ELEKTROFORESIS

PENDAHULUAN

• Elektroforesis adalah suatu teknik untuk memisahkan

molekul-molekul bermuatan dalam medan listrik melalui
mekanisme migrasi didalam suatu medium atau matriks
pendukung

• Matriks pendukung berupa larutan, kertas filter, film selulosa

asetat atau gel yang terbuat dari tepung kanji, poliakrilamida
atau agarosa
 PENDAHULUAN

• Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang

didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein
bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik).
Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi
oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari
molekul (TITRAWANI 1996).
• Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran
berat molekul dan muatan listrik yang dikandung oleh
makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada
suatu medium penyangga yang telah berisi protein
plasma maka komponen-komponen protein tersebut
akan mulai bermigrasi (RICARDSON dkk. 1986)
 PRINSIP DASAR

anoda katoda
+
-

Perbedaan potensial

Power supply

Jika sampel ditempatkan ditengah-tengan matriks pendukung

dan arus dijalankan, maka kation akan bermigrasi ke katoda
dan anion ke anoda. Migrasi tersebut yang dinamakan
elektroforesis
 PRINSIP DASAR

• Matriks pendukung yang berada diantara anoda dan

katoda merupakan komponen penting dalam
mendesain pemisahan elektroforetik

• Kecepatan migrasi molekul2 bermuatan ditentukan oleh

2 faktor yaitu:

1.Gerak pendorong (qE)

Gerak pendorong dihasilkan oleh medan lisrik
terhadap molekul
 PRINSIP DASAR

q = muatan molekul (coulomb)

E = kuat medan listrik (voltmeter)

2. Gerak penghambat (fv)

Gerak penghambat ini diterima molekul dari
medium
v = kecepatan molekul
f = koefisien gesekan yang dipengaruhi oleh
ukuran dan bentuk molekul
 PRINSIP DASAR

• Molekul yang lebih besar akan memperoleh hambatan gesekan yang lebih
besar daripada molekul yang kecil sehingga koefisien geseknya pun akan
lebih besar

• Ion bergerak dengan kecepatan tetap (steady state) pada saat gaya dorong
sama dengan gaya penghambat

fv = qE

v/E = q/f
(kecepatan pergerakan molekul perunit kuat medan)

v/E = mobilitas elektroforetik (m ) dari molekul

 PRINSIP DASAR

(m ) = v/E = q/f = Ze/f

• Z = jumlah muatan, e = muatan molekul

• =>mobilitas molekul tergatung pada muatan

bentuk molekulnya
 PRINSIP DASAR
Diambil beberapa asumsi untuk menyederhanakan
proses kompleks pada elektroforesis yaitu:

• Molekul2 sampel diangap berbentuk sferis (bulat)

• Medium tidak menghasilkan efek apapun selain

hambatan gesekan

• Setiap molekul dalam campuran dianggap memiliki

muatan dan ukuran tertentu sehingga mobilitasnya
dalam medan listrik tertentu juga. Hal tersebut menjadi
dasar untuk prosedur pemisahan dan analisis hasil pada
semua metode elektroforesis
 FAKTOR2 YANG MEMPENGARUHI
ELEKTROFORESIS
Berdasarkan persamaan diatas, dapat disimpulkan faktor-
faktor yang mempengaruhi pergerakan ion-ion dalam
sistem elektroforetik:

• Kecepatan migrasi (v) berbanding lurus dengan kuat

medan dan muatan netto molekul yang bermigrasi

• Sebaliknya, kecepatan migrasi berbanding terbalik

dengan ukuran molekul, tingkat sferisitas molekul yang
bermigrasi dan viskositas medium

• Temperatur dari sistem elektroforesis : mempengaruhi

viskositas medium dan pH larutan dapar.
 SAMPEL YANG DAPAT DIANALISIS
DENGAN METODE ELEKTROFORESIS

• Elektroforesis digunakan untuk analisis dan

pemurnian sampel senyawa yang bermuatan

• Protein dan asam nukleat (polinukleotida )

 PROTEIN

• Protein mengandung asam dan basa residu (senyawa

amfoterik)

• Setiap protein memiliki muatan spesifik tergantung pada

jumlah dan tipe asam aminonya

• Monomer : asam a amino karboksilat disingkat asam

amino, merupakan ion dipolar : dapat bermuatan positif atau
negatif
O
+ O
H3N-CH-C-OH -
H2N-CH-C-O
R
R
 PROTEIN

• pH larutan akan menentukan muatan asam amino.

• Pada pH rendah  muatan netto positif

• Gugus asam karboksilat tidak terionisasi, sedangkan gugus amin akan
terprotonasi karena adanya ion hidronium berlebih dalam larutan.
Akibatnya asam amino tersebut memiliki muatan netto positif
•
• Pada pH tinggi  muatan netto negatif

• Pada pH pertengahan  beberapa gugus amin akan terprotonasi dan

beberapa tidak. Hal ini ditentukan oleh kekuaan asam dari molekul
tertentu.

• Terdapat nilai pH tertentu dimana asam amino tidak memiliki muatan

netto disebut dengan titik isoelektrik yaitu asam amino berada dalam
bentuk ion dipolar.
 PROTEIN

• Polimerisasi asam-asam amino menghasilkan polimer protein.

Polimerisasi terjadi melalui interaksi gugus amino yang satu
dengan gugus karboksil dari asam amino yang lain dengan
membentuk ikatan peptida dan membebaskan air
 PROTEIN

• Polimerisasi tersebut juga menghasilkan gugus

amino terminal dan gugus karboksi terminal yang
utuh
 ASAM NUKLEAT

Asam nukleat tidak seperti protein yang bersifat amfoterik

Memiliki muatan negatif pada pH yang digunakan untuk

elektroforesis

Secara struktur asam nukleat merupakan polinukleotida

Mempunyai konsep yang mirip dengan protein, meskipun

keduanya dapat dibedakan baik dari komposisi kimia maupun
fungsinya
 ASAM NUKLEAT

Polinukleotida rantai utamanya berupa poliester. Ester tersebut terbentuk

berasal dari asam fosforat dan bagian alkohol dari gula. Basa heterosiklik
terikat pada karbon pertama gula.

Kombinasi gula dan basa disebut nukleosida dan kombinasi basa-gula

dan asam fosforat disebut nukleotida. Struktur umum tersusun dari unit-unit
berulang nukleotida.

basa basa
O O

gula O P O gula O P O

O O
ASAM NUKLEAT
 ASAM NUKLEAT

Dua polinukleotida yang paling dikenal adalah RNA dan DNA.

Polinukleotida memiliki karakteristik ionisasi yang mirip dengan

protein.

Jika suatu polinukleotida dilarutkan dalam larutan encer, maka

polinukleotida tersebut akan berbentuk anion.

Polinukleotida untai tunggal hanya larut dalam larutan netral

atau larutan basa sehingg gugus fosfatnya tidak terprotonasi
secara sempurna.
 ASAM NUKLEAT

• Polinukleotida untai ganda memiliki molekul2 basa

yang berpotensi terionisasi oleh gangguan sterik
serta terlibat dalam pembentukan hidrogen.

• Molekul DNA hanya larut dalam larutan basa dan

berbentuk ion negatif dalam larutan encer.
 MEDIA

• Yang paling banyak digunakan sebagai media/matriks pendukung

adalah agarosa dan poliakrilamida

• Ukuran Pori2 agarosa gel ditentukan oleh dengan mengatur

konsentrasi agarosa dalam gel.

• Pori2 agarosa lebih besar dibandingkan poliakrilamida, oleh karena

itu digunakan untuk analisis makromolekul : asam nukleat dan
protein kompleks
 MEDIA

• Polikarilamida : monomer akrilamida berpolimerisasi

membentuk rantai yang kompleks melalui ikatan
kovalen dan terjadi sambung silang
APARATUS
 DETEKSI

• Pewarnaan dan Absorpsi Ultraviolet

• Metode radiokimia
DETEKSI
 SDS-PAGE

• SDS-PAGE atau Elektroforesis gel poliakrilamida-Sodium

Dodesil Sulfat adalah teknik elektroforesis gel yang
menggunakan poliakrilamida untuk memisahkan protein yang
bermuatan berdasarkan berat molekulnya saja.
• Sodium Dodesil Sulfat (SDS) merupakan deterjen ionik yang
dapat melarutkan molekul hidrofobik yang memberikan
muatan negatif pada keseluruhan struktur protein.
• Cara kerja SDS-PAGE adalah dengan menghambat interaksi
hidrofobik dan merusak ikatan hidrogen.
• Metode SDS-PAGE digunakan untuk memisahkan protein
demi keperluan biokimia, genetika forensik, dan biologi
molekuler.
 SDS-PAGE

• Metode ini diawali dengan preparasi sampel untuk membuat sampel bermuatan
sama sehingga muatan tidak memengaruhi pergerakan komponen sampel dalam
gel.
• Preparasi dilakukan dengan cara mendenaturasi protein menggunakan SDS dan
memutus ikatan disulfida pada struktur protein menggunakan beta-
merkaptoetanol, bila perlu denaturasi didukung dengan memanaskan sampel.
• Selanjutnya gel poliakrilamida dibuat menggunakan cetakan gel membentuk
lembaran segiempat dengan ketebalan tertentu.
• Setelah sampel dimasukkan dalam sumur gel, gel dialiri arus listrik sehingga
komponen yang terdapat dalam sampel akan terpisah melewati matriks gel
berdasarkan berat molekulnya.
• Untuk melihat pita komponen yang terbentuk, gel perlu diwarnai dengan
pewarna khusus. Beberapa pewarna yang dapat digunakan dalam SDS-PAGE
adalah Commasie Brilliat Blue dan Silver Salt Staining.
• Commasie Brilliant Blue mengikat protein secara spesifik dengan ikatan
kovalen. Silver Salt Staining memiliki sifat lebih sensitif dan akurat namun
membutuhkan proses yang lebih lama.
 SDS-PAGE

• SWI-FAS-PRO-IK. SDS PAGE (Handcast gel)

WorkFlow.pdf
 SDS-PAGE

Separating Proteins using SDS Polyacrylamide Gel

Electrophoresis.mp4