elektroforesis

FAKULTAS FARMASI
2016
 Outline
• Pendahuluan
• Mode dalam Elektroforesis
• Media Elektroforesis
• Elektroforesis Kapiler
• Review Jurnal
 Pendahuluan
• Ferdinan Freseric Reuss, 1807 → pergerakan partikel bermuatan
akibat medan lisrtik
• Michelis → istilah elektroforesis
• 1950-an → elektroforesis mulai banyak digunakan, 1970-an → KCKT
→ elektroforesis : protein dan DNA
• Elektroforesis : metode analisis yang berdasarkan perbedaan
mobilitas atau pergerakan dari dua atau lebih analit yang
bermuatan atau partikel pada medium penghantar oleh adanya
pengaruh medan listrik arus searah.
• Pergerakan dalam elektroforesis akan mengarah pada elektroda
dengan muatan yang berlawanan dari partikel atau ion yang akan
dipisahkan.
• Kation → katoda, anion → anoda, spesi netral tidak bergerak
dengan adanya medan listrik, bergerak dengan berdifusi dan
terbawa oleh aliran elektroosmotik.
• Laju pergerakan dari partikel yang bermuatan → resultan dari daya dorong dan
gaya hambat.
•Gaya dorong dalam elektroforesis, disebabkan oleh kekuatan medan listik, E,
𝑡𝑒𝑔𝑎𝑛𝑔𝑎𝑛 𝑉
𝐸= =
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑎𝑛𝑡𝑎𝑟𝑒𝑙𝑒𝑘𝑡𝑟𝑜𝑑𝑎 𝐷

• Sedangkan gaya dorong yang dialami sebuah ion:

𝐹𝑒𝑓 = 𝑞𝐸
q : muatan total ion.
• Gaya hambat, 𝐹𝑒𝑓 , dinyatakan dengan hukum Stokes:
𝐹𝑓𝑟 = 6𝜋𝑟𝜐𝜂
di mana:
𝜂 : viskositas medium
r : radius molekul
𝜐 : kecepatan.
• Selain gaya gesek, gaya hambat dapat diakibatkan oleh : bentuk dan ukuran
molekul, konsentrasi elektrolit, kelarutan, adsorpsi pada permukaan, dan adanya
kompleksasi dengan spesi pada larutan elektrolit.
• Saat kesetimbangan :
𝐹𝑒𝑓 = 𝐹𝑓𝑟
Sehingga:
𝑞𝐸 = 6𝜋𝑟𝜐𝜂
𝑞𝐸
𝜐=
6𝜋𝑟𝜂

• Mobilitas μ, merupakan kecepatan rata-rata dari ion pada medan listrik tertentu,
𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑘𝑒𝑐𝑒𝑝𝑎𝑡𝑎𝑛 𝜐
𝜇= =
𝑘𝑒𝑘𝑢𝑎𝑡𝑎𝑛 𝑚𝑒𝑑𝑎𝑛 𝑙𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑘 𝐸
• Mobilitas sebanding dengan rasio muatan-ukuran.
• Spesi kecil, muatan yang besar, seperti ion → mobilitas tinggi
• Senyawa terionisasi besar, seperti protein → mobilitas rendah.
• Pada elektroforesis, berlaku hukum Ohm, yaitu 𝑉 = 𝑖𝑅, dan daya 𝑊 = 𝑖 2 𝑅,
• W dapat digunakan untuk menyatakan kuantitas kalor yang dapat dihasilkan
dari gaya listrik → aliran konveksi, perambatan termal, evaporasi, perubahan
viskositas, terjadinya variasi pH, dan degradasi analit (terutama protein) dan
matriks → pelebaran pita dan turunnya resolusi →digunakan larutan dapar
yang encer dan konduktivitas rendah, tegangan yang rendah (100-500 V), arus
atau daya yang konstan, atau dengan menggunakan sistem pendingin.
 Mode dalam Elektroforesis
• moving boundary electrophoresis
• elektroforesis zona
• pemusatan isoelektrik atau isoelectric focusing
• isotachophoresis.
 Moving boundary electrophoresis
Sampel dan dapar diletakkan dalam sebuah
reservoir sampel (wadah elektrolit), dicelupkan
elektroda pada kedua ujungnya. Larutan dapar
akan menghubungkan dua elektroda dan
terpisahkan oleh matriks pemisahan. Ketika
potensial diberikan, analit dalam sampel akan
terpisah berdasarkan perbedaan mobilitasnya.
Saat ini, tenik tersebut jarang digunakan, kecuali
mungkin untuk tujuan preparatif.
 Elektroforesis Zona
Sampel dimasukkan dalam sebuah cerukan atau
lubang dalam media, umumnya gel, yang ada di
dalam larutan dapar elektrolit. Analit diletakkan
di suatu titik di antara elektroda jika muatan
analit tidak diketahui. Komponen sampel akan
bermigrasi dengan kecepatam yang berbeda dan
mungkin ke arah yang berbeda tergantung
mobilitas dan muatannya. Jadi setelah periode
waktu tertentu, komponen akan terpisah
menjadi zona-zona.
 Isoelectric focusing
Merupakan elektroforesis pada gradien pH. Senyawa
ionik akan bermigrasi ke titik pada gradien tersebut
di mana senyawa tersebut memiliki muatan total nol
dan tidak ada mobilitas. Gradien pH diperoleh
dengan memberikan tegangan pada campuran
senyawa amfoter (amfolit) yang memiliki nilai pI
dengan rentang-rentang yang sempit. Secara umum,
campuran protein dicampurkan dengan amfolit, dan
ditempatkan di antara elektroda, untuk kemudian
dipisahkan.
 Isotacophoresis
Bentuk dari elektroforesis di mana gradien tegangan
dihasilkan dengan menggunakan dapar dengan mobilititas
yang berbeda pada arus yang konstan. Elektroforesis
berjalan hingga semua analit ionik bergerak dengan
kecepatan yang sama. Sampel diletakkan di antara leading
electrolyte, yang mana μbuffer ion>> μsampel, dan terminating
electrolyte, yang mana μbuffer ion<< μsampel. Leading
electrolyte biasanya berupa ion kecil seperti klorida dan
terminating electrolye biasanya ion yang lebih besar,
seperti histidine. Ketika kondisi steady state tercapai, akan
terbentuk lebar pita yang berbeda.
 Media Pemisahan Elektroforesis
• Elektroforesis dapat dilakukan pada medium larutan.
• Namun karena terjadinya percampuran termal dan difusional,
resolusi yang memuaskan sering tidak dapat tercapai
• Maka dari itu perlu sebuah penyangga, yang memuat elektrolit,
sampel, dan yang dapat untuk mengurangi difusi.
• Penggunaan penyangga sebagai medium penstabil telah banyak
dikembangkan dari berbagai jenis material, mulai dari kertas, silika,
serbuk selulosa, selulosa asetat, nitroselulosa, hingga gel.
 Slab Gel Electrophoresis
• Gel dari alam → awal : pemisahan protein plasma. Kini : gel kemurnian tinggi →
protein
• 1955, Smithies memodifikasi jenis gel → gel pati → dari pati kentang
terhidrolisis, 5-10 mm → pemisahan lebih baik
• Pada tahun 1955, Raymond dan Weintraub mengganti pati → gel polimer
sintetik, dari monomer poliakrilamid → lebih kuat, fleksibel, jernih, dan inert
• Gel akrilamid : hasil polimerisasi monomer akrilamid dengan adanya N,N—
metilbisakrilamid (BIS). Digunakan katalis, yang umum : N,N,N,N’,N”-
tertrametiletilendiamin (TEMED).
 SDS PAGE dan Elektroforesis DNA
Sodium dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)

Protein memiliki rasio muatan-ukuran yang beragam → muatan dari protein

akan bervariasi bergantung dari pH. SDS, yaitu sebuah surfaktan anionik yang
dapat mensolubilisasi protein. Protein akan didenaturasi dengan SDS, dengan
beikatan pada rangka protein. Protein yang telah didenaturasi kemudian
dielektroforesis dengan PAGE dalam sistem dapar yang ditambahkan 0,1% SDS.

Elektroforesis pada DNA

Elektroforesis gel agarosa merupakan metode untuk memisahkan fragmen

restriksi DNA, di mana fragmen DNA akan berukuran 1000 hingga 23000 pasang
basa.
 Instrumentasi Dasar Elektroforesis
• Generator tegangan DC : baterai 12 V hingga pensuplai
tegangan 100 hingga 500 V DC.
• Tanki tempat larutan dapar : tahan air, dan bahan
plastik yang tidak dapat menghantarkan listrik, dilapisi
penutup untuk mencegah penguapan dan kontaminasi
pada sistem, ukuran100 mm2 hingga 500 x 300 mm.
• Di bagian luar : terhubung dengan elektroda. Elektroda
: kawat platinum dan terhubung ke dinding tanki.
• Wadah gel : untuk pemisahan, dapat berbentuk tube
dengan ukuran diameter dalam 105 mm dan
panjangnya 50-250 mm, atau gel dapat benebntuk
lempengan, dapat dalam posisi horizontal atau vertikal.
 Metode Deteksi
• Sampel akan tidak berwarna dan tidak dapat dilihat dengan mata telanjang →
metode deteksi, lokalisasi, dan kuantisasi dari pita atau bercak dari analit.
• Pengamatan langsung : pita hemoglobin yang dipisahkan dengan elektroforesis
pada membran nitroselulosa → UV
• Medium yang rapuh seperti gel → ekstraksi sebelum visualisasi → diperlukan
blotting.
• Blotting : mentrasfer pita atau bercak sampel dari gel ke membran menggunakan
mekanisme fisik atau elektrik. Membran : nitroselulosa, nylon, atau poliviniliden
difluorida (PVDF).
• Southern blotting, dikembangkan pertama oleh Profesor Ed Southern, untuk
sampel DNA. Northern blot untuk RNA, dan untuk protein disebut Western blot.
 Blotting
• Pada mekanisme fisik, analit akan berdifusi ke
membran akibat adanya tekanan yang diberikan pada
gel yang berkontak dengan membran.

• Sedangkan dengan mekanisme elektrik, gel yang

mengandung pita DNA, dilekatkan dengan membran,
lalu dicelupkan dalam dapar, di antara 2 elektroda.
Kemudian diberikan tegangan agar terjadi
perpindahan ke membran. Jika tidak digunakan dapar,
melainkan kertas saring yang dibasahi dengan dapar,
maka teknik tersebut disebut semi-dry blotting.
 Metode deteksi
Posisi analit pada lembaran dapat ditentukan dengan beberapa metode.:
• Senyawa berlabel radioaktif dan telah terinkorporasi pada analit → autoradiografi.
• Reaksi derivatisasi → derivat yang berwarna dan dapat dilihat. Misal : pada asam amino,
peptida, dan protein → ninhidrin
• Protein → Coomassie brilliant blue → 0,3 μg protein dalam satu bercak.
• DNA → Ethidium bromida
• Ion perak : untuk protein dan juga DNA → terbentuk endapan perak hitam. Sensitivitas hingga
2 ng protein.
• Zimografi dan imunoelektroforesis. Setelah dilakukan blotting, protein yang terimobilisasi akan
di-probe dengan antibodi spesifik dari protein tersebut. Lalu ditambahkan antibodi kedua yang
terikat enzim yang akan menempel pada antibodi yang pertama.
 Metode kuantitatif
• Area dari pita yang telah terpisah dapat menunjukkan jumlah analit,
dibandingkan dengan larutan standarnya.
• Area dari pita atau bercak dapat diperoleh dengan densitometri
atau dengan metode analisis digital.
 Aplikasi
• Saat ini, hanya sedikit pemanfaatan elektroforesis planar untuk
pemisahan berbagai senyawa.
• Saat ini, analisis banyak dilakukan dengan KCKT dan juga
elektroforesis kapiler.
• Hingga saat ini, hanya protein dan DNA yang masih banyak
dianalisis menggunakan teknik elektroforesis planar ini.
Capillary Electrophoresis
Elektrolisis kapiler merupakan metode
analis yang didasari oleh migrasi yang
terjadi di dalam kapiler berisi analit
bermuatan yang terlarut dalam larutan
elektrolit di bawah pengaruh medan
listrik.

Kecepatan migrasi analit dipengaruhi

oleh medan listrik, mobilitas
elektroforetik analit dan mobilitas
elektroosmotik kapiler.
 Mobilitas Elektroforetik
Mobilitas eletroforetik bergantung pada
sifat analit dan dapar yang digunakan.
Kation bergerak menuju anoda, anion
menuju katoda, sementara molekul
netral tidak terpengaruh.
Mobilitas elektroforetik (VEP) analit
dengan asumsi analit berbentuk sferis
(bulat) ditentukan dengan persamaan:
 Mobilitas Elektroosmotik
Aliran ini berhubungan dengan migrasi
molekul bermuatan dari elektrolit melalui
pipa kapiler.
Pada pH lebih dari 3, dinding dalam pipa
kapiler silika bermuatan negatif yang
disebabkan ionisasi silanol dipermukaan
(Si-OH) sehingga kation berkumpul di dekat
silanol untuk menjaga keseimbangan
muatan.
Ketika pipa kapiler diberikan medan listrik,
kation akan tertarik menuju katoda dan
membawa sebagian molekul bermuatan.
 Mobilitas Elektroosmotik
Mobilitas aliran elektroosmotik (μeo) dipengaruhi oleh densitas
muatan dinding dalam pipa kapiler dan sifat dapar yang digunakan.
Mobilitas elektroosmotik (Veo) ditentukan dengan persamaan:
 Instrumentasi
Injeksi sampel
◦ Elektrokinetik
Ujung pipa kapiler dicelupkan kedalam larutan (elektrolit) yang berisi
sampel kemudian dialirkan tegangan listrik yang menyebabkan sampel masuk
kedalam kapiler dengan kombinasi migrasi ion dan aliran elektroosmotik.
◦ Hidrostatik
Ujung pipa kapiler juga dicelupkan kedalam larutan (elektrolit) yang berisi
sampel, perbedaan tekanan menyebabkan larutan masuk kedalam kapiler.
 Instrumentasi
Detektor
◦ UV/Vis
Deteksi biasa dilakukan dengan UV-Vis menggunakan detektor diode-array. UV sensitif bila
digunakan pada panjang gelombang yang rendah.
◦ Fluoresence
Detektor ini mengimplikasikan pada derivatisasi dari analit, yang diberi label dengan flurophore
secara kimia. Kemudian pemisahan dilakukan seperti biasa. Sensitifitas dari deteksi ini meningkat
jika sumber laser digunakan sangat kuat.
◦ Spektrometri massa
Spektrometri massa dihubungkan dengan elektroforesis kapiler sehingga memberikan informasi
berat molekul zat terlarut. Untuk itu, dibutuhkan aliran cairan yang lebih pada kapiler
elektroforesis untuk mendapatkan ion fase gas dari zat terlarut.
 Capillary Zone Electroporesis (CZE)
• Pada CZE, analit bergerak dalam aliran elektroosmotik, namun dipisahkan
dalam pita-pita karena perbedaan mobilitas elektroforetik masing-masing
analit. Perbedaan mobilitas elektroforetik masing-masing analit ini
menyebabkan perbedaan kecepatan migrasi analit-analit secara keseluruhan
dan dengan perbedaan kecepatan berarti terdapat pemisahan
• Hal terpenting dalam CZE adalah pemilihan dapar yang sesuai untuk mencuci
kapiler sebelum kapiler digunakan dan untuk melarutkan analit. Pemisahan
terjadi karena interaksi yang relatif sederhana antara analit dengan pH dapar.
 Micelar Electrokinetik Capillary
Chromatography (MEKC)
• Pada elektroforesis kapiler ini ditambahkan
surfaktan ionik kedalam larutan penyangga
yang mengalir pada konsentrasi misel kritis.
• Misel ini bercampur dalam larutan,
membentuk fase pseudo-statis seperti fase
diam pada HPLC.
• Misel menangkap senyawa netral melalui
afinitas interaksi hidrofilik/hidrofobik.
 Capillary Gel Electrophoresis (CGE)
• Elektroforesis gel dalam kapiler. Kapiler diisi larutan elektrolit yang
diserap oleh gel.
• Hal ini menyebabkan efek filtrasi, yang menurunkan aliran
elektroosmotik dan mengurangi fenomena konveksi dan difusi.
• Oligonukleotida dapat dapat dipisahkan dengan metode ini. Teknik
yang telah dimodifikasi dikenal dengan capillary array
electrophoresis untuk pemisahan fragmen DNA atau RNA
berdasarkan ukurannya.
 Capillary Isoelectric Focusing (CIEF)
• Pemisahan berdasarkan pada perbedaan titik isoelektrik (pI) dari analit.
• Pemisahan protein dalam CIEF tergantung pada panjang pipa kapiler dan
migrasi analit.
• Pipa kapiler diisi dengan larutan yang mengandung zwitterion atau ampholyte.
• Analit (umumnya protein) akan bermigrasi melalui media hingga mencapai
daerah yang pH nya sama sebagai titik isoelektriknya. Kemudian dengan
mempertahankan medan listrik dan menggunakan tekanan hidrostatik, spesies
yang terpisahkan ini akan bergerak menuju detektor.
 Review Jurnal : 1

Sanli, S., C. Lunte, 2014,

Determination of Eleven
Flavonoid in Chamomile
and Linden Extracts by
Capillary electrophoresis,
Anal. Methods, 6, 3858.
 Pendahuluan
• Tujuan : mengembangkan metode untuk penetapan kadar sebelas flavonoid
dalam ekstrak chamomile dan linden
• Senyawa flavonoid yang diteliti : apigetrin, naringin, neringenin, katekin,
galangin, apigenin, luteolin, kuersetin, mirisetin, kaempferol, dan kaemferide
• Analisis flavonoid banyak dilakukan dengan menggunakan KCKT dan
kromatografi gas.
• Elektroforesis kapiler dan kromatografi elektrokinetik miselar juga telah
dilaporkan dapat digunakan dalam analisis dan pemisahan flavonoid
 Prosedur dan sistem elektroforesis (1)
•Pertama, kapiler diaktivasi dengan dialiri secara berturut-turut:
 metanol (5 menit),
 HCl 1,0 M (2 menit),
 air (2 menit),
 NaOH 1,0 M,
 air (2 menit)
 larutan dapar (20 menit).

•Kapiler lalu dikondisikan dengan dicuci dengan:

 NaOH 1,0 M (20 menit),
 air (2 menit), dan
 dapar (20 menit).
 Prosedur dan sistem elektroforesis (2)
• Sebelum sampel setelahnya dianalisis, kapiler dialiri dahulu dengan
 NaOH 1,0 M (3 menit)
 air (2 menit)
 dapar (3 menit).

• Tegangan : 24 kV
• Tekanan injeksi :10 psi selama 5 detik
• Deteksi : 210 nm.
 Preparasi sampel
• Sampel chamomile dan linden dikumpulkan, dikeringkan di udara.
• 0,5 gram dari tiap sampel digerus dan ditimbang.
• Ditambahkan 25 mL metanol, 15 mL air, dan 0,04 gram BHT.
• Untuk hidrolisis ditambahkan HCl 6 M sebanyak 10 mL.
• Ekstraksi dengan refluks, 80 oC selama 1,5 jam, bebas cahaya.
• Setelah didinginkan, 5 mL larutan diambil, dikeringkan,residunya dilarutkan kembali dengan
dapar.
• Larutan disaring dengan membran 0,25 μm dan disuntikkan ke sistem.
Hasil dan Pembahasan
• Molekul flavonoid : satu gugus hidroksi fenolik yang dapat terionisasi. Ionisasi
→ menentukan mobilitas.
• pH pemisahan yang paling baik, antara 8,7 hingga 9,1. pH optimum : adalah 8,9
→ hasil resolusi, selektivitas, dan bentuk puncak yang baik.
• Konsentrasi borat ditingkatan, waktu migrasi meningkat. Resolusi yang baik
dicapai dengan waktu pemisahan tersingkat : dapar borat 40 mM.
• Tegangan tinggi → pemisahan cepat. Tegangan yang terlalu tinggi →
meningkatkan baseline noise dan meneybabkan pelebaran puncak. Diketahui
bahwa tegangan yang optimum adalah 24 kV.
Elektroforegram dari sebelas flavonoid pada
kondisi optimum. Puncak ditandai dengan
nomor 1 hingga 11, bertutur-turut : 1.
naringin, 2. apigetrin, 3. katekin, 4.
naringenin, 5. kaempferide, 6. galangin, 7.
kaempferol, 8. apigenin, 9. mirisetin, dan
10. luteolin
 Hasil dan Pembahasan
• Flavonoid → negatif → mobilitas elektroforetik berlawanan dengan aliran elektroosmotik.
• Naringin → glikosida disakarida, ukuran besar, mobilitas elektroforetik rendah → terelusi
pertama
• Apigetrin → glikosida monosakarida → akan terlusi kedua.
• Flavonoid aglikon lainnya akan terpisah berurutan sesuai dengan nilai pKa nya.
• Katekin → bermuatan parsial pada pH pemisahan dan memiliki mobilitas elektroforetik paling
rendah di antara aglikon lainnya → terelusi paling cepat.
• Luteolin dan kuersetin → molekul dianion pada pH pemisahan, mobilitas elektroforetik
tercepat → terelusi paling akhir
• Senyawa lainnya akn terelusi di antra katekin dan luteolin, bersadarkan kombinasi nilai pKa dan
ukurannya.
Elektroforegram dari ekstrak chamomile:
1. katekin, 2. kaempferol, 3. kuersetin.
 Elektroforegram dari ekstrak linden :
1. katekin, 2. kaempferol, 3. apigenin, 4. mirisetin.
 Daftar Pustaka
Dadakova E, Prochazkova E and Krizek M, 2001, Application of Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography for Quantitative Analysis
of Quercetin in Plant Materials, Electrophoresis, 22, 1573-1578.
H Thomas, Palaniyandi M, Kato T, Fleischmann P, Watzig H and Park E.Y, Characterization of Human Papillomavirus 6b L1 virus-like particles
Isolated from Silkworms using Capillary Zone Electrophoresis, J Biosci Bioeng, vol 118 No. 3, 311- 314.
Perrett, D.,I. D. Wilson (ed), 2000, Electrophoresis, in Encyclopedia of Separation Science, Academic Press, 103-117.
Rouessac F. and A. Rouessac, 2007, Chemical Analysis: Modern Instrumentation Methods and Techniques, 2nd ed, Francis : John Wiley &
Sons, Ltd, 145-158.
Sanli, S., C. Lunte, 2014, Determination of Eleven Flavonoid in Chamomile and Linden Extracts by Capillary electrophoresis, Anal.
Methods, 6, 3858.
Shi Q, Sui L.Z, and Lu Y.Q., 2013, Research on Flavonoids Contents in Fructus sophoera with Capillary Zone Electrophoresis”. Pak. J. Pharm.
Sci., Vol 26, No. 6 1131-1136.
Skoog D.A, Holler F.J, and Crouch S.R. , 2007, Principles of Instrumental Analysis, 2nd ed. USA, Thomson: Brooks/Cole, 868-883.
Zhang, L., R. Wang, Y. Zhang, Y. Yu, 2007, Application of High Performance Capillary Electrophoresis on Toxic Alkaloid Analysis, J. Sep. Sci,
30, 1357-1363.