya mengubah
polaritas lapangan dalam pola biasa. Carle dkk. (1986) menunjukkan bahwa pembalikan
polaritas secara periodik akan menginduksi molekul untuk membuat putaran U dalam gel.
Bahkan pada ukuran yang sangat besar, putaran ini akan memungkinkan pemisahan
molekul. Dalam jangka waktu molekul-molekul tersebut dibalik adalah sekitar sepertiga waktu
yang mereka orientasikan ke depan, misalnya tiga detik ke depan dan satu detik ke belakang,
molekul sebesar 2.000.000 bp dapat diatasi dalam gel agarose standar dalam beberapa jam.
. Demonstrasi praktis pertama dari metode ini, yang disebut Field Inversion Gel Electrophoresis
(FIGE), adalah untuk menyelesaikan kromosom ragi utuh. Sejak itu, berbagai metode, secara
kolektif disebut elektroforesis gel medan berdenyut, telah dikembangkan.

Banyak laboratorium secara rutin menggunakan gel 0,8%, yang cocok untuk memisahkan
molekul DNA dalam kisaran 0,5 - 10 kb. Sejak gel agarosa memisahkan DNA sesuai dengan
ukuran, M r dari fragmen DNA dapat ditentukan dari mobilitas elektroforesis dengan
menjalankan sejumlah penanda DNA standar yang dikenal M r pada gel yang sama. Ini paling
mudah dicapai dengan menjalankan sampel bakteri β DNA (49 kb) yang telah dibekukan dengan
enzim restriksi seperti EcoRI. Karena urutan dasar DNA λ diketahui, dan lokasi pembelahan
untuk EcoRl diketahui, ini menghasilkan fragmen dengan ukuran yang diketahui secara akurat.
Gel DNA selalu dijalankan sebagai gel horisontal, gelang bawah laut atau terendam; Dinamakan
demikian karena gel seperti itu benar-benar terbenam dalam buffer. Agarose, dilarutkan dalam
buffer gel dengan cara mendidih, dituangkan ke atas gelas atau piring plastik, dikelilingi oleh
dinding pita perekat atau bingkai plastik untuk memberi gel sekitar 3 mm secara
mendalam. Sumur pemuatan dibentuk dengan menempatkan kerangka pembentuk plastik atau
sisir dalam larutan gel menuangkan, dan melepaskan sisir ini setelah gel disetel.
Gel ditempatkan di tangki elektroforesis, ditutup dengan penyangga, dan sampel dimuat dengan
langsung menyuntikkan sampel ke dalam sumur. Sampel disiapkan dengan melarutkannya dalam
larutan penyangga yang mengandung sukrosa, gliserol atau Ficoll, yang membuat larutan
menjadi padat dan memungkinkannya tenggelam ke dasar sumur. Pewarna seperti biru
bromophenol juga termasuk dalam pelarut sampel; itu membuat lebih mudah untuk melihat
sampel yang sedang dimuat dan juga bertindak sebagai penanda depan elektroforesis.
Tidak ada gel susun yang diperlukan untuk elektroforesis DNA karena mobilitas molekul DNA
jauh lebih besar di dalam sumur daripada di dalam gel, dan oleh karena itu, semua molekul di
tumpukan sumur melawan gel dalam beberapa menit saat ini berbalik. pada, membentuk band
yang ketat pada awal lari.
Gel tujuan umum berukuran sekitar 25 cm dan lebar 12 cm, dan dijalankan pada gradien
tegangan sekitar 1,5 V cm -1 dalam semalam. Tegangan yang lebih tinggi akan menyebabkan
pemanasan berlebihan. Untuk analisis cepat yang tidak memerlukan pemisahan molekul DNA
secara ekstensif, biasanya menggunakan gel mini yang panjangnya kurang dari 10 cm. Dengan
cara ini informasi bisa didapat dalam 2-3 jam.

Begitu sistem telah berjalan, DNA dalam gel perlu diwarnai dan divisualisasikan. Reagen yang
paling banyak digunakan adalah pewarna pewarna etidium bromida. Gel tersebut dibilas dengan
lembut dalam larutan etidium bromida (0,5 μg cm -1 ) dan kemudian dilihat di bawah sinar
ultraviolet (panjang gelombang 300 nm). Ethidium bromide adalah molekul planar siklik yang
mengikat antara pasangan DNA bertumpuk (yaitu intercalates).
Konsentrasi etidium bromida, oleh karena itu, terbentuk di tempat pita DNA dan di bawah sinar
ultraviolet, pita DNA berpendar merah oranye. Sekecil 10 ng DNA dapat divisualisasikan
sebagai pita lebar 1 cm. Perlu dicatat bahwa penampakan DNA yang luas dengan sinar
ultraviolet dapat menyebabkan kerusakan DNA dengan merembesnya dan dimerisasi pasangan.
Ini tidak ada konsekuensinya jika gel hanya untuk dilihat, tapi yang jelas melihat gel harus dijaga
seminimal mungkin jika DNA itu harus dipulihkan. Hal ini penting untuk melindungi mata
seseorang dengan memakai kacamata saat sinar ultraviolet digunakan. Jika melihat gel di bawah
sinar ultraviolet dilakukan dalam waktu lama, masker plastik yang menutupi seluruh wajah harus
digunakan untuk menghindari 'sengatan sinar matahari'.

DNA Sequencing Gels :

Meskipun elektroforesis gel agarose dari DNA adalah teknik 'pekerja keras' untuk ahli biologi
molekuler, bentuk elektroforesis yang berbeda harus digunakan saat sekuens DNA
ditentukan. Apapun metode sekuensing DNA yang digunakan, analisis akhir biasanya
melibatkan pemisahan molekul DNA beruntai tunggal yang lebih pendek dari sekitar 1000 nt dan
ukurannya berbeda hanya dengan 1 nt.
Untuk mencapai hal ini perlu memiliki gel kecil dan gel akrilamida digunakan sebagai pengganti
agarosa. Misalnya, gel poliakrilamida 3,5% digunakan untuk memisahkan DNA pada kisaran 80-
1000 nt dan gel 12% untuk memecahkan fragmen antara 20-100 nt. Jika berbagai ukuran
dianalisis, seringkali mudah untuk menjalankan gel gradien, misalnya dari 3,5% sampai 7,5%.
Sequencing gel dijalankan dengan adanya agen denaturasi, urea dan amida bentuk. Karena perlu
untuk memisahkan molekul DNA yang sangat mirip ukurannya, gel DNA sequencing cenderung
sangat panjang (100 cm) untuk memaksimalkan pemisahan yang dicapai. Gel pengurutan DNA
yang khas ditunjukkan pada Gambar 8.12.
Seperti disebutkan di atas, elektroforesis pada agarose dapat digunakan sebagai metode
preparatif untuk DNA.
Banding DNA yang menarik dapat dipotong dari gel dan DNA dipulihkan dengan:
(a) elusi elektroda,
(b) Meratakan potongan gel dalam buffer, sentrifugasi dan mengumpulkan supernatan; atau
(c) Jika titik lelehan titik leleh rendah digunakan, mencairkan gel dan menipiskan dengan
penyangga.
Dalam setiap kasus, DNA akhirnya ditemukan kembali dengan pengendapan supernatan dengan
etanol.
Pulsed-field Gel Elektroforesis :
Memanipulasi dan analisis DNA sangat mendasar dalam bidang biologi molekular. Memang,
memisahkan campuran kompleks DNA ke dalam fragmen berukuran berbeda dengan
elektroforesis adalah teknik yang mapan pada awal 1970an. Biasanya, DNA diisolasi secara utuh
dan kemudian diolah dengan enzim restriksi untuk menghasilkan potongan yang cukup kecil
untuk diselesaikan dengan elektroforesis pada agarosa atau akrilamida. Meskipun prosedur ini
masih merupakan inti pemisahan dan analisis DNA di laboratorium hari ini, aturan pemisahan
telah berubah.
Pada tahun 1984, Schwartz dan Cantor menggambarkan elektroforesis gel medan berdenyut
(PFGE), memperkenalkan cara baru untuk memisahkan DNA. Secara khusus, PFGE
memecahkan DNA yang sangat besar untuk pertama kalinya, meningkatkan batas ukuran atas
pemisahan DNA pada agarose dari 30-50 kb sampai lebih dari 10 Mb (10.000 kb). Sekarang,
alih-alih mengkloning sejumlah besar fragmen kecil DNA, PFGE mengizinkan kloning dan
analisis sejumlah besar potongan genom yang sangat besar.
Meskipun teori elektroforesis medan berdenyut adalah masalah perdebatan, pernyataan kualitatif
dapat dibuat mengenai pergerakan DNA dalam gel agarosa selama PFGE. Selama elektroforesis
medan terus menerus, DNA di atas 30-50 kb bermigrasi dengan mobilitas yang sama terlepas
dari ukurannya. Ini terlihat dalam gel sebagai band berdiferensiasi besar. Jika, bagaimanapun,
DNA dipaksa untuk mengubah arah selama elektroforesis, fragmen berukuran berbeda dalam
pita diffuse ini mulai terpisah satu sama lain.
Dengan setiap reorientasi medan listrik relatif terhadap gel, DNA berukuran lebih kecil akan
mulai bergerak ke arah yang baru lebih cepat daripada DNA yang lebih besar. Dengan demikian,
DNA yang lebih besar tertinggal, memberikan pemisahan dari DNA yang lebih kecil. Saat ini,
ada tiga model yang mencoba menggambarkan perilaku DNA selama PFGE, model replikasi
bias (BRM), model rantai, dan yang terakhir, model tas.
Instrumentasi :
Meskipun banyak jenis instrumentasi PFGE tersedia (Gambar 8.13), keduanya umumnya terbagi
dalam dua kategori. Peralatan yang paling sederhana dirancang untuk elektroforesis gel inversion
medan (FIGE). FIGE bekerja dengan membalikkan polaritas elektroda secara temporal selama
elektroforesis. Karena FIGE mengarahkan DNA ke reorientasi 180 °, DNA menghabiskan
sejumlah waktu yang bergerak mundur.
Hanya modul switching medan listrik yang dibutuhkan; Setiap kotak gel standar vertikal atau
horizontal yang memiliki kontrol suhu dapat digunakan untuk menjalankan gel. Meski lebih
kompleks dalam pendekatannya, zero integrated field electrophoresis (ZIFE) juga termasuk
dalam kategori pertama ini. Dibandingkan dengan FIGE sederhana, ZIFE sangat lambat. Namun,
ZIFE mampu menyelesaikan DNA yang lebih besar dan memberikan porsi gel yang lebih besar.
Kategori lainnya berisi instrumen yang mereorientasi DNA pada sudut miring yang lebih kecil,
umumnya antara 96 ° dan 120 °. Hal ini menyebabkan DNA untuk selalu bergerak maju dalam
pola zigzag di dalam gel. Untuk rentang ukuran yang sama di bawah kondisi optimal, pemisahan
ini lebih cepat, selesaikan rentang ukuran yang lebih luas, dan berikan bagian gel yang lebih
besar dibandingkan dengan bagian kontra lainnya.
Kontur medan listrik homogen (CHEF); elektroforesis medan bergantian transversal (TAFE) dan
ST / RIDEtm relatif; dan rotating gel electrophoresis (RGE) adalah contoh teknik reorientasi
sudut transversal yang umum digunakan dimana instrumentasi tersedia.
Dalam penjelasan lebih lanjut mengenai prosedur di atas, Lai dan rekan kerja mengembangkan
unit elektroforesis terkontrol yang dapat diprogram dengan otonom (PACE) yang
memungkinkan kontrol penuh terhadap sudut reorientasi, voltase, dan waktu saklar. Berbeda
dengan FIGE, sistem ini memerlukan kotak gel khusus dengan geometri elektroda dan gel
khusus, dan kontrol elektronik terkait untuk beralih dan memprogram elektroforesis.
Idealnya, DNA harus terpisah dalam jalur lurus untuk menyederhanakan perbandingan jalur-ke-
jalur. Sistem medan pulsed asli menggunakan medan listrik tidak homogen yang tidak
menghasilkan jalur lurus, sehingga interpretasi gel menjadi sulit. Sekali lagi, pendekatan yang
paling sederhana untuk jalur lurus adalah GAMBAR, yang menggunakan elektroda paralel untuk
menjamin medan listrik homogen.
Meskipun sangat berguna untuk memisahkan DNA yang relatif kecil, 4- 1.000 kb (Gambar
8.14), sudut reorientasi FIGE 180 ° menghasilkan jarak pemisahan yang paling berguna di bawah
2.000 kb. Selanjutnya, seperti teknik PFGE lainnya, FIGE memiliki inversi mobilitas dimana
DNA yang lebih besar dapat bergerak maju dari DNA yang lebih kecil selama elektroforesis.
Ramping, dimana panjang pulsa reorientasi terus meningkat selama pemisahan, akan
meminimalkan pembalikan. Kemampuan ini termasuk dalam kebanyakan instrumentasi
komersial. Meningkatkan pemisahan dan resolusi DNA besar memerlukan sudut reorientasi yang
lebih kecil, umumnya 96-140 ° dengan 120 ° paling umum. Sudut yang lebih kecil (misalnya,
100 °) meningkatkan mobilitas DNA secara umum tanpa mempengaruhi resolusi secara
serius. Batas bawahnya kira-kira 96 °. Di bawah ini, pemisahan dikompromikan dengan serius.
TAFE dan ST / RIDEtm menggunakan geometri rumit antara elektroda dan gel yang
ditempatkan secara vertikal untuk mendapatkan jalur lurus. CHEF dan RGE mempertahankan
medan listrik homogen dalam kombinasi dengan gel horizontal. CHEF mengubah arah medan
listrik secara elektronik untuk mengarahkan kembali DNA dengan mengubah polaritas susunan
elektroda. Dengan RGE medan listriknya tetap; Untuk memindahkan DNA ke arah yang baru,
gel hanya berputar.
Rotating Gel Elektroforesis :
RGE adalah salah satu perkenalan peralatan lapangan berdenyut terbaru dan menggabungkan
sudut variabel dengan medan listrik homogen. Elektroda diposisikan di sisi berlawanan dari
ruang penyangga dengan polaritasnya tetap. Secara singkat, gel dilemparkan ke piring melingkar
dan kemudian ditempatkan di ruang penyangga. Gel tersebut digabungkan ke drive magnetik di
bawah ruang penyangga untuk menghilangkan kemungkinan kebocoran yang dapat
menyebabkan hubungan langsung.
Untuk memaksa DNA yang bermigrasi ke arah yang baru, penggerak magnetik hanya memutar
gel ke sudut yang baru. Karena sudut reorientasi DNA ditentukan oleh kopling mekanis
langsung, RGE menawarkan banyak fleksibilitas dengan biaya rendah. Waktu voltase, sudut, dan
pulsa bervariasi dengan program yang tersimpan dalam memori unit.
Seiring dengan kemampuan untuk memisahkan DNA besar, dibutuhkan persiapan dan prosedur
penanganan sampel yang baru. DNA besar (misalnya kromosom ragi) mudah dicukur dan juga
sulit untuk pipet karena viskositasnya yang tinggi. Solusi untuk masalah ini adalah pertama kali
menanamkan bakteri atau ragi di steker agarose dan kemudian merawat busi dengan enzim untuk
mencerna dinding sel dan protein, sehingga meninggalkan DNA telanjang yang tidak rusak di
dalam agarosa. Colokan kemudian dipotong sesuai ukuran, diolah dengan enzim restriksi, jika
perlu, dimasukkan ke dalam sampel dengan baik, dan disegel di tempat dengan agarose.

Beberapa parameter bertindak bersamaan saat PFGE. Ini akan dibahas secara singkat di bawah
karena berhubungan dengan instrumen bidang melintang seperti RGE. Jumlah minimum
informasi yang diperlukan untuk mengulang pemisahan harus mencakup penjelasan singkat
tentang instrumentasi lapangan berdenyut yang digunakan; Tegangan dan kekuatan medan
terapan (misalnya 180 V pada 5,3 V / cm); panjang pulsa (misalnya 87 detik); sudut reorientasi
(misalnya, 120 °); penyangga (0.5X TBE); jenis dan konsentrasi agarosa; suhu ruang penyangga
(misalnya, 10 ° C); jenis standar; dan, jika memungkinkan, jumlah DNA yang dimuat.
Meskipun data yang tercantum di atas diperlukan untuk mereproduksi pemisahan dengan baik,
informasi yang diberikan dalam publikasi jarang lengkap ini. Sebagian besar sistem PFGE
memisahkan DNA di atas area yang relatif kecil, sehingga membatasi resolusi sampel
kompleks. RGE adalah pengecualian untuk ini, dengan jarak pemisah yang berguna hingga 20
cm dan ukuran gel maksimum 18 × 20 cm.
Kekuatan lapangan memiliki efek mendalam pada pemisahan bidang berdenyut dan merupakan
kompromi antara waktu pemisahan dan resolusi kelas ukuran tertentu. Empat sampai enam volt /
cm umumnya diperlukan untuk menyelesaikan DNA sampai 2000 kb (misalnya kromosom S.
cerevisiae) dalam jangka waktu yang wajar (misalnya 1-2 hari).
Namun, kekuatan bidang ini menjebak dan melumpuhkan DNA yang lebih besar lagi dalam
matriks agarose, dan DNA> 3000 kb memerlukan 2 V / cm atau kurang untuk pemisahan. Waktu
pulsa terutama mengubah rentang ukuran pemisahan. Waktu pulsa yang lebih lama
menyebabkan pemisahan DNA yang lebih besar. Sebagai contoh, pada 5,4 V / cm, kromosom
1,6 Mb dan 2,2 Mb dari S. cerevisiae terpisah sebagai pita tunggal dengan panjang pulsa 90
detik.
Meningkatkan panjang pulsa hingga 120 detik memutuskan ini menjadi dua band. Setiap sudut
antara 96 ° dan 165 ° menghasilkan pemisahan kira-kira setara. Semakin kecil sudutnya, semakin
cepat mobilitas DNA. Dan untuk memisahkan DNA yang sangat besar, 96 ° sampai 105 ° hampir
merupakan persyaratan untuk mendapatkan perpisahan yang baik dalam waktu sesingkat
mungkin.
Jenis agarose juga mempengaruhi pemisahan DNA, dengan mobilitas tercepat dan resolusi
terbaik dicapai pada gel yang terbuat dari elektroforesosmosis rendah (EEO) agarose. Meskipun
sebagian besar nilai elektroforesis standar agarosa cocok untuk PFGE, agarose dengan EEO
minimal akan memberikan pemisahan yang lebih cepat. Beberapa nilai lapangan "medan pulpa"
EEO rendah tersedia, termasuk Fast Lane and Gold, dan Megarose.
Konsentrasi agarosa mempengaruhi resolusi dan mobilitas DNA. Konsentrasi tinggi agarose
menghasilkan lebih tajam, tapi band bergerak lambat. Dan konsentrasi khas yang digunakan
(0,8-1,2%) merupakan tradeoff antara kecepatan dan resolusi. Persentase tinggi agarosa EEO
rendah dapat memperbaiki resolusi tanpa mengorbankan kecepatan pemisahan. Karena mobilitas
DNA juga tergantung pada suhu pemisahan, suhu harus konstan baik selama dan di antara
putaran. Meskipun suhu yang lebih tinggi meningkatkan mobilitas DNA, hal itu terjadi dengan
mengorbankan resolusi.
Elektroforesis RNA :
Seperti DNA, elektroforesis RNA dilakukan dalam gel agarosa; dan prinsip pemisahan,
berdasarkan ukurannya, adalah sama. Seringkali seseorang memerlukan metode cepat untuk
memeriksa integritas RNA segera setelah ekstraksi tapi sebelum memutuskan apakah akan
memprosesnya lebih lanjut. Hal ini dapat dicapai dengan mudah dengan elektroforesis dalam gel
agarose 2% sekitar 1 jam. RNA ribosom (18 S dan 28 S) dipecahkan dengan jelas dan degradasi
apapun (dilihat sebagai bekas luka) atau kontaminasi DNA terlihat mudah.
Namun, jika resolusi yang lebih besar diperlukan, gel akrilamida yang lebih kecil dipoles
digunakan untuk meningkatkan resolusi, misalnya untuk menyelesaikan RNA transfer (4 S) dari
5 RNA ribosom R. Hal ini dapat dicapai pada gel gradien akrilamida 2,5-5% dengan putaran
semalam. Kedua metode ini melibatkan menjalankan RNA asli. Hampir pasti ada beberapa
struktur sekunder di dalam molekul RNA karena ikatan hidrogen intermolekuler. Untuk alasan
ini RNA asli yang dijalankan pada gel dapat diwarnai dan divisualisasikan dengan etidium
bromida.
Namun, jika tujuan penelitiannya adalah untuk menentukan ukuran RNA dengan elektroforesis
gel, denaturasi penuh RNA diperlukan untuk mencegah pembentukan ikatan hidrogen di dalam
atau bahkan di antara polinukleotida yang akan mempengaruhi mobilitas elektroforesis. Ada tiga
agen denaturasi (formaldehid, glyoxal dan methyl mercuric hydroxide) yang kompatibel dengan
kedua RNA dan agarose.
Salah satu dari ini dapat dimasukkan ke dalam gel agarose dan buffer elektroforesis, atau sampel
didenaturasi panas dengan adanya denaturant sebelum elektroforesis. Setelah denaturasi panas,
masing-masing agen ini membentuk saluran dengan gugus amino guanin dan urasil, sehingga
reformasi ikatan hidrogen pada suhu kamar selama elektroforesis.
Hal ini juga diperlukan untuk menjalankan gel denaturasi jika RNA harus dihapus dan diperiksa,
untuk memastikan bahwa urutan dasar tersedia untuk pemeriksaan. Noda RNA denaturasi hanya
sangat lemah dengan etidium bromida, sehingga oranye akrilin biasa digunakan untuk
memvisualisasikan RNA atau gel denaturasi. Namun, perlu dicatat bahwa banyak pekerja akan
menggunakan RNA radiolabelled dan karena itu, akan mengidentifikasi pita dengan
autoradiografi. Contoh elektroforesis RNA ditunjukkan pada Gambar 8.16.
Teknik # 3 . Gel Poliakrilamida:
Elektroforesis pada gel akrilamida sering disebut sebagai PAGE, yang merupakan singkatan
elektroforesis gel Polyacrylamide. Gel poliakrilamida cross-linked terbentuk dari polimerisasi
monomer akrilamida dengan adanya sejumlah NN-methylenebisacrylamide (biasanya disebut
sebagai bisakrilamida) (Gambar 8.17). Perhatikan bahwa bisakrilamida pada dasarnya adalah dua
unit molekul akrilamida yang dihubungkan oleh kelompok metilena, dan digunakan sebagai agen
penghubung silang.
Monomer akrilamida dipolimerisasi dengan gaya kepala ke ekor menjadi rantai panjang dan
kadang-kadang molekul bisakrilamida dibangun ke dalam rantai yang tumbuh, sehingga
memperkenalkan situs kedua untuk perluasan rantai. Dengan cara ini matriks cross-linked dari
struktur yang cukup terdefinisi dengan baik terbentuk, polimerisasi akrilamida adalah contoh
katalisis radikal bebas, dan diawali dengan penambahan amonium per-sulfat dan basis N, N, N ' ,
N'-tetra-methylenediamine (TEMED). TEMED mengkatalisis dekomposisi ion per-sulfat untuk
memberi radikal bebas (yaitu, molekul dengan elektron yang tidak berpasangan):

Jika radikal bebas ini direpresentasikan sebagai R * (di mana titik mewakili elektron yang tidak
berpasangan) dan M sebagai molekul monomer akrilamida, maka polimerisasi dapat ditunjukkan
sebagai berikut:

Radikal bebas sangat reaktif karena adanya elektron tak berpasangan yang perlu dipasangkan
dengan elektron lain untuk menstabilkan molekul. R *, oleh karena itu, bereaksi dengan M,
membentuk ikatan tunggal dengan membagi elektronnya yang tidak berpasangan dengan yang
dari kulit luar molekul monomer.
Dengan cara ini rantai akrilamida yang panjang terbentuk, dihubungkan silang oleh pengenalan
molekul bisakrilamida sesekali ke dalam rantai oksigen yang bereproduksi yang memberantas
radikal bebas dan, oleh karena itu, semua larutan gel biasanya dihilangkan (larutan secara singkat
ditempatkan di bawah vakum sampai lepaskan udara terlarut longgar) sebelum digunakan.
Kehilangan larutan gel juga berfungsi untuk tujuan kedua. Polimerisasi akrilamida adalah reaksi
eksotermik (yaitu, panas dilepaskan) dan pemanasan gel karena set dapat membebaskan
gelembung udara yang terjebak dalam gel polimerisasi. Langkah degassing mencegah
kemungkinan ini.
Foto-polimerisasi adalah metode alternatif yang dapat digunakan untuk mempolimerisasi gel
akrilamida. Ammonium per-sulfat dan TEMED digantikan oleh riboflavin dan bila gel dituang
itu diletakkan di depan cahaya terang selama 2-3 jam. Photodecomposition dari riboflavin
menghasilkan radikal bebas yang memulai polimerisasi.
Gel akrilamida didefinisikan berdasarkan persentase total akrilamida, dan ukuran pori dalam gel
dapat divariasikan dengan mengubah konsentrasi akrilamida dan bisakrilamida. Gel akrilamida
dapat dibuat dengan kandungan antara 3% dan 30% akrilamida.
Dengan demikian persentase gel yang rendah (misalnya, 4%) memiliki ukuran pori yang besar
dan digunakan, misalnya pada elektroforesis protein, bila pergerakan bebas protein dengan
elektroforesis diperlukan tanpa efek gesekan yang nyata dan contoh lainnya, fokus isoelektrik
tempat tidur atau sistem gel susun gel SDS-poliakrilamid.
Persentase gel akrilamida rendah juga digunakan untuk memisahkan DNA. Gel yang
mengandung antara 10% sampai 20% akrilamida digunakan dalam teknik seperti elektroforesis
SDS-gel, dimana ukuran pori yang lebih kecil sekarang memperkenalkan efek pengayakan yang
berkontribusi terhadap pemisahan protein sesuai ukurannya.
Protein awalnya dipisahkan pada gel poliakrilamida yang dipolimerisasi dalam tabung kaca, kira-
kira berdiameter 7 mm dan panjangnya sekitar 10 cm. Tabung mudah diload dan dijalankan,
dengan persyaratan aparatus minimal. Namun, hanya satu sampel yang bisa dijalankan per
tabung dan, karena kondisi pemisahan bisa bervariasi dari tabung ke tabung, perbandingan antara
sampel yang berbeda tidak selalu akurat.
Pengenalan selanjutnya dari lempengan gel vertikal memungkinkan berlari hingga 20 sampel
dalam kondisi yang sama dalam satu putaran tunggal. Lembaran vertikal sekarang digunakan
secara rutin untuk analisis protein dan pemisahan fragmen DNA selama analisis urutan
DNA. Meskipun beberapa pekerja menyiapkan gel akrilamida mereka sendiri, yang lain membeli
gel siap pakai yang tersedia secara komersial untuk teknik seperti SDS-PAGE, gel asli dan fokus
isoelektrik (IEF).
Teknik # 4. Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamide Gel Elektroforesis:
Elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (SDS-PAGE) adalah metode yang paling banyak
digunakan untuk menganalisis campuran protein secara kualitatif. Ini sangat berguna untuk
memonitor pemurnian protein dan, karena metode ini didasarkan pada pemisahan protein sesuai
ukuran, ia juga dapat digunakan untuk menentukan massa molekul molekuler protein. SDS
(CH 3 - (CH 2 ) 10 -CH 2 OSO 3 -Na + ) adalah deterjen anionik.
Sampel yang akan dijalankan pada SDS-PAGE pertama direbus selama 5 menit dalam buffer
sampel yang mengandung β- mercaptoethanol dan SDS. Mecaptoethnol mengurangi jembatan
disulfida yang ada yang menyatukan struktur tersier protein, dan SDS mengikat kuat untuk, dan
mendenaturasi, protein. Setiap protein dalam campuran ini, oleh karena itu, didenaturasi secara
penuh oleh perawatan ini dan membuka ke dalam struktur berbentuk batang dengan serangkaian
molekul SDS bermuatan negatif di sepanjang rantai polipeptida.
Rata-rata, satu molekul SDS mengikat setiap dua residu asam amino. Tagihan asli asli pada
molekul ini, oleh karena itu, sepenuhnya dibanjiri oleh molekul SDS bermuatan negatif. Struktur
seperti batang tetap ada, karena setiap rotasi yang cenderung melipat rantai protein akan
mengakibatkan penolakan antara muatan negatif pada berbagai bagian rantai protein,
mengembalikan konformasi kembali ke bentuk batang.
Penyangga sampel juga mengandung pewarna pelacakan ionisable, biasanya biru bromophenol,
yang memungkinkan putaran elektroforesis dipantau, dan sukrosa atau gliserol, yang
memberikan kepadatan larutan sampel sehingga memungkinkan sampel untuk mudah
mengendap melalui penyangga elektroforesis ke bawah saat disuntikkan ke dalam muat dengan
baik
Sebelum loading ke gel sampel protein dilisiskan untuk denaturasi dengan merebusnya dalam
buffer lisis selama 10 menit. Penyangga lisis mengandung buffer untuk mempertahankan pH
bersamaan dengan gliserol sehingga membuat protein berat untuk diolah dengan benar di
sumur. Penyangga lisis juga memiliki SDS untuk memberi muatan negatif, DTT atau β-
mercaptoethanol untuk mengurangi ikatan disulfida dalam protein.
Setelah semua sampel dimuat, arus dilewatkan melalui gel. Sampel yang akan dipisahkan
sebenarnya tidak dimasukkan langsung ke dalam gel pemisah utama. Bila gel pemisah utama
(biasanya sekitar 5 cm) telah dituangkan di antara piring kaca dan dibiarkan diatur, gel susun
yang lebih pendek (kira-kira 0,5 cm) dituangkan di atas gel pemisah dan masuk ke dalam gel ini
bahwa sumur terbentuk dan protein dimuat.
Tujuan gel susun ini adalah untuk memusatkan sampel protein ke dalam pita tajam sebelum
memasuki gel pemisah utama. Hal ini dicapai dengan memanfaatkan perbedaan kekuatan ion dan
pH antara buffer elektroforesis dan buffer gel susun dan melibatkan fenomena yang dikenal
sebagai isotachophoresis.
Gel susun memiliki ukuran pori yang sangat besar (4% akrilamida), yang memungkinkan protein
bergerak bebas dan berkonsentrasi, atau menumpuk, di bawah pengaruh medan listrik. Efek
penajaman band ini bergantung pada fakta bahwa ion glikolat yang bermuatan negatif (pada
penyangga elektroforesis) memiliki mobilitas elektroforesis yang lebih rendah daripada
kompleks protein-SDS, yang pada gilirannya memiliki mobilitas lebih rendah daripada ion
klorida (CI - ) dari loading buffer dan buffer gel susun.
Saat arus dinyalakan, semua spesies ionik harus bermigrasi pada kecepatan yang sama dengan
CI - hanya jika berada di wilayah kekuatan medan tinggi. Kekuatan medan berbanding terbalik
dengan konduktivitas, yang sebanding dengan konsentrasi. Hasilnya adalah ketiga jenis bunga
tersebut menyesuaikan konsentrasinya sehingga [CI - ]> [protein-SDS]> [glycinate].
Hanya ada sejumlah kecil protein kompleks-SDS, sehingga mereka berkonsentrasi di band
sangat ketat antara glycinate dan CI - batas. Setelah gycinate mencapai gel pemisahan, ia menjadi
lebih terionisasi secara ionisasi di lingkungan pH yang lebih tinggi dan mobilitasnya
meningkat. (PH gel susun adalah 6,8, bahwa gel pemisahan adalah 8,8).
Dengan demikian, antarmuka antara glycinate dan CI - meninggalkan kompleks protein-SDS,
yang tersisa untuk elektroforesis dengan tarif sendiri. Kompleks protein-SDS yang bermuatan
negatif sekarang terus bergerak menuju anoda, dan karena mereka memiliki muatan yang sama
per satuan panjang, mereka melakukan perjalanan ke gel pemisah di bawah medan listrik terapan
dengan mobilitas yang sama.
Namun, saat mereka melewati gel pemisah, protein terpisah, karena sifat pengelupasan molekul
dari gel. Protein yang lebih kecil semakin mudah melewati pori-pori gel, sedangkan protein besar
berturut-turut terbelakang oleh resistansi gesekan akibat efek pengayak pada gel. Sebagai
molekul kecil, pewarna biru bromophenol sama sekali tidak terbelakang dan, oleh karena itu,
menunjukkan sisi elektroforesis.
Bila pewarna mencapai bagian bawah gel, arus dimatikan, dan gel dikeluarkan dari antara pelat
kaca dan dikocok dengan larutan noda yang sesuai dan kemudian dicuci dengan larutan
destain. Solusi destain menghilangkan pewarna latar yang tidak terikat dari gel, meninggalkan
protein bernoda yang terlihat sebagai pita biru pada latar belakang yang jelas.
Minigel yang khas akan memakan waktu sekitar 1 jam untuk disiapkan dan ditetapkan, 40 menit
untuk berlari pada 200 V dan memiliki waktu pewarnaan 1 jam dengan Coomassie Brilliant
Blue. Setelah de-pewarnaan, pita protein yang kuat akan terlihat di dalam gel dalam waktu 10-20
menit, namun pewarnaan semalam diperlukan untuk menghilangkan semua noda latar belakang
secara keseluruhan. Gel slab vertikal selalu dijalankan, karena ini memungkinkan sampel yang
berbeda hingga 10n dimasukkan ke dalam satu gel tunggal. Gel SDS-poliakrilamida khas
ditunjukkan pada Gambar 8.19.
Biasanya, gel pemisahan yang digunakan adalah gel polyacrylamide 15%. Ini memberi gel
ukuran pori tertentu dimana protein massa molekul relatif (M r ) 10.000 bergerak melalui gel
yang relatif tidak terhalang, sedangkan protein M r 10, 00.000 hanya bisa masuk ke dalam pori-
pori gel ini. Gel dari 15% poliakrilamida, oleh karena itu, berguna untuk memisahkan protein
dalam kisaran M r 1, 00.000 sampai 10.000.
Namun, protein M r1 , 50.000, misalnya, tidak dapat memasuki gel 15%. Dalam kasus ini gel
yang lebih besar (misalnya gel 10% atau bahkan 7,5%) akan digunakan sehingga protein
sekarang bisa masuk ke dalam gel dan diwarnai dan diidentifikasi. Sudah jelas; Oleh karena itu,
pilihan gel yang akan digunakan bergantung pada ukuran protein dalam kisaran gel akrilamida
persentase yang berbeda ditunjukkan pada Tabel 8.3.
Ini menunjukkan, misalnya, bahwa pada protein gel polyacrylamide 10% lebih besar dari 200
kDa dalam massa tidak dapat masuk ke dalam gel, sedangkan protein dengan massa molekul
relatif (M r ) pada kisaran 200.000 sampai 15.000 akan terpisah. Protein M r15.000 terlalu kecil
untuk mengalami efek pengayakan dari matriks gel, dan semuanya berjalan bersamaan sebagai
satu band di depan elektroforesis.
M r protein dapat ditentukan dengan membandingkan mobilitasnya dengan orang-orang dari
sejumlah protein standar diketahui M r yang dijalankan pada gel yang sama. Merencanakan
grafik jarak bergerak melawan log M r untuk masing-masing protein standar, kurva kalibrasi
dapat dikonstruksi. Jarak yang ditempuh oleh protein yang tidak diketahui M r kemudian diukur,
dan kemudian log M r dan karenanya M r dapat ditentukan dari kurva kalibrasi.
Elektroforesis SDS-gel sering digunakan setelah setiap langkah protokol pemurnian untuk
menilai kemurnian atau sampel lainnya. Protein murni harus memberi satu pita pada gel SDS-
poliakrilamida, kecuali molekulnya terdiri dari dua subunit yang tidak sama. Dalam kasus
terakhir, dua band, sesuai dengan dua subunit, akan terlihat.
Karena hanya jumlah protein sub-mikrogram yang dibutuhkan untuk gel, bahan yang sangat
sedikit digunakan dalam bentuk penilaian kemurnian ini dan pada saat bersamaan nilai untuk
molekul molekul relatif dapat ditentukan pada gel yang sama ( seperti yang dijelaskan di atas),
tanpa bahan yang digunakan.
Teknik # 5 . Gel asli (Buffer) :
Sementara SDS-PAGE adalah sistem gel yang paling sering digunakan untuk mempelajari
protein, metode ini tidak berguna jika seseorang bertujuan untuk mendeteksi protein tertentu
(seringkali enzim) berdasarkan aktivitas biologisnya, karena protein (enzim) didenaturasi dengan
prosedur SDS-PAGE. Dalam hal ini perlu digunakan kondisi non-denaturing.
Dalam gel asli atau gel, gel poliakrilamida kembali digunakan (biasanya gel 7.5%) namun SDS
tidak ada dan protein tidak terdenaturasi sebelum pemuatan. Karena semua protein dalam sampel
ini dianalisis membawa muatan asli mereka pada pH gel (biasanya pH 8,7), protein terpisah
sesuai dengan mobilitas elektroforesisnya yang berbeda dan efek pengayakan gel.
Oleh karena itu, tidak mungkin untuk memprediksi perilaku protein tertentu dalam gel
penyangga, tetapi karena kisaran biaya dan ukuran protein yang berbeda dalam campuran protein
tertentu, resolusi yang baik tercapai. Enzim yang diminati dapat diidentifikasi dengan
menginkubasi gel dalam larutan substrat yang tepat sehingga produk berwarna dihasilkan di
lokasi enzim.
Metode alternatif untuk mendeteksi enzim adalah memasukkan substrat dalam gel agarose yang
dituang di atas gel akrilamida dan dibiarkan diatur. Difusi dan interaksi enzim dan substrat antara
kedua gel menghasilkan formasi warna di lokasi enzim. Seringkali, sampel duplikat akan
berjalan di gel, gel dipotong setengah dan satu setengah diwarnai untuk aktivitas, yang lain untuk
protein total. Dengan cara ini, kandungan protein total sampel dapat dianalisis dan pita tertentu
yang sesuai dengan enzim yang diidentifikasi dengan mengacu pada aktivitas gel noda.
Teknik # 6 . Gel Gradien :
Ini lagi-lagi merupakan sistem gel poliakrilamida, namun alih-alih menjalankan slab gel dengan
ukuran pori seragam di seluruh (misalnya gel 15%), gel gradien terbentuk, di mana konsentrasi
akrilamida bervariasi secara merata dari 5% khas di bagian atas gel. sampai 25% akrilamida di
bagian bawah gel. Gradien terbentuk melalui mixer gradien dan mengalir turun di antara pelat
kaca dari gel slab.
Persentase tinggi akrilamida (misalnya 25%) dituang di antara pelat kaca terlebih dahulu dan
gradien terus menerus untuk menurunkan konsentrasi akrilamida berikut. Oleh karena itu, di
bagian atas gel ada ukuran pori yang besar (5% akrilamida) namun saat sampel bergerak turun,
konsentrasi akrilamida perlahan meningkat dan ukuran pori menurun.
Gel glukosa biasanya dijalankan sebagai gel SDS dengan gel staking. Ada dua keuntungan untuk
menjalankan gel gradien. Pertama, kisaran nilai protein M r yang jauh lebih besar dapat dipisahkan
daripada pada gel persentase tetap. Dalam campuran yang kompleks, protein dengan berat
molekul sangat rendah berjalan bebas melalui gel untuk memulai, dan mulai menyelesaikan saat
mereka mencapai ukuran pori-pori yang lebih kecil ke arah bagian bawah gel.
Protein yang jauh lebih besar, di sisi lain, masih bisa masuk gel tapi mulai terpisah segera karena
efek pengayakan gel. Keuntungan kedua dari gel gradien adalah protein dengan nilai M r
yang sangat mirip dapat diatasi, meskipun tidak dapat dipecahkan dalam gel persentase

tetap. Karena setiap protein bergerak melalui gel, ukuran pori menjadi lebih kecil sampai protein
mencapai batas ukuran pori-porinya.
Ukuran pori dalam gel sekarang terlalu kecil untuk memungkinkan aliran protein, dan tumpukan
sampel protein pada titik ini sebagai pita tajam. Protein berukuran serupa, namun dengan sedikit
lebih rendah M r , akan dapat melakukan perjalanan sedikit lebih jauh melalui gel sebelum
mencapai batas ukuran pori, pada titik mana ia akan membentuk sebuah band yang tajam. Kedua
protein ini, dengan nilai M r yang sedikit berbeda , oleh karena itu, terpisah sebagai dua pita tajam.
Teknik # 7 Elektroforesis Kapiler (CE) :
Proses elektroforesis didefinisikan sebagai 'pergerakan diferensial atau migrasi ion oleh daya
tarik atau tolakan dalam medan listrik' . Secara praktis, elektroda positif (anoda) dan negatif
(katoda) ditempatkan dalam larutan yang mengandung ion. Kemudian, ketika voltase diterapkan
di elektroda, ion zat terlarut dengan muatan berbeda, yaitu anion (negatif) dan kation (positif),
akan bergerak melalui larutan terhadap elektroda muatan berlawanan. Elektroforesis kapiler
adalah teknik melakukan elektroforesis pada kapiler padat isi-sempit, biasanya dari 25 sampai
100 mm diameter dalam (ID).
Instrumentasi :
Instrumentasi yang dibutuhkan untuk CE sangat sederhana dalam desain, seperti Gambar
8.20. Ujung kapiler ditempatkan di reservoir penyangga terpisah, masing-masing berisi elektroda
yang terhubung ke catu daya tegangan tinggi yang mampu menghasilkan hingga 30 kV. Sampel
disuntikkan ke kapiler dengan mengganti sementara salah satu reservoir penyangga (biasanya di
anoda) dengan reservoir sampel dan menerapkan potensial listrik atau tekanan eksternal selama
beberapa detik.
Setelah mengganti reservoir penyangga, potensial listrik diaplikasikan melintasi kapiler dan
pemisahan dilakukan. Deteksi optik (UV-visible atau fluorometric) dari analit yang terpisah
dapat dicapai secara langsung melalui dinding kapiler di dekat ujung yang berlawanan (biasanya
di dekat katoda). CE sangat cocok untuk otomatisasi, dan pengaturan instrumen CE komersial
akan terasa asing bagi mereka yang memiliki pengetahuan tentang HPLC modern.
Fitur dasar dari instrumen CE meliputi auto-sampler, modul deteksi, catu daya tegangan tinggi,
kapiler dan, tentu saja, komputer untuk mengendalikan semuanya. Jadi, jika kita menganggap
bahwa catu daya setara dengan pompa HPLC dan kapiler setara dengan kolom, instrumentasi
benar-benar analog. Hal ini terutama karena paket perangkat lunak yang digunakan untuk
mengendalikan sebagian besar instrumen CE komersial didasarkan pada perangkat lunak HPLC
yang ada.
Aliran Osmotik Elektro (EOF) :
Fitur penting dari CE adalah aliran bulk cairan melalui kapiler. Ini disebut aliran osmotik elektro
dan disebabkan sebagai berikut. Tabung kapiler silika yang tidak dilapisi biasanya digunakan
untuk CE. Permukaan bagian dalam tabung memiliki gugus silanol ionisable, yang bersentuhan
dengan penyangga selama CE. Kelompok silanol ini segera terdisosiasi, memberi dinding kapiler
sebagai muatan negatif.
Oleh karena itu, ketika kapiler diisi dengan penyangga, dinding kapiler bermuatan negatif
menarik ion bermuatan positif dari larutan penyangga, menciptakan lapisan ganda listrik dan
perbedaan potensial (potensi zeta) yang dekat dengan dinding kapiler, seperti yang dijelaskan
menurut model Stern di Gambar 8.21.
Model Stern untuk lapisan ganda listrik mencakup lapisan kaku ion yang teradsorpsi dan lapisan
yang menyebar, di mana difusi ion dapat terjadi dengan gerakan termal. Potensi zeta berpotensi
pada titik tertentu pada lapisan ganda dan menurun secara eksponensial dengan meningkatnya
jarak dari permukaan dinding kapiler.
Bila voltase diterapkan di kapiler, kation pada lapisan difus bebas untuk bermigrasi ke arah
katoda, membawa larutan massal dengan mereka. Hasilnya adalah arus netto ke arah katoda,
dengan kecepatan yang digambarkan oleh
v EOF = (ɛ 0 ɛξ / 4πη) E,
dimana ɛ 0 adalah konstanta dielektrik vakum, s adalah konstanta dielektrik dari buffer, ξ adalah
potensial zeta, η adalah viskositas penyangga dan E adalah medan listrik yang diterapkan. Istilah
yang dilingkupi kurung sama dengan mobilitas EOF (μ EOF ).
Hubungan antara mobilitas EOF dan kecepatan EOF analog dengan mobilitas elektroforesis dan
kecepatan migrasi. Memang, unit untuk mobilitas EOF sama dengan mobil elektroforesis.
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Mobilitas EOF :
Variabel utama yang mempengaruhi mobilitas EOF adalah konstanta dielektrik dan viskositas
buffer dan ukuran potensial zeta. Penggunaan aditif penyangga dan / atau modifikasi komposisi
penyangga lainnya dapat mempengaruhi konstanta dielektrik dan viskositas
penyangga. Viskositas penyangga juga tergantung pada suhu dimana pemisahan CE dilakukan.
Zeta Potensi :
Potensi zeta sebanding dengan kepadatan muatan pada dinding kapiler, yang juga bergantung
pada pH. Oleh karena itu, mobilitas EOF akan bervariasi sesuai pH penyangga, sehingga pada
pH tinggi mobilitas EOF akan jauh lebih besar daripada pH rendah. Gambar 8.22
menggambarkan variasi mobilitas EOF dengan pH untuk kapiler silika silika tipikal.
Di atas pH 9, silanol benar-benar terionisasi dan mobilitas EOF paling besar. Di bawah pH 4,
ionisasi silanol rendah dan mobilitas EOF tidak signifikan. Potensi zeta juga akan bergantung
pada kekuatan ion dari buffer, karena seiring kekuatan ion meningkat, lapisan ganda akan
dikompres, yang berakibat pada penurunan potensial zeta dan mengurangi mobilitas EOF.
Pada pH> 7, mobilitas EOF cukup untuk memastikan migrasi bersih sebagian besar ion ke
katoda, terlepas dari muatannya. Oleh karena itu, kecepatan migrasi zat terlarut yang diamati
mungkin tidak terkait langsung dengan mobilitas elektroforesisnya. Sebaliknya, ini terkait
dengan kombinasi mobilitas elektroforesis dan mobilitas EOF-nya. Oleh karena itu, mobilitas
elektroforesis zat terlarut (μ a ) yang dihitung dari kecepatan migrasi yang diamati, adalah jumlah
vektor dari mobilitas elektroforesisnya (atau e ) yang sesungguhnya (μ e ) dan mobilitas EOF
(μ EOF ), yaitu,
M a = M e + μ EOF .
Karena sampel biasanya diperkenalkan pada anoda dan bergerak EOF dari anoda ke katoda,
kation memiliki nilai positif μ e , netral memiliki nol μ e dan anion memiliki nilai negatif
μ e . Dengan kata lain, kation bermigrasi lebih cepat daripada EOF dan anion bermigrasi lebih
lambat dari pada EOF. Netral bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan EOF.
Profil Aliran di CE :
Fitur kunci lebih lanjut dari EOF adalah bahwa ia memiliki profil aliran datar, yang ditunjukkan
pada Gambar 8.23, di samping profil aliran parabola yang dihasilkan oleh pompa eksternal,
seperti yang digunakan untuk HPLC. EOF memiliki profil datar karena kekuatan pendorongnya
(yaitu, muatan pada dinding kapiler) terdistribusi secara merata di sepanjang kapiler, yang berarti
tidak ada tetes tekanan yang ditemukan dan kecepatan alirannya seragam di atas kapiler.
Ini berbeda dengan aliran yang didorong tekanan, seperti HPLC, di mana gaya gesek pada
dinding kolom menyebabkan penurunan tekanan di kolom, menghasilkan profil aliran parabola
atau laminar. Profil datar EOF penting karena meminimalkan perluasan zona, yang
menyebabkan efisiensi pemisahan tinggi yang memungkinkan pemisahan berdasarkan perbedaan
mobilitas sekecil 0,05%.
The Electropherogram :
Output data dari CE disajikan dalam bentuk electropherogram, yang analog dengan
kromatogram. Elektropherogram adalah plot waktu migrasi vs respons detektor. Respon detektor
biasanya tergantung pada konsentrasi, seperti absorbansi UV-visible atau fluoresensi. Munculnya
electropherogram khas ditunjukkan pada Gambar 8.24 untuk pemisahan tiga campuran
komponen zat terlarut kationik, netral dan anionik.
Teknik # 8. Elektroforesis Selulosa Asetat :
Meskipun salah satu metode yang lebih tua, elektroforesis selulosa asetat masih memiliki
sejumlah aplikasi, namun metode ini tetap digunakan dalam analisis klinis sampel
serum. Selulosa asetat memiliki kelebihan dibanding kertas, karena media ini lebih homogen,
dengan ukuran pori yang seragam, dan tidak menyerap protein seperti kertas itu.
Oleh karena itu, jauh lebih sedikit pengejaran pita protein dan resolusi yang lebih baik, meski
tidak ada yang sebaik yang diaktifkan dengan gel poliakrilamida. Metode ini, bagaimanapun,
jauh lebih mudah untuk mengatur dan menjalankan. Sampel tunggal biasanya berjalan pada
selulosa asetat strip (2,5 cm x 12 cm), meskipun beberapa sampel sering berjalan pada lembaran
yang lebih luas.
Selulosa asetat pertama dibasahi dalam elektroforesis penyangga (pH 8,6 untuk sampel serum)
dan sampel (1-2 mm 3 ) dimuat sebagai 1 cm lebar strip sekitar sepertiga dari jalan sepanjang
strip. Ujung strip membuat kontak dengan tangki penyangga elektroforesis melalui saringan
kertas saring yang tumpang tindih ujung strip selulosa asetat, dan elektroforesis dilakukan pada
6-8 V cm -1 selama sekitar 3 jam. Setelah elektroforesis, strip diwarnai untuk protein, de-stained,
dan pita divisualisasikan.
Enzim dapat dengan mudah dideteksi, pada sampel elektroforesis pada selulosa asetat, dengan
menggunakan teknik zymogram. Strip selulosa diletakkan di atas selembar kertas saring yang
direndam dalam buffer dan substrat. Setelah masa inkubasi enzim yang tepat, strip dikupas
terpisah dan zymogram kertas diobati sesuai untuk mendeteksi produk enzim; Oleh karena itu,
dimungkinkan untuk mengidentifikasi posisi aktivitas enzim pada strip aslinya.
Pendekatan alternatif untuk mendeteksi dan mengkuantifikasi protein tertentu pada strip untuk
mengobati strip sebagai setara dengan protein blot dan untuk menyelidiki protein yang diberikan
dengan menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder terkait enzim. Perkembangan warna
substrat menunjukkan adanya protein tertentu dan jumlah warna yang dikembangkan pada waktu
tertentu merupakan ukuran kuantitatif jumlah protein.
Jadi, misalnya, sejumlah besar sampel serum dapat dijalankan pada selembar kertas lebar,
lembaran tersebut diperiksa dengan menggunakan antibodi, dan peningkatan kadar protein
tertentu yang diidentifikasi pada sampel tertentu oleh peningkatan tingkat perkembangan warna
pada sampel ini.
Teknik # 9 . Isoelectric Focusing dan Two-Dimensional Gel Elektroforesis :
Elektroforesis dua dimensi (elektroforesis 2-D) adalah metode yang sangat kuat dan banyak
digunakan untuk analisis campuran protein kompleks yang diambil dari sel, jaringan, atau
sampel biologis lainnya. Teknik ini mengurutkan protein menurut dua sifat independen dalam
dua tahap diskrit: langkah dimensi pertama, fokus isoelektrik (IEF), memisahkan protein sesuai
dengan titik isoelektriknya (pi); Langkah kedua, elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (SDS-
PAGE), memisahkan protein sesuai dengan berat molekulnya (M r , berat molekul relatif).
Setiap titik pada rangkaian dua dimensi yang dihasilkan sesuai dengan satu spesies protein dalam
sampel. Ribuan protein yang berbeda dapat dipisahkan, dan informasi seperti pi protein, berat
molekul jelas, dan jumlah masing-masing protein diperoleh.
Elektroforesis dua dimensi pertama kali diperkenalkan oleh PH O'Farrell dan J. Klose pada tahun
1975. Dalam teknik aslinya, pemisahan dimensi pertama dilakukan pada gel poliakrilamida
pembawa ampholy yang dilemparkan ke dalam tabung sempit. A. Gorg dan rekannya
mengembangkan teknik 2-D yang saat ini digunakan, di mana gradien pH pembawa ampholy
telah diganti dengan gradien pH immobilisasi dan gel tabung diganti dengan gel yang didukung
oleh bantalan plastik.
Aplikasi elektroforesis 2-D yang besar dan terus berkembang adalah "analisis proteom". Analisis
ini melibatkan pemisahan, identifikasi, dan kuantifikasi sistematis dari banyak protein secara
simultan dari satu sampel tunggal. Elektroforesis dua dimensi digunakan dalam teknik ini karena
kemampuannya yang tak tertandingi untuk memisahkan ribuan protein secara bersamaan.
Elektroforesis dua dimensi juga unik dalam kemampuannya untuk mendeteksi modifikasi pasca
dan co-translasi, yang tidak dapat diprediksi dari urutan genom. Aplikasi elektroforesis 2-D
meliputi analisis proteom, diferensiasi sel, dan deteksi penanda penyakit, terapi pemantauan,
penemuan obat, penelitian kanker, pemeriksaan kemurnian, dan pemurnian protein berskala
mikro.
Proses 2-D dimulai dengan persiapan sampel. Persiapan sampel yang tepat sangat penting untuk
hasil 2-D yang baik. Langkah selanjutnya dalam proses 2-D adalah rehidrasi strip IPG
(Isoelectric pH gradient). Strip IPG disediakan kering dan harus direhidrasi dengan aditif yang
sesuai sebelum IEF (Immunoelectrophoresis).
IEF dimensi pertama dilakukan pada sistem flatbed pada tegangan sangat tinggi dengan kontrol
suhu aktif. Selanjutnya, ekuilibrasi strip pada buffer yang mengandung SDS mempersiapkan
sampel untuk pemisahan dimensi kedua. Setelah equilibration, strip ditempatkan pada gel
dimensi kedua untuk SDS-PAGE. Langkah terakhir adalah visualisasi dan analisis rangkaian dua
dimensi yang dihasilkan.
Singkatnya, urutan eksperimen untuk elektroforesis 2-D adalah:
1. Persiapan sampel
2. IPG strip rehidrasi
3. IEF
4. IPG strip equilibration
5. SDS-PAGE
6. Visualisasi
7. Analisis.
Preparasi Sampel :
Karena keragaman jenis dan asal sampel protein, hanya panduan umum untuk persiapan sampel
yang disediakan di bagian ini. Prosedur optimal harus ditentukan secara empiris untuk setiap
jenis sampel. Idealnya, proses ini akan menghasilkan pelarut lengkap, disagregasi, denaturasi,
dan pengurangan protein dalam sampel.
Saat mengembangkan strategi persiapan sampel, penting untuk memiliki gagasan yang jelas
tentang apa yang diinginkan dalam hasil akhir 2-D. Apakah tujuan untuk melihat sebanyak
mungkin protein, atau hanya merupakan bagian dari protein dalam sampel potensi
potensial? Mana yang lebih penting - representasi sampel yang lengkap, atau pola yang jelas dan
dapat direproduksi?
Langkah persiapan sampel tambahan dapat meningkatkan kualitas hasil akhir, namun setiap
langkah tambahan dapat menyebabkan hilangnya spesies protein secara selektif. Oleh karena itu,
trade-off antara kualitas sampel yang lebih baik dan representasi protein yang lengkap harus
dipertimbangkan dengan cermat.
Untuk mengkarakterisasi protein tertentu dalam campuran protein kompleks, protein yang
diminati harus benar-benar larut dalam kondisi elektroforesis. Perlakuan dan kondisi yang
berbeda diperlukan untuk melarutkan berbagai jenis sampel protein; Beberapa protein secara
alami ditemukan dalam kompleks dengan membran, asam nukleat, atau protein lainnya, beberapa
protein membentuk berbagai agregat nonspesifik, dan beberapa protein mengendap saat
dikeluarkan dari lingkungan normal mereka.
Efektivitas pelarut tergantung pada pilihan metode gangguan sel, konsentrasi protein dan metode
disolusi, pemilihan deterjen, dan komposisi larutan sampel. Jika salah satu dari langkah-langkah
ini tidak dioptimalkan untuk sampel tertentu, pemisahan mungkin tidak lengkap atau terdistorsi
dan informasi mungkin hilang.
Untuk sepenuhnya menganalisa semua protein intraselular, sel-selnya harus terganggu secara
efektif. Pilihan metode gangguan tergantung pada apakah sampel berasal dari sel, jaringan padat,
atau bahan biologis lainnya dan apakah analisisnya menargetkan semua protein atau hanya fraksi
subselular tertentu. Kedua metode lisis lembut dan kuat dibahas di bawah ini.
.

Protease dapat dibebaskan pada gangguan sel. Proteolisis sangat mempersulit analisis hasil 2-D,
sehingga sampel protein harus terlindungi dari proteolisis selama gangguan sel dan persiapan
selanjutnya. Protease kurang aktif pada suhu yang lebih rendah, jadi persiapan sampel sesedikit
mungkin suhu direkomendasikan.
Selain itu, proteolisis sering dapat dihambat dengan menyiapkan sampel dengan adanya
campuran dasar tris, natrium karbonat, atau campuran ampholimer dasar. Pendekatan ini sendiri
seringkali cukup melindungi terhadap proteolisis. Namun, beberapa protease dapat
mempertahankan beberapa aktivitas bahkan dalam kondisi ini. Dalam kasus ini, protease
inhibitor dapat digunakan.
Penghambat protease individu hanya aktif melawan protease golongan tertentu, jadi biasanya
dianjurkan untuk menggunakan kombinasi protease inhibitor. Berbagai jenis protease inhibitor
"koktail" tersedia dari sejumlah sumber komersial. Tabel 8.6 mencantumkan protease inhibitor
dan protease yang mereka hambat.
Jika hanya subset dari protein dalam jaringan atau jenis sel yang diminatinya, pra-fraksinasi
dapat digunakan selama preparasi sampel. Jika protein dari satu kompartemen subselular tertentu
(misalnya, nuklei, mitokondria, membran plasma) diinginkan, organel bunga dapat dimurnikan
dengan sentrifugasi diferensial atau cara lain sebelum pelarutan protein untuk elektroforesis 2-D.
Sampel juga dapat difraksinasi sebelumnya dengan kelarutan di bawah kondisi ekstraksi yang
berbeda sebelum elektroforesis 2-D. Pengendapan protein dalam sampel dan pemindahan zat
yang mengganggu adalah langkah-langkah opsional. Keputusan untuk menggunakan langkah-
langkah ini bergantung pada sifat sampel dan tujuan eksperimen. Prosedur curah hujan, yang
digunakan untuk mengkonsentrasikan sampel dan memisahkan protein dari zat yang berpotensi
mengganggu, dijelaskan di bawah ini.
Tidak ada teknik presipitasi yang benar-benar efisien dan beberapa protein mungkin tidak siap
untuk kembali menangguhkan presipitasi berikut. Jadi, dengan menggunakan langkah presipitasi
selama preparasi sampel dapat mengubah profil protein sampel. Presipitasi dan suspensi ulang
harus dihindari jika tujuan percobaan 2-D adalah representasi lengkap dan akurat dari semua
protein dalam sampel.
Jika persiapan sampel memerlukan curah hujan, biasanya hanya satu dari teknik
presipitasi berikut yang digunakan:
1. Presipitasi amonium sulfat:
("Mengasah keluar") Dengan adanya konsentrasi garam tinggi, protein cenderung agregat dan
diendapkan dari larutan. Banyak kontaminan potensial (misalnya asam nukleat) akan tetap
berada dalam larutan.
2. presipitasi TCA:
TCA (trichloroacetic acid) adalah protein yang sangat efektif.
3. Presipitasi aseton:
Pelarut organik ini biasa digunakan untuk mengendapkan protein. Banyak kontaminan yang larut
dalam air (misalnya detergen, lipid) akan tetap berada dalam larutan.
4. Pengendapan dengan TCA dalam aseton:
Kombinasi TCA dan aseton biasanya digunakan untuk mengendapkan protein selama preparasi
sampel untuk elektroforesis 2-D dan lebih efektif daripada TCA atau aseton saja.
5. Pengendapan dengan amonium asetat dalam metanol mengikuti ekstraksi fenol:
Teknik ini terbukti berguna dengan sampel tanaman yang mengandung zat pencampur tingkat
tinggi. Pengotor non-protein dalam sampel dapat mengganggu pemisahan dan visualisasi
selanjutnya dari hasil 2-D, jadi persiapan sampel dapat mencakup langkah-langkah untuk
menghilangkan sampel zat ini. Tabel 8.7 mencantumkan kontaminan yang mempengaruhi hasil
dan teknik 2-D untuk pemindahannya.
Secara umum, disarankan untuk menjaga persiapan sampel sesederhana mungkin. Sampel
dengan konsentrasi protein rendah dan konsentrasi garam yang tinggi, misalnya, dapat
diencerkan secara normal dan dianalisis, atau dimurnikan, kemudian dipekatkan dengan
liofilisasi, atau diendapkan dengan TCA dan aseton es dingin dan dilarutkan kembali dengan
larutan rehidrasi.
Pilihan pertama untuk hanya mengencerkan sampel dengan larutan rehidrasi mungkin
cukup. Jika masalah dengan konsentrasi protein atau zat yang mengganggu dinyatakan tidak
dapat diatasi, maka diperlukan langkah-langkah curah hujan atau pengangkatan.
Komposisi larutan sampel sangat penting untuk 2-D karena perlakuan solubilisasi untuk
pemisahan dimensi pertama tidak boleh mempengaruhi protein pi, atau biarkan sampel dalam
larutan yang sangat konduktif. Secara umum, urea pekat dan juga satu atau lebih deterjen
digunakan. Komposisi larutan contoh dibahas dengan ini.
Ini selalu termasuk urea dan satu atau lebih deterjen. Denaturasi lengkap memastikan bahwa
setiap protein hadir hanya dalam satu konfigurasi dan interaksi agregasi dan antarmolekul
dihindari. Larutan lisis, yang mengandung urea dan CHAPS deterjen zwitterionik, telah terbukti
efektif untuk melarutkan berbagai sampel.
Reduktor dan buffer IPG juga sering ditambahkan ke larutan sampel untuk meningkatkan
kelarutan sampel. IEF yang dilakukan di bawah kondisi denaturing memberikan resolusi
tertinggi dan hasil terbersih. Urea, chaotrope netral, digunakan sebagai denaturant pada dimensi
pertama elektroforesis 2-D. Urea melarutkan dan membentangkan sebagian besar protein ke
konformasi acaknya sepenuhnya, dengan semua kelompok yang dapat diionkan terkena larutan.
Baru-baru ini, penggunaan tiourea selain urea telah ditemukan untuk memperbaiki solubilisasi
lebih lanjut, terutama protein membran. Detergen non-ionik atau zwitterionik selalu disertakan
dalam larutan sampel untuk memastikan pelarut sampel lengkap dan untuk mencegah agregasi
melalui interaksi hidrofobik. Awalnya, salah satu dari dua deterjen non-ionik serupa, NP-40 atau
Triton X-100, digunakan.
Ketika kesulitan dalam mencapai pelarutan sampel penuh ditemukan, SDS deterjen anionik dapat
digunakan sebagai agen pelarut. SDS adalah pelarut protein yang sangat efektif, namun karena
mengandung zat ini dan membentuk kompleks dengan protein, ia tidak dapat digunakan sebagai
deterjen tunggal untuk melarutkan sampel untuk elektroforesis 2-D.
Metode yang banyak digunakan untuk meniadakan efek campur tangan SDS adalah pengenceran
sampel ke dalam larutan yang mengandung kelebihan CHAPS, Triton X-100, atau NP-
40. Konsentrasi akhir SDS harus 0,25% atau lebih rendah dan rasio deterjen berlebih terhadap
SDS paling sedikit 8: 1. Agen pembanding sering disertakan dalam larutan sampel untuk
memutus ikatan disulfida yang ada dan untuk mempertahankan semua protein dalam
kandungannya. sepenuhnya berkurang.
Fluktan yang paling umum digunakan adalah dithiothreitol (DTT) pada konsentrasi berkisar
antara 20 sampai 100 mM. Dithioerythreitol (DTE) mirip dengan DTT dan juga dapat digunakan
sebagai agen pereduksi. Awalnya, 2-mercaptoethanol digunakan sebagai reduktan, namun
konsentrasi reduktor yang lebih tinggi diperlukan dan pengotor yang melekat dapat
menyebabkan artefak. Baru-baru ini, tributil phosphine (TBP) non-thiol, dengan konsentrasi 2
mM, telah digunakan sebagai reduktan untuk sampel 2-D.
Namun, karena keterbatasan kelarutan dan ketidakstabilan TBP dalam larutan, reduktor tiol
seperti DTT harus digunakan untuk mempertahankan protein dalam keadaan berkurang melalui
rehidrasi dan IEF dimensi pertama, jika TBP digunakan sebagai reduktan selama preparasi
sampel. Amfibi pembawa atau penyangga IPG (sampai 2% (v / v)) dapat disertakan dalam
larutan sampel.
Mereka meningkatkan kelarutan protein dengan meminimalkan agregasi protein karena interaksi
muatan. Dalam beberapa kasus, buffer atau basa (misalnya, basis Tris 40 mM) ditambahkan ke
larutan sampel. Hal ini dilakukan bila kondisi dasar diperlukan untuk pelarut penuh atau untuk
meminimalkan proteolisis. Namun, pengenalan senyawa ionik semacam itu dapat menyebabkan
gangguan dimensi pertama.
Basa atau buffer harus diencerkan sampai 5 mM atau lebih rendah sebelum memasukkan sampel
ke IEF dimensi pertama. Sampel harus tetap berada dalam larutan sampel pada suhu kamar
paling sedikit 30 menit untuk denaturasi dan pelarutan penuh sebelum sentrifugasi dan aplikasi
sampel selanjutnya.
Pemanasan sampel dengan adanya deterjen dapat membantu dalam pelarutan, namun sebaiknya
dilakukan sebelum penambahan urea. Sonication membantu mempercepat pelarutan, terutama
dari bahan yang sulit ditunda.
Fokus Isoelektrik Dimensi Pertama (IEF) :
Pemisahan dimensi pertama yang berguna memerlukan pemilihan kisaran pH dimensi pertama
yang sesuai untuk sampel, dan juga metode aplikasi sampel yang sesuai. IEF adalah metode
elektroforesis yang memisahkan protein sesuai dengan titik isoelektriknya (pi). Protein adalah
molekul amfoter; mereka membawa muatan positif, negatif, atau nol, tergantung pada pH
lingkungannya (Gambar 8.25).
Biaya bersih protein adalah jumlah semua muatan negatif dan positif dari rantai samping asam
amino dan amino dan karboksil-ter. Titik isoelektrik (pi) adalah pH spesifik dimana muatan
bersih protein adalah nol. Protein bermuatan positif pada nilai pH di bawah pi dan bermuatan
negatif pada nilai pH di atas pi mereka. Jika muatan bersih protein diplotkan versus pH
lingkungannya, kurva yang dihasilkan memotong sumbu x pada titik isoelektrik (Gambar 8.25).
Kehadiran gradien pH sangat penting untuk teknik IEF. Dalam gradien pH, di bawah pengaruh
medan listrik, protein akan bergerak ke posisi di gradien dimana muatan bersihnya nol. Protein
dengan muatan bersih positif akan bermigrasi ke arah katoda, menjadi semakin tidak bermuatan
positif karena bergerak melalui gradien pH sampai mencapai pi.
Protein dengan muatan bersih negatif akan berpindah ke anoda, menjadi tidak bermuatan negatif
sampai juga mencapai nol muatan bersih. Jika protein harus menyebar jauh dari pi, ia segera
mendapatkan biaya dan bermigrasi kembali. Ini adalah efek fokus IEF, yang
mengkonsentrasikan protein pada pls mereka dan memungkinkan protein dipisahkan berdasarkan
perbedaan muatan yang sangat kecil.

Resolusi ditentukan oleh kemiringan gradien pH dan kekuatan medan listrik. IEF adalah, oleh
karena itu, dilakukan pada tegangan tinggi (biasanya lebih dari 1 000 V). Ketika protein telah
mencapai posisi akhir mereka dalam gradien pH, hanya ada sedikit gerakan ionik dalam sistem,
yang menghasilkan arus akhir yang sangat rendah (biasanya di bawah 1 mA). IEF dari sampel
yang diberikan dalam sistem elektroforesis yang diberikan umumnya dilakukan untuk jumlah
volt-jam konstan.
Metode asli untuk IEF dimensi pertama bergantung pada gradien pH pembawa ampholy yang
dihasilkan pada batang gel poliakrilamida dalam tabung. Ampholita pembawa adalah molekul
kecil, larut, amfoter dengan kapasitas penyangga yang tinggi di dekat pi mereka. Campuran
amfetil pembawa komersil terdiri dari ratusan spesies polimerik individu dengan pis yang
mencakup kisaran pH tertentu.
Bila voltase diterapkan pada campuran ampholium carrier, ampholium carrier dengan pi tertinggi
(dan muatan paling negatif) bergerak ke arah anoda dan ampholfi pembawa dengan pi terendah
(dan muatan paling positif) bergerak ke arah katoda. Amfibi pembawa lainnya menyelaraskan
diri di antara yang ekstrem, menurut pis mereka, dan menyangga lingkungannya dengan pH yang
sesuai. Hasilnya adalah gradien pH kontinyu.
Meskipun metode dasar ini telah digunakan dalam ratusan studi elektroforesis 2-D, namun
beberapa keterbatasan yang mencegah penerapannya lebih luas:
saya. Amfetil pembawa adalah polimer campuran yang tidak memiliki karakteristik yang baik
dan mengalami variasi produksi batch-ke-batch. Variasi ini mengurangi reproduktifitas
pemisahan dimensi pertama.
ii. Gradien pH amplas Carrier tidak stabil dan memiliki kecenderungan melayang, biasanya
menuju katoda, dari waktu ke waktu. Penyimpangan gradien berdampak buruk pada
reproduktifitas dengan memperkenalkan variabel waktu. Drift gradien juga menyebabkan
perataan gradien pH pada setiap ujungnya, terutama di atas pH 9, menghasilkan teknik 2-D yang
kurang berguna pada pH ekstrem.
aku aku aku. Gel tabung poliakrilamida lunak memiliki stabilitas mekanis yang rendah. Batang
gel bisa meregang atau pecah, mempengaruhi reproduktifitas. Hasil sering bergantung pada
keahlian operator.
Sebagai hasil dari keterbatasan dan masalah dengan gradien pH ampholy pembawa, gradasi pH
immobilisasi dikembangkan. Gradien pH immobilisasi (IPG) dibuat oleh covalendy yang
menggabungkan gradien kelompok penyangga asam dan dasar menjadi gel poliakrilamida pada
saat dilemparkan. . Penyangga adalah satu set molekul yang ditandai dengan baik, masing-
masing dengan kelompok penyangga asam atau asam tunggal yang dihubungkan ke monomer
akrilamida.
Struktur umum reagen immobilisasi adalah:

R = gugus buffer asam lemah atau dasar. Gradien pH yang terimobilisasi terbentuk dengan
menggunakan dua larutan, satu mengandung campuran relatif asam dari buffer akrilamida dan
yang lainnya mengandung campuran yang relatif mendasar. Konsentrasi berbagai buffer dalam
dua larutan menentukan kisaran dan bentuk gradien pH yang dihasilkan.
Kedua larutan mengandung monomer dan katalis akrilamida. Selama polimerisasi, bagian
akrilamida dari buffer mengkopolimerisasi dengan monomer akrilamida dan bisakrilamida untuk
membentuk gel poliakrilamida. Gambar 8.26 adalah representasi grafis dari matriks
poliakrilamida dengan kelompok penyangga terlampir.
Strip IPG harus direhidrasi sebelum IEF. Strip IPG direhidrasi dalam larutan yang mengandung
aditif yang diperlukan dan, secara opsional, protein sampel. IEF dilakukan dengan meningkatkan
voltase secara bertahap melintasi strip IPG menjadi setidaknya 3.500 V dan mempertahankan
voltase ini setidaknya beberapa ribu volt-jam.
Setelah IEF, strip IPG diseimbangkan dengan larutan kesetimbangan dan diaplikasikan ke gel
SDS-poliakrilamida flatbed atau vertikal. Bila strip IPG digunakan untuk pemisahan dimensi
pertama, peta 2-D resultan lebih unggul dalam hal resolusi dan reproduktifitas. Strip IPG
merupakan peningkatan yang nyata dari gel tabung dengan gradien pH pembawa ampholy yang
dihasilkan.
Jalur IPG siap pakai tersedia secara komersial. Selalu disarankan untuk memilih strip yang lebih
pendek untuk skrining cepat atau bila protein yang paling banyak diminati dan gunakan strip
yang lebih panjang untuk kapasitas resolusi dan pemuatan maksimal.
Sampel dapat diaplikasikan baik dengan memasukkannya ke dalam larutan rehidrasi (pemuatan
rehidrasi) atau dengan menerapkannya langsung ke strip IPG rehidrasi melalui cup sampel,
sumur sampel, atau jembatan kertas. Biasanya loading rehidrasi lebih baik.
Keuntungan dari mode aplikasi ini adalah sebagai berikut:
saya. Pemuatan durabilitas memungkinkan jumlah protein yang lebih banyak dimuat dan
dipisahkan.
ii. Pemuatan durabilitas memungkinkan sampel yang lebih encer untuk dimuat.
aku aku aku. Karena tidak ada titik aplikasi diskrit, metode ini menghilangkan pembentukan
presipitat pada titik aplikasi yang sering terjadi saat loading dengan cup sampel.
iv. Metode pemuatan rehidrasi secara teknis lebih sederhana, menghindari masalah kebocoran
yang dapat terjadi saat menggunakan cup sampel.
Namun, ada kasus ketika seseorang mungkin lebih suka memasukkan sampel setelah rehidrasi,
segera sebelum IEF, misalnya, jika proteolisis atau modifikasi protein lainnya menjadi perhatian,
rehidrasi semalam dengan sampel mungkin tidak diinginkan.
Strip IPG direhidrasi dalam baki rehidrasi yang dirancang khusus atau kaset. Larutan Rehidrasi,
yang mungkin atau mungkin tidak termasuk contohnya, diterapkan pada slot reservoir nampan
rehidrasi dan kemudian strip IPG direndam satu per satu.
Pilihan larutan rehidrasi yang paling sesuai untuk sampel akan tergantung pada kebutuhan
kelarutan proteinnya yang spesifik, namun tipikal umumnya mengandung detergen urea, non-
ionik atau zwitterionic, dithiothreitol (DTT), Pharmalytes. Sampel juga bisa disertakan. Peran
masing-masing komponen dijelaskan di bawah ini, serta kisaran konsentrasi yang disarankan.
Urea melarutkan dan mendenaturasi protein, membeberkannya untuk mengekspos asam amino
internal yang dapat diionisasi. Biasanya 8 M urea digunakan, namun konsentrasinya dapat
ditingkatkan menjadi 9 M atau 9,8 M, jika diperlukan untuk pelarut sampel lengkap. Tiourea,
selain urea, bisa digunakan untuk lebih meningkatkan pelarutan protein.
Deterjen melarutkan protein hidrofobik dan meminimalkan agregasi protein. Deterjen harus
memiliki nol muatan bersih-gunakan hanya detergen non-ionik dan zwitterionik. CHAPS, Triton
X-100, atau NP-40 di kisaran 0,5 sampai 4% paling banyak digunakan.
Reduktor menyuburkan ikatan disulfida agar protein bisa terurai sepenuhnya. DTT atau DTE,
(20 sampai 100 mM) biasa digunakan. 2-Mercaptoethanol tidak disarankan, karena diperlukan
konsentrasi yang lebih tinggi, dan kotoran bisa menyebabkan artefak. Tributil phosphine (TBP)
tidak direkomendasikan sebagai reduktan untuk IEF karena kelarutannya rendah dan stabilitas
yang buruk dalam larutan rehidrasi. Reduktor harus ditambahkan secara langsung sebelum
digunakan.
Pharmalyte (campuran pembawa ampholy) memperbaiki pemisahan, terutama dengan jumlah
sampel tinggi. Campuran amfetter pembawa meningkatkan kelarutan protein dan menghasilkan
konduktivitas yang lebih seragam di seluruh gradien pH tanpa mengganggu IEF atau
mempengaruhi bentuk gradien.
Pelacakan pewarna (bromophenol blue) memungkinkan kemajuan IEF untuk dipantau pada awal
protokol. Jika pewarna pelacakan tidak bermigrasi ke anoda, arus tidak mengalir. Sebagai hasil
fokus isoelektrik, pewarna pewarna biru bromophenol bermigrasi ke anoda. Perhatikan bahwa
pewarna depan meninggalkan strip IPG sebelum memfokuskannya selesai, jadi pembersihan zat
warna bukanlah indikasi bahwa sampel terfokus. Jika pewarna tidak bermigrasi, tidak ada arus
yang mengalir.
Contoh Aplikasi oleh Cup Loading :
Jika sampel tidak diaplikasikan dengan menggunakan larutan rehidrasi, maka sampel dapat
diterapkan dengan menggunakan cup sampel, tepat sebelum fokus isoelektrik. Saat cangkir
sampel digunakan, batas beban sampel lebih rendah dan lebih spesifik. Volume sampel dan
jumlah protein yang lebih tinggi dapat diterapkan dengan jembatan kertas, yang ditempatkan di
antara ujung anodik atau katodik dari strip IPG dan strip elektroda. Volume sampel yang besar
memerlukan bantalan kertas besar yang diterapkan di sisi lain untuk menyerap kelebihan air.
Dalam protokol IEF yang khas, tegangan secara bertahap meningkat ke voltase fokus akhir yang
diinginkan, yang ditahan hingga beberapa jam. Dengan pemuatan cup, tegangan awal rendah
meminimalkan agregasi sampel dan tegangan awal rendah umumnya memungkinkan pemisahan
paralel sampel dengan konsentrasi garam yang berbeda.
Faktor utama yang menentukan jam tegangan yang dibutuhkan (Vh) adalah panjang strip IPG
dan gradien pH yang digunakan. Komposisi sampel, komposisi larutan rehidrasi, dan mode
aplikasi sampel mempengaruhi jam tegangan yang dibutuhkan.

Berfokus secara substansial lebih lama dari yang direkomendasikan akan menyebabkan goresan
dan hilangnya protein secara horisontal. Fenomena ini disebut "over-focus". Karena itu, waktu
fokus harus dikurangi seminimal mungkin.
Dimensi Kedua SDS-PAGE :
Setelah IEF, pemisahan kedua dimensi dapat dilakukan pada berbagai sistem flatbed atau
vertical.
SDS-PAGE terdiri dari empat langkah:
(1) Mempersiapkan gel dengan dimensi kedua,
(2) Equilibrating strip IPG pada buffer SDS,
(3) Menempatkan strip IPG yang telah diimbangi pada gel SDS, dan
(4) Elektroforesis.
IPG Strip Equilibration :
Langkah ekuilibrasi jenuh strip IPG dengan sistem penyangga SDS yang diperlukan untuk
pemisahan dimensi kedua. Larutan equilibrasi mengandung buffer, urea, gliserol, reduktor, SDS,
dan pewarna. Langkah ekuilibrasi tambahan menggantikan reduktan dengan
iodoasetamida. Equilibration selalu dilakukan segera sebelum menjalankan dimensi kedua, tidak
pernah sebelum penyimpanan strip IPG pada -40 ° C atau lebih rendah.
Setelah diseimbangkan, letakkan strip IPG dengan menggunakan forsep, gel-side down secara
horisontal pada gel SDS-PAGE vertikal untuk elektroforesis. Elektroforesis dilakukan pada arus
konstan dalam dua tahap. Selama periode migrasi dan susun awal, arus sekitar setengah dari nilai
yang dibutuhkan untuk pemisahan. Hentikan elektroforesis saat pewarna depan kira-kira 1 mm
dari dasar gel. Setelah elektroforesis, lepaskan gel dari kaset gel mereka dalam persiapan untuk
pewarnaan atau blotting.
Visualisasi Hasil :
Metode pendeteksian yang paling banyak digunakan untuk gel SDS dapat diterapkan pada gel
dimensi kedua.
Namun, beberapa fitur berikut diinginkan:
saya. Sensitif tinggi
ii. Rentang linier lebar untuk kuantifikasi
aku aku aku. Kompatibilitas dengan spektrometri massa
iv. Toksisitas rendah dan aman bagi lingkungan
v. Ramah lingkungan.
Karena tidak satu pun teknik yang ada dapat memenuhi semua persyaratan ini, laboratorium
elektroforesis 2-D mungkin perlu memiliki lebih dari satu metode berikut dalam repertoarnya.
Autoradiografi dan fluorografi adalah metode deteksi yang paling sensitif (sampai 200 fg
protein). Untuk menggunakan teknik ini, sampel harus terdiri dari protein radiolabelled in vivo
dengan menggunakan 35 S, 14 C, 3 H atau, dalam kasus phosphoprotein, 32 P. Untuk deteksi
radiografi otomatis, gel hanya dikeringkan dan terpapar pada X Memutar film atau-untuk hasil
yang lebih cepat dan rentang dinamik kuantifikasi yang superior-ke layar fosfor
penyimpanan. Fluorografi adalah teknik yang memberikan sensitivitas ekstra dengan cara
meresapkan gel secara scintillant seperti PPO (2, 4-difhenyloxazole) sebelum pengeringan.

Pewarnaan perak adalah metode non-radioaktif yang paling sensitif (di bawah 1 ng). Pewarnaan
perak adalah proses multi-langkah kompleks yang memanfaatkan berbagai reagen yang
kualitasnya sangat penting. Oleh karena itu, seringkali menguntungkan untuk membeli reagen ini
dalam bentuk kit khusus, di mana reagennya terjamin kualitasnya khusus untuk aplikasi
pewarnaan perak. Dengan menghilangkan glutardialdehida dari sensitizer dan formaldehid dari
larutan perak nitrat, metode ini menjadi kompatibel dengan analisis spektrometri massa, namun
dengan mengorbankan sensitivitas.
Pewarnaan Coomassie, meski 50 sampai 100 kali lipat kurang sensitif dibanding pewarnaan
perak, adalah metode yang relatif sederhana dan lebih kuantitatif daripada pewarnaan
perak. Coomassie biru lebih disukai bila jumlah protein relatif ditentukan oleh
densitometri. Metode pewarnaan koloid dianjurkan, karena menunjukkan sensitivitas tertinggi,
turun sampai 100 ng / titik protein.
Pewarnaan Zinc-Imidazole negatif memiliki batas deteksi kira-kira. 15 ng protein / spot dan
kompatibel dengan spektrometri massa, namun teknik kuantifikasinya buruk. Pelabelan fluoresen
dan pewarnaan neon dengan pewarna memiliki kepekaan di antara koloid Coomassie dan
Pewarnaan Perak.
Teknik ini memerlukan pemindai fluoresensi, namun kompatibel dengan spektrometri massa dan
menunjukkan rentang dinamis yang luas untuk kuantifikasi. Selain pewarnaan, gel dimensi
kedua dapat dialihkan ke membran nitroselulosa atau PVDF untuk deteksi imunokimia protein
spesifik atau rangkaian mikro kimia.
Melestarikan Gel :
Gel secara optimal disimpan dalam pelindung lembaran setelah merendamnya dalam 10% v / v
gliserol selama 30 menit. Gel yang tidak didukung kembali ke ukuran semula dengan
merendamnya dalam 30% (v / v) metanol atau etanol / gliserol 4% sampai sesuai dengan ukuran
aslinya. Untuk autoradiografi, gel dikeringkan ke kertas saring yang kuat dengan pengering
vakum atau di antara dua lembar plastik basah yang disegel di ujungnya.
Analisis lebih lanjut Tempat Protein:
Memilih tempat itu :
Sistem robot tersedia yang secara otomatis memilih tempat protein yang dipilih dari gel bernoda
atau de-bernoda menggunakan daftar pilihan dari analisis citra, dan memindahkannya ke piring
mikro untuk analisis lebih lanjut.
Pencernaan protein :
Busi gel secara otomatis dicerna di Digester yang dikendalikan komputer; peptida supernatan
dicampur dengan bahan matriks MALDI dan terlihat pada slide MALDI menggunakan spotter
robot.
Spektrometri massa MALDI-ToF :
Dalam spektrometer massa MALDI-ToF, sinar laser ditembakkan ke tempat matriks peptida
kering untuk ionisasi peptida. Setelah penentuan yang akurat dari massa peptida, database dicari
untuk identifikasi protein asli.
Teknik # 10. Microchip Elektroforesis:
Miniaturisasi lebih lanjut dari sistem elektroforesis telah menyebabkan pengembangan
elektroforesis microchip, yang memiliki banyak keunggulan dibanding metode elektroforesis
konvensional, yang memungkinkan analisis kecepatan sangat tinggi pada ukuran sampel sangat
rendah. Sebagai contoh, analisis microchip seringkali dapat diselesaikan dalam puluhan detik
sedangkan elektroforesis kapiler (CE) dapat mengambil 20 menit dan elektroforesis gel
konvensional minimal 2 jam.
Dengan menggunakan sistem pendeteksian baru, seperti fluoresensi yang diinduksi laser,
picomole sampai attomole (10-18 18 tahi lalat) kepekaan dapat dicapai, yang setidaknya dua lipat
lebih besar dari pada CE konvensional. Sistem deteksi untuk molekul yang tidak berpendar
termasuk detektor elektrokimia, deteksi amperometrik berdenyut (PAD), dan voltametri
sinusoidal.
Semua teknik deteksi ini menawarkan sensitivitas tinggi dan sangat ideal untuk teknologi
mikromachining dan teknologi fabrikasi mikro. Akhirnya, tegangan yang dibutuhkan hanya
beberapa volt, dan ini menghilangkan kebutuhan akan voltase tinggi yang digunakan oleh CE.
Proses pembuatan microchip yang disebut micro fabrikasi. Proses mengetsa saluran kapiler yang
tepat dan dapat direproduksi (biasanya, lebar 50 μm dan 10 μm dalam) sedikit lebih kecil dari
untaian rambut manusia) pada permukaan lembaran kuarsa, kaca atau plastik. Lembar kedua
kemudian disatukan di atas lembar pertama, memutar saluran tergores ke saluran mikofluida
tertutup.
Akhir dari setiap saluran terhubung ke reservoir dimana cairan diperkenalkan /
dilepaskan. Biasanya, ukuran keripik bisa kecil seperti 2 cm 2 . Pada dasarnya microchip ini
menyediakan sistem elektroforesis yang mirip dengan CE namun dengan fleksibilitas lebih.

Perkembangan terkini dari teknologi ini didasarkan pada integrasi fungsi selain hanya pemisahan
ke dalam chip. Sebagai contoh, ekstraksi sampel, pra-konsentrasi sampel sebelum pemisahan,
amplifikasi PCR sampel DNA menggunakan termo-bersepeda termostat inframerah untuk
amplifikasi on-chip yang cepat, dan ekstraksi molekul terpisah dengan fase padat berbahan dasar
mikro adalah semua contoh dimana fungsi lebih lanjut telah dibangun ke dalam sistem
elektroforesis microchip. Sebuah antarmuka juga telah dikembangkan untuk elektroforesis massa
mikroba (MCE-MS) microchip dimana obat telah dipisahkan oleh MCE dan kemudian
diidentifikasi oleh MS.