1

BAB I

PENDAHULUAN

Elektroforesis menjadi alat yang penting dalam analisis klinis selama beberapa

dekade ini. Cara pemisahan utama dalam metode ini adalah berdasarkan pada

perbedaan tingkat migrasi analit dalam medan listrik. Terdapat bermacam-macam

jenis pemisahan ini dan berbagai skema yang digunakan untuk mengukur laju

migrasi analit dalam sampel yang dapat dimodifikasi. Metode ini penting dalam

analisis klinis untuk pemeriksaan asam amino, peptida, protein, dan asam nukleat,

serta banyak zat terlarut yang bermuatan kecil.1

Salah satu cara menggunakan elektroforesis adalah dengan menerapkan

sejumlah kecil sampel ke dalam buffer (biasanya gel) dan membiarkan komponen

dalam sampel berjalan dalam buffer dengan adanya medan listrik. Metode ini

dikenal sebagai elektroforesis gel dan secara historis menjadi jenis elektroforesis

yang paling umum ditemukan di laboratorium klinik. Selain itu ada juga teknik

lain untuk memisahkan komponen suatu sampel dengan menggunakan suatu

kapiler yang sempit yang diisi dengan running buffer, lalu diikuti dengan

penempatan ke dalam medan listrik. Cara yang kedua ini dikenal dengan sebutan

elektroforesis kapiler (EK). Tinjauan pustaka ini akan memberikan gambaran

tentang EK dalam analisis klinis.1.3

1
 2

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Elektroforesis

Elektroforesis adalah istilah komprehensif yang mengacu pada migrasi zat

terlarut atau partikel bermuatan dalam media cair di dalam pengaruh medan

listrik.

Penelitian tentang mobilitas elektroforesis protein pertama kali dilakukan oleh

Arne Tiselius pada tahun 1937 menggunakan media cair, ditemukan bahwa

terdapat perbedaan indeks bias cahaya pada batas antarmuka antara fraksi protein

utama saat digerakkan oleh alat pendeteksi cahaya.1,19

Zone electrophoresis bermakna migrasi dari molekul protein setelah sampel

dicampur larutan buffer, biasanya dalam media pendukung berpori seperti gel

agarosa lalu tiap zona protein dipisahkan dari zona yang lain oleh area bebas

protein. Zona divisualisasikan ketika media pendukung diwarnai dengan pewarna

khusus protein dan menghasilkan electropherogram, kemudian dipindai lalu

dihitung menggunakan densitometer. Media pendukung dikeringkan dan disimpan

sebagai rekaman permanen. Teknik ini umumnya digunakan untuk pemeriksaan

kimia klinis dan berguna untuk memisahkan protein pada serum, urin, liquor

cerebrospinalis dan lain lain.10,17

Di dalam sistem elektroforesis, bahan kimia terionisasi yang memiliki muatan

listrik bergerak menuju katoda (elektroda negatif) atau anoda (elektroda positif),

2
 3

contohnya: ion positif (kation) akan bermigrasi menuju katoda, dan ion negatif

(anion) bermigrasi menuju anoda. Pergerakan kation dan anion pada sistem

elektroforesis sederhana dapat dilihat pada gambar 2.1. Sebuah ampholyte

mengandung kedua muatan positif dan juga negatif, (dulu disebut zwitterion)

menjadi bermuatan positif dalam larutan yang lebih asam dibanding isoelectic

point (pl) nya dan akan bermigrasi ke arah katoda, sedangkan pada larutan yang

lebih alkali ampholyte menjadi bermuatan negatif dan akan bermigrasi menuju

anoda. Protein dapat berperan sebagai ampholyte pada larutan karena protein

mengandung banyak amino yang terionisasi (−NH2) dan grup karboksil (−COOH)

basa pada asam nukleat yang bisa bermuatan positif atau negatif.1,2,10,19

Pada awalnya elektroforesis dilakukan dalam gel poliakrilamida atau gel

agarosa pada slab yang disebut slab gel electrophoresis di mana molekul yang

memiliki muatan diterapkan ke salah satu ujung slab dan medan listrik diterapkan

di sepanjang slab. Molekul-molekul tersebut bermigrasi ke bawah slab dengan

kecepatan yang berbeda sesuai dengan charge to size ratio. Slab gel

electrophoresis masih banyak digunakan di bidang biologi dan biokimia pada

molekul besar seperti asam nukleat dan protein untuk menunjukkan konsentrasi

relatif molekul, kemurnian sampel, atau bila digunakan dalam hubungannya

dengan standar, berguna untuk mengidentifikasi senyawa. Slab gel

electrophoresis umumnya memiliki waktu analisis yang lama (biasanya 20-40

menit per sampel), efisiensi yang rendah, sulit dalam analisis, dan tidak mampu

mengidentifikasi senyawa dalam sampel secara pasti karena waktu migrasi tidak

selalu sama untuk setiap senyawa.4,17

 4

Gambar 2.1 Pergerakan Kation dan Anion dalam Medan Listrik

Dikutip dari Tietz17

Kecepatan migrasi bergantung pada faktor-faktor seperti muatan listrik

molekul, ukuran dan bentuk molekul, kekuatan medan listrik, sifat media

pendukung, dan suhu operasi. Mobilitas elektroforetik (μ) didefinisikan sebagai

kecepatan migrasi (cm/s) per satuan kekuatan medan (volt/cm). Persamaan

dibawah ini mengekspresikan mobilitas elektroforesis dan diturunkan dari dua

Rumus: yang pertama yang menyatakan gaya penggerak listrik medan pada ion

dan yang lainnya menyatakan gaya perlambatan disebabkan oleh resistansi

gesekan dari media

µ = Q / 6π rη

Keterangan:
μ = Pergerakan elektroforesis dalam cm 2/(V)(s)
Q = Muatan listrik di dalam ion
r = Radius ion dalam larutan
η = Viskositas larutan buffer dimana perpindahan terjadi.
 5

Jadi dapat disimpulkan bahwa mobilitas elektroforesis berbanding lurus

dengan muatan listrik dan berbanding terbalik dengan ukuran molekul dan

viskositas media elektroforesis. 9,10,17

2.2. Elektroforesis Kapiler

Elektroforesis kapiler banyak digunakan sebagai alternatif dari slab gel

electrophoresis. Elektroforesis kapiler umumnya berjalan lebih cepat daripada

slab gel electrophoresis, memberikan akurasi dan presisi yang lebih baik,

menggunakan lebih sedikit reagen dan lebih mudah untuk diotomasi.

Elektroforesis kapiler juga dapat menganalisis molekul yang lebih kecil dari slab

gel electrophoresis sehingga dapat memperluas jangkauan analit yang mungkin

untuk dianalisis.

2.2.1 Prinsip Elektroforesis Kapiler

Sistem elektroforesis kapiler yang khas, seperti yang ditunjukkan pada Gambar

2.2, terdiri dari gabungan kapiler silika, dua reservoir buffer elektrolit, suplai daya

tegangan tinggi, dan detektor yang dihubungkan ke unit akuisisi data. Sampel

dimasukkan ke dalam inlet kapiler. Ketika tegangan tinggi diaplikasikan di ujung

awal kapiler, molekul sampel dipisahkan oleh electro-osmotic flow (EOF), curah

aliran yang dihasilkan dari kelebihan ion positif di permukaan kapiler bagian

dalam bergerak menuju katoda. Ion positif dalam spesimen muncul lebih awal di

outlet kapiler karena EOF dan pergerakan ion berada dalam arah yang sama. Ion

negatif dalam spesimen juga bergerak menuju outlet kapiler tetapi pada kecepatan
 6

yang lebih lambat. Saat ion sampel bergerak menuju outlet kapiler, berbagai jenis

detektor, termasuk detektor optik, konduktivitas, elektrokimia, mass spectroscopy,

atau radioaktivitas, digunakan untuk mendeteksi dan mengukurnya.3,4,9,13

Gambar 2.2 Sistem Elektroforesis Kapiler

Dikutip dari Henry9

Keuntungan EK dibandingkan elektroforesis konvensional dan high

performance liquid chromatography (HPLC) adalah waktu analitiknya yang

singkat, daya penyelesaian yang ditingkatkan, dan volume sampel yang digunakan

sedikit. Pemisahan dapat diselesaikan dalam waktu kurang dari 10 menit dengan

menggunakan tegangan yang sangat tinggi. Penggunaan tegangan tinggi karena

rasio permukaan berbanding volume kapiler yang tinggi memungkinkan

perpindahan panas yang efisien melalui dinding kapiler.1,2,4

 7

2.2.2 Electroosmotic Flow (EOF)

Konstituen dasar dari EK adalah elektroosmotik, atau electroendosmotic flow

(EOF). Electroosmotic flow adalah aliran curah cairan di kapiler dan merupakan

konsekuensi dari muatan pada permukaan interior dinding kapiler. Hasil dari EOF

dihasilkan dari pengaruh medan listrik yang diterapkan pada lapisan ganda larutan

di dinding. Electroosmotic flow mengatur lamanya waktu zat terlarut tetap di

kapiler oleh superposisi aliran ke mobilitas zat terlarut.18

Gambar 2.3 Electro Osmotic Flow pada Capillary Zone Electrophoresis

Dikutip dari Bishop18

2.3. Mode Elektroforesis Kapiler

Elektoroforesis kapiler mempunyai beberapa mode yang sudah dikembangkan

dan dirangkum dalam Tabel 2.1 yang berdasarkan pada dasar pemisahan dan jenis

analitnya.1,4,5

Tabel 2.1 Mode Pemisahan Elektroforesis Kapiler

 8

Mode Prinsip pemisahan Analit

Capillary zone charge to mass ratio Ion kecil, molekul kecil,
electrophoresis peptida, protein, DNA

Capillary isoelectric lsoelectric point Peptida, protein

focusing

Capillary isotachophoresis Mobilitas: memisahkan Molekul kecil, peptida,

analit dengan mobilitas protein
yang sama sebagai ion
buffer, yang berbeda di
inlet dan outlet

Micellar electrokinetic Spesies bermuatan: Molekul kecil, Peptida,

capillary chromatography charge to mass ratio, dan DNA
partisi menjadi misel
berdasar hidrofobisitas
Spesies netral: partisi ke
deterjen misel berdasarkan
hidrofobisitas

Capillary gel Mekanisme pemisahan Peptida, protein, DNA

electrophoresis berdasar: charge to mass
Nondenaturing ratio

Denaturing Massa
Disadur dari Landers11

2.3.1 Capillary Zone Electrophoresis (CZE)

Capillary zone electrophoresis adalah teknik yang paling sederhana dan paling

umum, bermanfaat untuk pemisahan baik berat molekul rendah dan analit

makromolekul termasuk protein. Pemisahan dilakukan dalam buffer berkekuatan

ionik rendah yang dihasilkan berdasar charge to mass ratio. Resolusi dapat

ditingkatkan dengan mengubah kekuatan ionik dari buffer pemisah atau

menambahkan aditif seperti ion-pairing agent, pengubah aliran elektroosmotik,

atau pelarut organik.10

 9

Capillary zone electrophoresis menggunakan volume sampel yang kecil (1–5

μl) yang disedot ke dalam kapiler silika tipis dengan diameter 25–50 μm. Muatan

negatif yang kuat di bagian dalam kapiler bersama dengan diameter kapiler yang

kecil, memberikan area permukaan negatif bersih yang besar. Di bawah kondisi

elektroforesis, keadaan ini membuat aliran kation endosmotik yang kuat ke arah

katoda. Dalam sistem ini, tarikan aliran endosmotik ini lebih kuat daripada tarikan

anoda untuk protein anionik yang dievaluasi. Protein lalu bermigrasi ke arah

katoda, tetapi hambatannya bervariasi berdasarkan muatan negatif protein itu

sendiri. Medan listrik memisahkan protein berdasarkan muatan kemudian detektor

ultraviolet mengevaluasi absorbansinya pada panjang gelombang 200–215 nm

(dalam berbagai sistem) untuk menentukan konsentrasi protein. Metode

pengukuran ini memiliki kelemahan lain, yaitu zat yang diserap pada panjang

gelombang ini akan menghasilkan band yang menyerupai protein monoklonal

atau varian genetik. Pewarna radiokontras merupakan salah satu contoh penyebab

paling sering dari kelemahan sistem CZE ini.10,15,16

2.3.2 Capillary Isotachophoresis (CITP)

Capillary Isotachophoresis mirip dengan CZE yaitu pada ion yang dipisahkan

berdasarkan perbedaan mobilitas efektifnya di dalam medan listrik. Capillary

Isotachophoresis memiliki beberapa istilah antara lain elektroforesis batas

bergerak, elektroforesis perpindahan, iontophoresis, atau steady-state stacking.

Ion sampel diapit antara zona elektrolit utama yang mengandung ion dengan

mobilitas tertinggi, dan zona elektrolit tertinggal, yang mengandung ion dengan
 10

mobilitas terendah. Pada saat medan listrik diterapkan dalam kondisi diam,

serangkaian zona ionik ditetapkan dan diurutkan dari mobilitas ionik tertinggi

hingga mobilitas ionik terendah. Setelah kondisi diam tercapai, semua zona

bermigrasi bersama tanpa pelebaran band, berbeda dengan CZE di mana zona

terus terpisah satu sama lain dan meluas saat migrasi terjadi. Deteksi UV dengan

CITP bisa dilakukan secara efektif pada panjang gelombang 200 nm.10,15,16

2.3.3 Capillary Isoelectric Focusing (CIEF)

Capillary isoelectric focusing adalah satu-satunya cara pemisahan yang tidak

bergantung hanya pada mobilitas elektroforesis analit, tetapi analit dipisahkan

berdasarkan titik isoelektriknya (pl). Kapiler diisi dengan larutan buffer amfoter

(pembawa ampholit) menggunakan mode ini, lalu sampel dimasukkan ke dalam

kapiler, analit difokuskan oleh medan listrik, dan zona fokus dimobilisasi

melewati detektor secara kimiawi (mobilisasi elektroforesis) atau hidrodinamik

(mobilisasi tekanan). Hasil dari absorptivitas dari karier ampholit yang

menyediakan gradien pH dalam kapiler dibaca pada panjang gelombang 280

nm.10,15,16

2.3.4 Capillary Gel Electrophoresis (CGE)

Capillary Gel Electrophoresis hamper sama dengan CZE. Perbedaan utamanya

adalah bahwa pada CGE kolom dikemas dengan gel yang akan mempengaruhi

pergerakan dari analit. Pemisahan analit tidak hanya ditentukan oleh gaya

elektroforesis yang bekerja pada ion tetapi tergantung pada ukuran molekul dari
 11

analit itu sendiri. Aplikasi dari CGE ini adalah pemisahan protein dalam kapiler

yang diisi dengan gel poliakrilamida dan sodium dodecyl sulfate (SDS). Capillary

Gel Electrophoresis bermanfaat untuk molekul yeng memiliki mass/charge ratio

sama, tetapi ukuran yang berbeda.5,6,7

Mekanisme pemisahan utama dalam CGE didasarkan pada perbedaan ukuran

zat terlarut dimana analit bermigrasi melalui pori-pori kolom berisi gel. Gel

berpotensi berguna untuk pemisahan elektroforesis terutama karena

memungkinkan pemisahan berdasarkan "molecular sieving". Gel ini berfungsi

sebagai anti-convective media yang dapat meminimalkan difusi zat terlarut dan

dapat berkontribusi pada perluasan zona. Gel juga mencegah adsorpsi zat terlarut

ke dinding kapiler dan membantu menghilangkan elektroosmosis-nya. Gel harus

memiliki ciri-ciri tertentu, seperti stabilitas suhu dan kisaran ukuran pori yang

sesuai agar dapat dipakai sebagai media elektroforesis. Teknik ini memiliki

keterbatasan yaitu molekul netral tidak akan bermigrasi melalui gel, karena EOF

ditekan dalam mode ini.10,15,16

2.3.5 Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MEKC)

Mekanisme pemisahan utama pada MEKC berdasarkan pada partisi zat terlarut

antara fase misel dan fase solusi. Teknik ini dapat menyelesaikan masalah pada

molekul netral sama seperti molekul bermuatan oleh metoda EK. Bentuk misel

dalam larutan ketika surfaktan ditambahkan ke air dalam konsentrasi di atas

critical micelle concentration (cmc). Misel terdiri dari kumpulan molekul

surfaktan dengan lifetimes kurang dari 10 µs. Surfaktan yang paling umum
 12

digunakan dalam MEKC adalah sodium dodecyl sulfate (SDS) yang merupakan

surfaktan anionik. Meskipun misel anionik ini tertarik ke arah anoda, dalam

kapiler silika yang tidak dilapisi mereka masih bermigrasi menuju katoda karena

EOF. Misel bergerak menuju katoda pada kecepatan yang lebih lambat daripada

aliran cairan karena daya tarik ke arah anoda. Partisi molekul netral masuk dan

keluar misel berdasarkan pada hidrofobisitas setiap analit, oleh karena itu misel

MEKC sering disebut sebagai fase diam semu (atau bergerak). Molekul netral

yang sangat hidrofilik, misal metanol, tidak akan lama berada di dalam misel

karena pada dasarnya bermigrasi dengan kecepatan yang sama seperti aliran curah

dan elusi sebelumnya.11,14,15,17

2.4. Aplikasi Elektroforesis Kapiler

Banyak aplikasi EK dalam kimia klinik yang telah dieksplorasi dan

dikembangkan. Contoh penggunaan EK yaitu dalam analisis biomarker klinis

yang bisa berupa protein serum, enzim, peptida, karbohidrat, lipid, dan senyawa

organik atau anorganik kecil. Berikut akan dibahas mengenai kegunaan klinis

elektroforesis kapiler pada analisis protein serum dan cairan tubuh:

2.4.1. Analisis Protein

Diagnostik klinis banyak ditegakkan berdasarkan pada protein dalam serum,

urine, dan liquor cerebrospinalis (LCS). Berikut ini akan dibahas mengenai

analisis protein menggunakan EK:

 13

2.4.1.1 Protein Serum

Metode EK merupakan metode yang paling banyak sebagai validasi uji klinis

yang luas dalam analisis protein serum pada saat ini. Indikasi pertama yaitu EK

dapat digunakan dalam pemisahan protein serum menjadi enam band golongan

klasik, contohnya Albumin, Alpha-1 globulin, Alpha-2 globulin, Beta-1 dan Beta-

2 globulin, dan Gamma globulin. Variasi dalam fraksi protein ini dapat

dikorelasikan dengan status kesehatan pasien, biasanya perubahan yang terjadi

pada fraksi Beta dan Gamma yang paling bermakna secara klinis. Golongan band

monoklonal besar biasanya muncul pada pasien dengan multiple myeloma atau

penyakit Waldenstrom, namun konsentrasi yang lebih rendah mungkin terlihat

pada berbagai penyakit lain seperti light chain disease, leukemia, limfoma,

amiloidosis, atau Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance

(MGUS). Pada pasien yang termasuk dalam kategori MGUS harus ada tindak

lanjut setiap tahun karena ada kemungkinan pada pasien ini akan berkembang

menjadi mieloma atau penyakit limfoproliferatif lain. Skrining terhadap serum

telah dilakukan oleh elektroforesis selulosa asetat (ESA) atau elektroforesis gel

agarose (EGA) tetapi memerlukan banyak waktu dalam menerapkan metode ini

pada sampel, memfiksasi, mewarnai, mencuci gel untuk menghilangkan

pewarnaan yang berlebih, dan melakukan pemindaian densitometri. Oleh karena

metode ini membutuhkan sumber daya yang berjumlah banyak maka EK

dikembangkan agar pemeriksaan bisa berjalan secara otomasi.1,5

 14

Gambar 2.4 Elektroforesis Protein Serum

Dikutip dari Petersen1

2.4.1.2. Immunosubstraction Electrophoresis

Kuantifikasi dan typing pada pasien digunakan sebagai penanda untuk

membantu menentukan ketika keganasan telah terjadi atau digunakan untuk

pemantauan terapi. Metode yang paling umum untuk typing monoclonal

component (MC) adalah dengan immunoelectrophoresis (IEP) atau

immunofixation electrophoresis (IFE). Metode yang kompatibel dengan EK yang

dapat digunakan untuk typing MC dikembangkan dengan memodifikasi suatu

prosedur yang dilakukan oleh Aguzzi dan Poggi pada tahun 1977. Teknik ini

disebut Immunosubstraction Electrophoresis atau CE-IS. Metode ini meliputi

penghapusan protein spesifik dari suatu sampel menggunakan beads yang dilapisi

dengan anti-heavy chain (IgG, IgM, IgA) atau anti-light chain antibodi (Kappa
 15

atau Lambda) sebelum pemisahan kemudian dilakukan oleh EK. Identifikasi ini

berdasarkan pada imunosorbant mana yang akan menghilangkan MC.1

Deteksi oleh EK terkadang sulit dilakukan dikarenakan oleh pengendapan

cryoglobulin pada suhu lebih rendah dari 37ºC, namun inspeksi visual dari

electropherogram bersama dengan informasi klinis biasanya akan menunjukkan

adanya kelainan serum yang membutuhkan penelitian lebih lanjut. Keuntungan

yang dimiliki EK dibandingkan dengan EGA adalah EK mampu mendeteksi MC

dalam endapan cryoglobulin bahkan ketika hanya terdapat kadar protein yang

rendah di dalamnya. Jika kuantifikasi berdasar presipitat cryoglobulin diikuti oleh

redisolving, maka presipitat biasanya diperlukan sebelum melakukan analisis.

Pada masa akan datang diharapkan penggunaan CE-IS akan memberikan dokter

informasi tambahan tentang cryoglobulin lebih cepat dan dengan cara yang lebih

efektif.1,4,5

2.4.1.3. Protein Urine

Peningkatan ekskresi protein dalam urine (proteinuria) merupakan salah satu

kelainan yang paling umum terlihat pada laboratorium klinik dan dapat

disebabkan oleh berbagai macam kondisi patologis yang mempengaruhi ginjal

dan traktus urinarius. Karakterisasi protein oleh elektroforesis dapat membantu

dalam menentukan penyebab dari peningkatan protein urine, baik tubular atau

glomerular.

Salah satu masalah pada analisis protein urine oleh EK adalah bahwa banyak

senyawa yang muncul dalam urine yang dapat diabsorbsi pada panjang
 16

gelombang yang sama (200 atau 214 nm) yang digunakan untuk mendeteksi

protein sehingga menyebabkan masalah dalam interpretasi.1,5

2.4.1.4. Liquor Cerebrospinal

Analisis protein LCS bermanfaat dalam diagnosis dan manajemen berbagai

penyakit neurologis termasuk kondisi yang mengganggu respons imun, kerusakan

otak, atau gangguan pada sawar darah-otak. Proses imun dalam tubuh juga dapat

menghasilkan band poliklonal maupun oligoklonal pada regio gamma, dan jika

dikombinasikan dengan indeks IgG dapat membantu dalam membuat diagnosis

multipel sklerosis pada lebih dari 95% kasus. Oligoklonal band dapat juga muncul

pada pasien dengan berbagai kondisi neurologis lainya. Pada saat ini, metode yang

secara rutin digunakan di laboratorium klinik untuk mendeteksi profil protein

dalam LCS adalah EGA, yang membutuhkan banyak tenaga laboratorium dan

juga membutuhkan konsentrasi LCS untuk memvisualisasikan protein band. 1

2.4.1.5. Hemoglobin dan Variannya

Analisis hemoglobinopati dan thalassemia penting dalam diagnosis dan

manajemen lebih dari 600 defek kongenital hemoglobin (Hb) yang diketahui.

Analisis ini membutuhkan identifikasi dan kuantifikasi Hb abnormal bersama

dengan komponen Hb minor. Capillary zone electrophoresis dan CIEF

membantu dalam membuat diagnosis banding dari berbagai hemoglobinopati

seperti S/beta thalassemia, G-Philadelphia trait, S/C-Harlem, dll.4,5

 17

Capillary isoelectric focusing juga secara bersamaan dapat mendeteksi

konsentrasi varian Hb minor seperti Hb A2 dan Hb F, yang berguna dalam

diagnosis sindrom thalassemia dan juga dalam tindak lanjut jangka panjang pasien

sickle cell yang diterapi dengan hidroksilurea. Metode ini umumnya ditambah

dengan minicolumn ion exchange chromatography atau denaturasi alkali.

Capillary isoelectric focusing tidak memerlukan prosedur analitik lain dalam

evaluasi pasien dengan dugaan hemoglobinopati.1,13

Capillary isoelectric focusing juga dapat menilai kontrol glikemik melalui

pengukuran HbA1c, bentuk kimia termodifikasi (terglikasi) dari HbA dewasa

normal. Hasil HbA1c dapat bervariasi berdasar metode analisis yang berbeda,

maka program nasional dan internasional telah dikembangkan untuk

standardisasinya. Capillary isoelectric focusing juga dapat mengidentifikasi

produk oksidasi hemoglobin yang terbentuk selama penyimpanan yang tidak tepat

yang dapat membuat bias pada hasil HbA1c. Salah satu manfaat dari penggunaan

CIEF untuk mendeteksi HbA1c adalah instrumen dan reagen yang sama dengan

yang digunakan untuk memisahkan varian hemoglobin. 1

Gambar 2.5 Varian Hb Abnormal yang Umum

Dikutip dari Jenkins14
 18

2.5. Perbandingan dengan Teknik Pemisahan Lainnya

Elektroforesis kapiler sering dibandingkan dengan HPLC dan elektroforesis

gel konvensional. Perbandingan yang dibahas di sini dimaksudkan sebagai

indikator bidang-bidang yang diusahakan untuk mencapai perkembangan masa

depan yang signifikan untuk EK. 1

2.5.1 Perbandingan dengan HPLC

Alasan utama efisiensi tinggi pada EK disebabkan oleh flat flow profile nya

yang khas. Pada Gambar 2.5, dapat dilihat mengenai flow profile pada HPLC dan

EK. Secara umum flow dari mobile phase pada HPLC diatur oleh pompa maka

dalam kondisi operasi normal akan terlihat parabolic flow profile. Hasil dari

kontribusinya pada pelebaran puncak, flow profile secara inheren membatasi

efisiensi dari pemisahan yang secara teoritis dapat dicapai pada pemisahan HPLC.

Pada elektroforesis kapiler, molekul yang memiliki muatan akan bermigrasi di

bawah pengaruh dari tegangan yang diberikan oleh sumber daya, kemudian akan

menghasilkan flat flow profile. Perbedaan mendasar flow profile ini adalah alasan

utama untuk efisiensi yang sangat tinggi yang dapat dicapai jika menggunakan

EK, di mana puncak yang lebih sempit dan resolusi yang berpotensi lebih baik

bias diperoleh, terutama bila selektivitas juga dioptimalkan untuk pemisahan.

Gambar 2.6 Flow Profile pada HPLC dan CZE

Dikutip dari Li16
 19

Terdapat beberapa stationary phase dan mobile phase yang dikembangkan

pada HPLC agar mendapatkan selektifitas yang diperlukan untuk pemisahan yang

khusus, sedangkan teknik pada EK relatif kurang berkembang. Namun banyak

penelitian dilakukan untuk meningkatkan selektifitas dalam pemisahan EK,

seperti penggunaan misel dalam MCEK, penggunaan inclusion atau complexing

agents, misalnya siklodekstrin, dan penggunaan organic modifiers, seperti

metanol.3

Dalam hal instrumentasi, HPLC dan EK sama dalam beberapa hal tetapi

berbeda pada hal lainnya. Elektroforesis kapiler lebih sederhana karena tidak

adanya injektor, pompa (satu atau lebih pompa dan pencampur pelarut untuk

gradien HPLC) dan sel deteksi khusus. Injeksi EK biasanya menggunakan salah

satu ujung kolom pemisah, dan deteksi pada kolom dilakukan dengan bagian

kolom yang membentuk sel deteksi.3,4

Pengenalan sampel pada HPLC biasanya dilakukan dengan memasukkan

volume sampel yang diketahui ke dalam loop sampel volume tetap dalam katup

injeksi dengan jarum suntik. Sampel yang diinjeksikan kemudian dialirkan ke

dalam kolom kromatografi oleh mobile phase sehingga volume dari larutan yang

disuntikkan dapat diukur dengan tepat.

Pada Elektroforesis kapiler tidak terdapat katup injeksi seperti pada HPLC.

Larutan sampel biasanya dimasukkan ke dalam kapiler baik dengan mode

elektrokinetik atau hidrodinamik. Jumlah sampel yang dimasukkan akan

dipengaruhi oleh tegangan injeksi yang diterapkan dan juga lamanya tegangan

yang diberikan dengan menggunakan mode elektrokinetik, sedangkan jumlah

 20

injeksi dipengaruhi oleh perbedaan tekanan yang melintasi kolom dan lamanya

injeksi dengan menggunakan mode hidrodinamik. Pada kedua mode injeksi ini

perlu mengetahui ukuran yang tepat dari dimensi kolom (radius dan panjang)

untuk menghitung jumlah yang diinjeksikan. 3,15,16

2.5.2 Perbandingan dengan Slab Gel Electrophoresis

Elektroforesis kapiler memiliki beberapa keunggulan dibandingkan slab gel

elektrophoresis konvensional. Keterbatasan pada elektroforesis konvensional

adalah pemanasan larutan karena arus ionik yang dibawa diantara elektroda. Joule

heating dapat menghasilkan gradien kepadatan dan konveksi berikutnya dan

gradien suhu yang dapat meningkatkan perluasan zona, yang mempengaruhi

mobilitas elektroforesis, dan dapat menyebabkan penguapan pelarut. Dalam

elektroforesis skala besar, media pendukung seperti gel digunakan untuk

membantu menghilangkan panas, sehingga meminimalisasi sumber pelebaran

band ini. Satu keuntungan utama dari tabung kapiler adalah menghilangnya panas

relatif yang ditingkatkan dengan volume larutan di dalam tabung. Pada

Elektroforesis kapiler pembuangan panas ditempatkan melalui dinding kapiler.

Rasio yang dimaksimalkan dari luas permukaan bagian dalam menjadi volume

yang dicapai dalam kapiler lubang kecil memberikan pembuangan panas yang

lebih efisien relatif terhadap sistem skala besar. Hal ini memungkinkan

penggunaan lapangan potensial yang sangat tinggi dan solusi untuk pemisahan

yang cepat dan efisien.3,4,5

 21

Terdapat beberapa keuntungan lain dari penggunaan kapiler untuk

elektroforesis. Salah satunya adalah kemungkinan untuk memanfaatkan EOF pada

sistem EK untuk memfasilitasi otomasi. Electroosmotic flow ini bisa dirubah

sehingga cukup kuat untuk menyebabkan semua zat terlarut terelusi di satu ujung

dari kapiler. Oleh karena itu EK lebih mudah diotomasi daripada elektroforesis

konvensional yang cenderung padat karya dan memakan waktu. Keuntungan lain

dari EK adalah ketersediaan berbagai instrumen yang sudah ada dikembangkan

untuk HPLC yang dapat dengan mudah diadaptasi pada EK. Misalnya, di area

deteksi, banyak jenis mode deteksi untuk HPLC telah ada yang berhasil

dimodifikasi untuk deteksi pada EK. Laju aliran volume sangat kecil biasanya

diperoleh di EK dan kemungkinan analisis izin deteksi di kolom untuk dilakukan

pada sampel dalam jumlah yang sangat kecil (nanoliter per proses). Jumlah

sampel yang jauh lebih besar akan dibutuhkan pada gel konvensional

elektroforesis.3,15,16

2.6 Eletroforesis Kapiler di Instalasi Laboratorium Klinik Rumah Sakit

Hasan Sadikin

MINICAP merupakan metode elektroforesis kapiler tipe di antara Zone

Electrophoresis klasik dan liquid chromatography.20

 22

Gambar 2.7 MINICAP capillary electrophoresis

Metode yang digunakan:

Yaitu elektroforesis kapiler di dalam larutan bebas, molekul yang diberi

muatan dipisahkan berdasarkan mobilitas elektroforesis dalam larutan buffer basa

dengan pH spesifik di dalam tabung kapiler silika dengan diameter 100 µm.

Pemisahan juga berdasarkan pH elektrolit dan electroosmotic flow

Hasil elektroforesis:

Urutan hasil sebagai berikut: gamma globulin, beta-2 globulin, beta-1 globulin,

alpha-2 globulin, alpha-1 globulin dan albumin.

 23

Gambar 2.8 Hasil MINICAP capillary electrophoresis

Bahan pemeriksaan:

 Serum segar

 Sampel dapat disimpan pada suhu 2-8 ºC (10 hari)

 Beku/frozen (1bulan)

 Transportasi sampel stabil pada suhu kamar sampai dengan 5 hari, namun

sebaiknya pada suhu 2-8 ºC

Bahan pemeriksaan yang tidak boleh digunakan:

1. Hemolisis
 24

Hemolisis dapat menyebabkan zona alpha-2 globulin menjadi ganda

2. Serum yang “tua” atau tidak disimpan sesuai persyaratan menyebabkan

Beta-2 globulin rendah palsu

3. Plasma

Fibrinogen akan bergerak pada posisi beta-2 globulin

Hasil:

Profil elektroforesis terbalik dengan urutan migrasinya, maka hasil menjadi

albumin, alpha-1 globulin, alpha-2 globulin, beta-1 globulin, beta-2 globulin dan

gamma globulin.

Tabel 2.2 Nilai Rujukan MINICAP Capillary Electrophoresis

Albumin 55,8-66,1 %
Alpha-1 2.9-4.9 %
Alpha-2 7,1-11,8 %
Beta globulin 8,4-13,1 %
Beta-1 4,7-7,2 %
Beta-2 3,2-6,5 %
Gamma globulin 11,1-18,8 %
Dari 246 Subjek sehat, dewasa, pria dan wanita

Faktor Pengganggu

Lipoprotein/trigliserida atau pigmen bilier (dengan karakteristik warna serum

kuning-hijau) pada konsentrasi yang tinggi dalam sampel dapat menyebabkan

kesan bisalbuminemia pada pola elektroforesis. Beberapa komponen monoklonal

 25

mungkin tidak dapat dideteksi dengan metode ini karena resolusi dan sensitivitas

dari zone electrophoresis. Komponen monoklonal mungkin tidak terdeteksi

(misal: polymerized immunoglobulin tersebar atau tersembunyi di balik

poliklonal). Sebaliknya, sedikit distorsi pola elektroforesis dapat menunjukkan

adanya imunoglobulin monoklonal. Dalam semua kasus, diagnosis klinis harus

dianalisis terlebih dahulu dan jika dicurigai adanya gammopathy, maka dianjurkan

untuk melakukan analisis imunotyping pada sampel.20

BAB III

RINGKASAN

Elektroforesis kapiler banyak memiliki banyak peran dalam sehari-hari, seperti

analisis matriks biologis yang kompleks, pemantauan obat-obatan, menguji

kapasitas pengikatannya ke protein atau miniaturisasi penentuan aktivitas enzim.1,4

Elektroforesis kapiler adalah teknik yang sensitif dan serbaguna dan

merupakan metode yang murah dibanding HPLC dan slab gel electrophoresis dan
 26

praktis untuk penentuan banyak analit yang penting secara klinis. Pada awalnya

EK memiliki kelebihan kecepatan dan kemampuan volume sampel yang rendah,

kemampuannya untuk menjadi kuantitatif dan otomatisasi, serta kemampuan

untuk memisahkan senyawa yang sulit ditangani dengan metode konvensional,

tapi ternyata EK ini juga juga memungkinkan untuk menggunakan satu instrumen

untuk beberapa tujuan, seperti serum, urine, dan protein LCS, hemoglobin (varian

dan A1c). Keuntungan utama dari EK adalah kemampuannya untuk memeriksa

spesimen dalam jumlah besar dengan sedikit waktu dan biaya yang relatif rendah

per tes.1,4

25
SUMMARY

Capillary electrophoresis (CE) has many roles in clinical lab sevice, such as

the analysis of complex biological matrices, monitoring of drugs, testing their

binding capacity to proteins or enzyme activity determinations.1,4

Capillary electrophoresis is a sensitive and technique and is an inexpensive

and practical method for the determination of many analytes of clinical

 27

importance. Initially CE was heralded for its speed and low sample volume

capability, its ability to be quantitative and automated, and its ability to separate

compounds difficult to handle with traditional methods. Capillary electrophoresis

also makes it possible to use one instrument for several purposes, such as serum,

urine, and CSF proteins, hemoglobin (variants and A1c), lipoproteins, and CDT.

The main advantage of EK is its ability to screen large numbers of specimens in

very little direct time at a relatively low cost per test.1,4

26
PUSTAKA ACUAN

1. Petersen JR, Okorodudu AO, Mohammad A, Payne DA. Capillary

electrophoresis and its application in the clinical laboratory. Clinica
Chimica Acta. 2003 Apr;330(1–2):1–30.
2. Dülffer T, Herb R, Herrmann H, Kobold U. Capillary electrophoresis.
Basic considerations for industrial applications. Chromatographia. 1990
Dec;30(11–12):675–85.
3. McCudden CR, Mathews SP, Hainsworth SA, Chapman JF, Hammett-
Stabler CA, Willis MS, et al. Performance Comparison of Capillary and
Agarose Gel Electrophoresis for the Identification and Characterization of
Monoclonal Immunoglobulins. Am J Clin Pathol. 2008 Mar;129(3):451–8.
 28

4. Hage DS. An Overview of CE in Clinical Analysis. In: Phillips TM,

editor. Clinical Applications of Capillary Electrophoresis. New York, NY:
Springer New York; 2019 [cited 2020 Aug 16]. p. 3–11. (Methods in
Molecular Biology; vol. 1972).
5. Altria KD. Overview of capillary electrophoresis and capillary
electrochromatography. Journal of Chromatography A. 1999 Sep;856(1–
2):443–63.
6. Reijenga JC. Capillary electrophoresis: An overview. Journal of
Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Articles. 1992 Nov;163(1):155–
67.
7. Claire RLS. Capillary Electrophoresis. 1996: 68, 569-586.
8. Schwer Ch, Kenndler E. Capillary electrophoresis. Chromatographia. 1990
Nov;30(9–10):546–54.
9. McPherson RA, Pincus MR. Henry’s Clinical Diagnosis and Management
by Laboratory Methods. 2017:1823.
10. Rifai N, Horvath AR, Wittwer C, editors. Tietz textbook of clinical
chemistry and molecular diagnostics. St. Louis, Missouri: Elsevier; 2018.
1867 p.
11. Landers JP. Clinical capillary electrophoresis. Clinical Chemistry. 1995
Apr 1;41(4):495–509.
12. Sastre Toraño J, Ramautar R, de Jong G. Advances in capillary
electrophoresis for the life sciences. Journal of Chromatography B. 2019
Jun;1118–1119:116–36
13. Shihabi ZK. Clinical Applications
3527
of Capillary Electrophoresis.
CLINICAL APPLICATIONS OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS.
1992:8.
14. Jenkins MA. Clinical Applications of Capillary Electrophoresis: Status at
the New Millennium. MB. 2000;15(3):201–10.
15. Petersen JR, Mohammad AA, editors. Clinical and forensic applications of
capillary electrophoresis. Totowa, N.J: Humana Press; 2001. 453 p.
(Pathology and laboratory medicine)
16. Li SFY. Capillary electrophoresis: principles, practice, and applications.
Amsterdam ; New York: Elsevier; 1992. 582 p. (Journal of
chromatography library).
17. Burtis CA. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry and Molecular
Diagnostics. 2015:1102.
 29

18. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE, editors. Clinical chemistry: principles,
techniques, and correlations. Eighth edition. Philadelphia: Wolters
Kluwer; 2018. 736 p

19. Keren DF. Protein electrophoresis in clinical diagnosis. London: Arnold;

2003.
20. Sebia. MINICAP protein(E)6. 2013. Sebia Instruction: 8-14.