ELEKTROFORESIS

DEFINISI
Elektroforesis adalah teknik pemisahan/proses migrasi dari solut yang
bermuatan dalam media cair/padat dan berada dalam medan listrik.

Prinsip
Jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase tersebut
akan berpindah sepanjang medium yang kontinu kearah katoda atau
anoda sesuai dengan muatan partikel.
Senyawa (partikel) bermuatan dalam medan listrik yang
bermuatan negatif (-) bergerak ke katoda (+), yang bermuatan (+)
akan bergerak anoda (-).
Dasar elektroforesis: pembentukan suatu ketidakhomogenan atau
gradasi konsentrasi sepanjang sistem.
Jenis Senyawa: amino acids, proteins, nucleotides, nucleic acids.
Pemisahan tergantung pada ;
1) Struktur kimia
2). pH,
3). Gugus fungsional
4).Dan bobot molekulnya

Keuntungan Analisis elektroforesis:

Senyawa metabolit maupun senyawa biokimia
dengan BM besar .
Tidak diperlukan jumlah besar, dan pemurnian
yang tinggi.
Dapat digunakan sampel langsung tanpa
pemisahan, misalnya urin dan cairan limpa.
Senyawa yang bersifatpolar, bermuatan atau
bersifat zwitter ion
Elektroforesis sangat bermanfaat untuk mengetahui :

Kondisi dari obat yang diberikan kepada pasien atau binatang

percobaan.

Dengan analisis elektroforesis perjalanan obat dapat dilacak

Alat yang menggunakan tenaga 100 volt/cm secara bertingkat,

dapat memisahkan beberapa senyawa hanya dalam 15 menit.

Dapat untuk analisis kualitatif, maupun kuantitatif asal ada

detektor (densitometer).
4
Agarose Gel Electrophoresis System
 METODOLOGI
5
Dikemukakan oleh Tellius pada pemakaian pertama kali sekitar tahun
1930, untuk memisahkan protein dalam larutan dapar yang ditempatkan
dalam tabung berbentuk u.
Pada kedua ujung diberikan elektrode negatif dan positif yang
kemudian diberi arus searah. Dengan pengaruh medan listrik tersebut,
protein akan bergerak secara bebas menuju kutup yang belawanan
dengan muatannya.

Gerakan tersebut disebut moving baundary, karena terjadinya peristiwa

itu dalam larutan dinamakan free solution. Gerakan tersebut
dipengaruhi pula oleh berat jenis molekul.
 Metode yang lain disebut zone electrophoresis
Sampel
6
ditotolkan pada lapisan datar atau kertas
yang basah dengan larutan dapar, kemudian kedua
ujung kertas diberi arus listrik searah, dengan
tegangan tinggi.
Karena pengaruh medan listrik maka terjadi gerakan
bercak kearah elektrode positif maupun negatif
(Lehninger, 1988 dan Conway 1977).
Menurut Bio-rad (1983), berdasar peralatan dan teknik
pengembanagan alat elektro foresis dibedakan
menjadi slab electrophoresis ialah menggunakan
lempeng sebagai fase diam,
Dan tube electrophoresis menggunakan bahan fase
diam yang ditaruh dalam tabung. kemudian karena
terjadi gerakan mendatar dan vertlkal dibedakan
menjadi elektroforesis vertical dan horizontal.
 TEORI ELEKTROFORESIS
LARUTAN
7
BEBAS
Elektroforesis dalam larutan bebas atau moving
boundery electrophoresis, migrasi ion mempunyai
kecepatan dasar yang, dirumuskan:

Vo= Adalah kecepatan migrasi dalam larutan yang

paling encer dalam medan listrik X.= Besarnya medan
listrik dirumuskan :

E dalam satuan volt, f = panjang larutan dalam satuan

cm, dan Uo dalam cm/detik. maka Vo dalam satuan
cm2.detik-1.volt1. Karena itu persamaan elektroforesis
menjadi :
Uo adalah mobiltas ion dalam larutan, Q =
muatan
8 partlkel, r radius efektif partlkel, =
viskositas
Medium. Harga Q dapat diganti dengan Z
dan E, yang masing-masing valensi dan jumlah
elektron

Jadi mobilitas partikel pada elektroforesis

kertas sebagai berikut:
 :Bilakekuatan medan X maka kekuatan
dalam sistem menjadi Fx, yang dirumuskan
9

Fx menyatakan kecepatan total maka

menurut
HUKUM STOCKES:

dengan menggabungkan rumus 7 dan 6 dan

berdasar persamaan pertama (1):

kenyataan hukum stockes hanya efektif untuk ukuran partikel 1300

Ao dan tidak berlaku untuk molekul mendekati ukuran molekul air.
Bila dicoba pada amonium kuaterner dan dibuat
garis
10 regresi hubungan log mobilitas pada
konduktivitas tertentu; dengan log radius ion,
didapatkan slope -2,33.
Menurut penelitian Edward dan Waldron untuk
ion-ion organik yang beradius 3-5 A0 sebaiknya
menggunakan rumus:
ZE
Uo = (9)
5 rw(f/fO)
Jelas sekali bahwa mobilitas partlkel sangat
tergantung pada radius, valensi dan jumlah
muatan,dan kekentalan medium.
Untuk senyawa yang bersifat zwitter ion
dipengaruhi besaran f/fo, menyatakan rasio
radius yang berbentuk elips.
Migrasi sampel
 Eletroosmosis

Eletroosmosis dan mobilitas relatif

Bila elektoforesis sedang dalam proses dan Tegangan listrik
diberikan, maka terlihat adanya migrasi partikel ion, baik itu
dalam larutan maupun pada lempeng atau kertas yang digunakan
sebagai media
Gerakan tersebut dinamakan arus elekto osmotik atau efek
elektroosmotik. Efek tersebut cukup besar bila sel atau media
elektroforesis mempunyai bentuk paking yang porus serta
berada ber sama elektrolit.
Larutan atau media akan menyesuaikan, dan bahkan dapat
membentuk muatan
 Elektrodialisis
Dialisis adalah Pergerakan ion-ion dan molekul kecil melalui
selaput semipermeabel (yang tidak dapat dilalui partikel
koloid).
Elektrodialisis merupakan proses dialisis di bawah pengaruh
medan listrik.
Listrik tegangan tinggi dialirkan melalui 2 layar logam yang
menyokong selaput semipermeabel.
Kemudian, partikel-partikel zat terlarut dalam system koloid
berupa ion-ion akan bergerak menuju electrode dengan
muatan berlawanan.
PRINSIP ELEKTROFORESIS

PRINSIP PEMISAHAN :
- Menurut muatan partikel

- Menurut ukuran partikel

(1) Menurut Muatan Partikel

Ketika molekul bermuatan

ditempatkan dalam medan
listrik, mereka bermigrasi ke
arah kutub baik positif
(anoda) atau negatif
(katoda) sesuai dengan
muatannya.
 (2) Menurut Ukuran Partikel
Katode 45kD 10kD 25kD

Anode
PRINSIP

qE = fv
q: muatan partikel dalam medium insulating
f: koefisien friksi (gesekan) dalam vakum = 0
v: kecepatan partikel
= v/E = q/f
: mobilitas elektroforetik
Bergantung pada medium penyangga, pH,
kekuatan ionik dan temperatur
Instrumentasi
Electrophor
esis tank Catho
de

Paper
support
medium

Alat elektroforesis gel Alat elektroforesis kertas

 Medium
Kertas kertas selulosa asetat gel
Fungsi :
- reseptor spot/pita dari zat-zat terlarut
- menyediakan jalur migrasi
Medium berbeda : efektivitas pemisahan berbeda
bergantung sifat zat yang dipisahkan
 Bufer
Fungsi :
- Membawa arus yang diberikan jembatan konduksi
- menyediakan Ph
- Menentukan muatan dari zat terlarut
Kekuatan ionik buffer

- kekuatan tinggi pita yang tajam

- kekuatan tinggi panas lebih tinggi
Bufer yang biasa digunakan

- bufer barbital & Tris-EDTA untuk protein

- tris-asetat-EDTA & tris borat-EDTA
 Deteksi
Dengan pewarnaan:
- Prinsip : diberi perreaksi spesifik
- cara : disemprot, diuapi, direndam, dll
- kadang perlu menghilangkan warna background pada medium
dengan destaining.
Tanpa pewarnaan:
- deteksi dengan UV
- densitometer/scanner
Indetifikasi
- mengukur jarak tempuh komponen Rf
- Spot dengan Rf/jarak tempuh yang sama dengan standar
dianggap sebagai senyawa yang sama
Faktor yang mempengaruhi laju
migrasi muatan molekul
Muatan intensitas
Ukuran
Bentuk Medan
Molekul listik

Media
penyangga Buffer

Sifat pH
Ukuran pori
 Jenis Elektroforesis
Moving Boundary Zone (berbatas)
(batas bergerak)

Gel Paper

Polyacryalmide Agarose Agarose-PA

Non Dissociating Dissociating

(Native-PAGE) (SDS-PAGE)
Elektroforesis Kertas
Diperkenalkan 1950 untuk pemisahan protein (kertas selulosa)
Berperan pada pemisahan protein atas dasar mobilitasnya
pada pH tertentu.
Menggunakan kertas saring sebagai medium penyangga
gugus OH pada kertas dapat berinteraksi dengan sampel
menyebabkan pita berekor
Elektroforesis Kertas
Teknik pengerjaan mirip dengan kromatografi kertas
Aplikasi contoh :
- cara kering :
seperti kromatografi kertas
resolusi spot lebih baik karena lebih kecil
belum ada jembatan konduksi
- Cara basah :
Kertas dibasahi dengan bufer lalu contoh ditetesi
Spot lebih lebar
Sudah ada jembatan konduksi
Hanya untuk molekul kecil yang mobilitasnya kecil perlu potensial tinggi
(+200volt/cm)panas meningkat
Efek elektroosmotik tinggi
Efek difusi besar
 Kelebihan Dan Kekurangan Elektroforesis Kertas

Kelebihan Kekurangan

Mudahnya mengamati reaksi Rawan terjadi kesalahan

kimia selama proses pada proses pemindahan
berlangsung
campuran sampel ke dalam
Sampel dapat ditangani
dengan baik dan baik slot gel,karena slot gel
Gel dari hasil percobaan dapat ukurannya sangat kecil
disimpan dalamkantong plastik
dan didinginkan seteah
percobaan, sehigga dapat
dipakai untuk dokumentasi
penting yang dapat dipelajari
lebih lanjut dilain wakt.
Selulosa Asetat
1957: Kertas selulosa asetat
Lebih cepat, meningkatkan resolusi dan sedikit
berekor, background warna lebih sedikit dibanding
kertas
Lebih transparan, dapat digunakan dengan deteksi
optikal, mudah dilarutkan dalam berbagai sampel,
baik untuk isolasi
Elektroforesis Gel Pati
gel pertama yang digunakan (1958)
Pati kentang dipanaskan hingga menjadi campuran
homogen dan transparan. Larutan panas diletakkan
pada cetakan dan dibiarkan pada suhu ruang
hingga menjadi gel semisolid
Permukaan gel ditutup dengan lilin atau grease
dan ujungnya diberi sumbu untuk menghubungkan
dengan elektroda
Pergerakan dalam gel pati ditentukan oleh muatan
total dan ukuran molekul
Gel Pati
memiliki efek pengayakan
molekul kecil cenderung bergerak dibandingkan yg besar.

dikontrol oleh ukuran pori gel ukuran pori gel pati sangat
beragam
memiliki muatan negatif pada rantai ujung (karboksilat)
berinteraksi dengan protein dan menutupi pergerakan oleh
mekanisme pertukaran ion
kertas maupun pati memiliki sifat elektroforetik dan kromatografi
Elektroosmosis: muatan positif bufer bergerak ke katoda
pergerakan sampel dalam gel: penjumlahan migrasi elektroforetik
dan elektroosmotik.
Efek elektroosmotik: ditentukan dengan blue dextran setelah
elektroforesis dan subtractied dari pergerakan yang ditentukan.
Gel Poliakrilamida
PAGE menggantikan gel pati untuk memisahkan protein, fragmen RNA
yg kecil, dan fragmen DNA yg sangat kecil.
Lebih fleksibel daripada pati karena memiliki efek pengayakan yang
ditentukan oleh konsentrasi gel, tidak ada efek adsorpsi protein pada
gel
Inisiator: amonium persulfat/kalium persulfat
Katalis: tetrametiletilendiamina (TEMED, (CH3)2N(CH2)2N(CH3)2).
Konsentrasi monomer rendah memerlukan TEMED konsentrasi tinggi
 Gel Poliakrilamida
Pewarna pelacak: bromfenol biru (anion) atau metilena biru (kation)
Bufer dibuat dalam keadaan dingin selama pemisahan
Protein diendapkan pada tempatnya setelah pemisahan selama
peremndaman dalam larutan asam trikloroasetat (TCA) lalu diwarnai
untuk deteksi
Apa perbedaan PAGE (PolyacrylAmide Gel Electrophoresis)dalam
bentuk kolom dan bentuk slab?
Gel Akrilamida
Komposisi gel ditentukan oleh %T dan %C
%T = bobot (g) monomer + cross-linker/100mL
%C = 100 x (g cross-linker)/(gram monomer +
cross-linker)
Rf = jarak protein/jarak marker
Log Rf vs %T
SDS-PAGE: standar protein
SDS PAGE
Sodium Dodesil Sulfat (SDS) : Detergen
Bagian hidrofobik bereaksi dengan protein dengan
perbandingan teraktur
Protein membawa muatan SDS dengan Mr berbeda
sampel memiliki muatan sama tetapi berbeda
Mr-nya.
1
3. 3 1
U= = kz 3
6 4
SDS PAGE
Gel Agarosa
Digunakan awal 1970
Polimer linear D-galaktosa dan 3,6-anhidrogalaktosa yang
diisolasi dari rumput laut
Mengandung kurang dari 0.04% sulfat
Gel terbentuk oleh ikatan hidrogen
Ukuran pori lebih besar dari pada gel poliakrilamida
Digunakan dalam bentuk slab untuk horisontal dan vertikal
Relatif lebih mudah pecah
Mengandung gugus bermuatan: sulgat, dan karboksilat
berinteraksi dengan protein efek penukar ion & elektroosmosis
Pretreatmen dalam larutan alkali hidrolisis gugus
bermuatan meningkatkan efek penyaringan
Viskositasnya sangat dipengaruhi oleh suhu
Banyak digunakan untuk pemisahan DNA
Gel Agarosa
Digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen
DNA yang ukurannya memiliki rentang beberapa
ratus hingga sekitar 20.000 kb.
Bersifat tidak toksik
Pada konsentrasi 1% w/v gel dalam bufer yang
mengandung air dalam kadar tinggi, struktur
seratnya baik, ukuran porinya besar, dan tahan
terhadap gesekan.
Proses elektroforesis sangat cepat, khususnya
pada pemisahan makromolekul.
Gel Poliakrilamida-agarosa
Komposit gel poliakrilamidan dan agarosa
meningkatkan ukuran pori gel dengan kekuatan
mekanik yang lebih baik
Baik untuk asam nukleat, nukleoprotein, protein
Kelebihan Dan Kekurangan Elektroforesis Gel

kelebihan kekurangan
Proses migrasi lebih cepat Adanya gangguan yang
Pemisahan spot menjadi disebabkan oleh adanya
lebih kecil dengan gugus OH yang terdapat
spektrofotometri pada selulosa yang dapat
Mudah dilarutkan dalam berinteraksi dengan molekul
jumlah sedikit polar sehingga daya migrasi
molekul tersebut terganggu
dan menjadi lebih rendah
 Elektroforesis kapiler adalah
metode elektroforesis yang
digunakan untuk memisahkan
asam amino, protein,
lipid, karbohidrat dan
nukleotida, dengan resolusi
tinggi yang dilakukan pada
pipa kapiler berisi buffer.

Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940. Elektroforesis
kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan semua
komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan
dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia.Teknik pemisahan
ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter
pipa kapiler, serta konsentrasi sampel.
 Teori Dasar :
Aliran digerakkan oleh EOF dlm kapiler
Dipengaruhi oleh pH, medan listrik, suhu dan
Senyawa lain (EOF) modifier
Detektor (UV-Vis)
langsung dan Tidak Langsung
Sistim Injeksi
Hidrodinamik
Elektrokinetik
Tekanan (Positif dan reduksi)
Pengaruh Kondisi Permisahan dalam
Elektroforesis
Tegangan Temperatur: perlu pendingin
Difusi
pH bufer untuk nilai pH di bawah nilai titik
isoelektrik (pI), protein dapat bermuatan positif dan
akan bergerak mendekati katoda (negatif). Jika pH >
pI, protein akan memiliki muatan negatif dan bergerak
mendekati anoda (positif)
Konsentrasi bufer kekuatan ionik. Interaksi antara
spesi gugus permukaan yang bermuatan dengan ion
buffer menghasilkan ion atmosfer. Keduanya
bermuatan dan mobilitasnya mempengaruhi kekuatan
ion dan analit protein.
Pewarnaan
Beberapa pereaksi pewarna
Pereaksi Senyawa yang dideteksi
Amino black 10B Protein
Coomassie blue Protein
Silver nitrat Protein
Etidium bromida DNA dan RNA
Sudan black Lipid dan lipoprotein
Schiff-periodic acid Karbohidrat dan glukoprotein
Ninhydrin Asam Amino
Dalam kegiatan biologi molekuler,
elektroforesis merupakan salah satu cara
untuk memvisualisasikan keberadaan DNA,
plasmid, dan produk PCR.

Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk

pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki
karakteristik khusus, misalnya sidik jari.

Memudahkan identifikasi protein yang

terdapat pada sebuah DNA.
APLIKASI ELEKTROFORESIS ZONA
Penentuan Muatan dan Bobot Molekul Protein
dengan PAGE
Penentuan BM DNA dengan gel
agarosa
Identifikasi Isoenzim
Diagnosis Penyakit
Imunoelektroforesis