Nama : Fadria Anuz

Nim : 431417032
Kelas : B pendidikan Biologi
Tugas : Bioteknologi (PCR dan Elektroforesis)

A. Pengertian Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada
pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik
isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk,
ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (TITRAWANI 1996).
Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan
listrik yang dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan
pada suatu medium penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen-
komponen protein tersebut akan mulai bermigrasi (RICARDSON dkk. 1986).
Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ion atau partikel koloid
berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa
larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik (Harvey 2000). Secara
teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel
yang bermuatan akibat diberikan arus listrik searah. Secara umum, elektroforesis
digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.
Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan
partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik.
Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam
mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan
medium yang sesuai. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika
molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian
dialiri arus listrik dari suatu kutubke kutub yang berlawanan muatannya maka
molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Media
penunjang yang biasa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan
kertas sellulose poliasetat. Adapaun menurut SARGENT & GEORGE (1975)
elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model
yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model
horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang
digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu
dapat menghasilkan pemisahan yang lebih baik. Cara kerja terdiri dari beberapa
tahap yaitu: 1. ekstraksi enzim, 2. pembuatan gel pati, 3. penempatan sampel, 4.
proses elektroforesis, 5. visualisasi sistem enzim, 6. observasi gel dan 7. Metode
analisis.
B. Prinsip kerja Elektrofoesis
Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen
bermuatan positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-)
pada kutub positif (+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik" . Hasil
yang didapat kandari elektroforesis adalah elektroforegram yang memberikan
informasi mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut
kecepatan migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan pada proses
kromatografi.

Gambar Skema Elektroforesis

Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa komponen yang bermuatan
positifakan bergerak searah dengan medan listrik menuju kutub negatif. Apabila
dalam campuran terdapat dua jenis komponen, yakni (1) komponen negatif (-),
dan (2)komponen netral (N), maka komponen negatif akan bergerak menuju
kutub positif (+) sedangkan komponen netral (N) akan tetap diam. Skema alat
elektroforesis secara sederhana dapat dilihat pada gambar diatas. Pada gambar
tersebut dapat dilihat komponen yang bermuatan positif akan mengalir kearah
kutub negatif, sedangkan komponen bermuatan negatif akan mengalir kearah
kutub positif.
C. Macam elektroforesis
1. Elektroforesis kertas
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari
kertas sebagai fasediam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase
gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat
adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan
partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zatterlarut, luas
 penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatanion,
pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

2. Elektroforesis gel

Elektroforesis
gel ialah elektroforesis
yang menggunakan
gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-
molekul. Awalnya
elektoforesis gel dilakukan
dengan medium gel kanji
(sebagai fase diam) untuk
memisahkan biomolekul yang lebih besarseperti protein-protein. Kemudian
elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida
sebagai gel media. Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang
disebut fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring"
objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang
akan dipisah. Seringkali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk
menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif
diletakkan pada masing-masing ujungaparat elektroforesis gel. Zat yang akan
dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda negatif.
Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objekakan bergerak
dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini
berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi- kisi gel
berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih
lambat berpindah.

Gambar Prosedur Kerja Elektroforesis Gel

3. Elektroforesis kapiler
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan
untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida
dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.
Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940 untuk
aplikasi dalam berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan,
dan analisis farmasi. Elektroforesis kapiler menggunakan listrik
bertegangan tinggi yang menyebabkan semua komponen ion atau molekul
netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik
pendeteksian spektrometri atau elektrokimia. Teknik pemisahan ini
 dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dandiameter
pipa kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan
selektivitas yang baik namun boros listrik karena menggunakan tegangan
tinggidan alatnya juga mahal.

Elektroforesis kapiler (CE), juga dikenal sebagai zona elektroforesis

kapiler, dapat digunakan untuk memisahkan spesies ion oleh muatan mereka dan
gesekan kekuatan dan radius hidrodinamika. Elektroforesis , bermuatan listrik
bergerak analit dalam konduktif cairan menengah bawah pengaruh suatu medan
listrik . Diperkenalkan pada tahun 1960-an, teknik elektroforesis kapiler
(CE) dirancang untuk spesies terpisah berdasarkan ukuran mereka untuk
mengisi rasio dalam interior sebuah kapiler kecil penuh dengan elektrolit.

D. Medium pendukung
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung
untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang
digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang
banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga
dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung
yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu campuran
dapat terjadi efektif dalam zona tertentu. Meskipun medium pendukung relatif
stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi
elektron (elektro osmosis) atau penyaringan
berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi
kecepatan gerak senyawa.
1. Cellulose asetat
2. Larutan Buffer
Buffer Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium
pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa
karena beberapa hal, yaitu :
a. Komposisi
b. Kosentrasi
c. Ph
3. Medan elektrik
Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan
oleh tahanan dalam medium.
Berdasarkan bentuk alat, elektroforesis dibagi menjadi dua:
1. Elektroforesis Planar
2. Elektroforesis Kolom
 Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena
elektrokinetik, juga dapat disebabkan karena adanya filtrasi, yakni
interaksi dengan fasa diam. Pemisahan yang disebabkan karena interaksi
tersebut tidak disebut elektroforesis, melainkan "elektrokromatografi".
Arus yang digunakan pada elektroforesis adalaharus DC dengan nilai
tegangan kurang dari 1000 volt. Apabila digunakan lebih dari 1000 volt
maka akan terjadi efek pemanasan pada media gel. Efek pemanasan
disebabkan karena adanya tumbukan partikel elektron. Efek pemanasan
dapat dihilangkan dengan dua cara yakni :
1. Pendinginan
2. Efek konveksi
Efek konveksi adalah suatu cara untuk membebaskan panas dengan
mengganti bentuk planar menjadi bentuk kolom atau kapiler.

E. Manfaat elektroforesis
Elektroforesis gel secara luas digunakan untuk memperkirakan ukuran
fragmen DNA. Misalnya dalam pemetaan pembatasan DNA kloning. Metode ini
juga digunakan dalam diagnosis genetika molekuler atau sidik jari genetik melalui
analisis PCR. Elektroforesis gel agarosa juga digunakan untuk menyelesaikan
DNA melingkar dengan perbedaan superkoil topologi, dan untuk menyelesaikan
fragmen yang berbeda karena sintesis DNA. Selain menyediakan media yang
tepat untuk analisis ukuran fragmen, gel memungkinkan pemurnian fragmen
DNA.

A. Pengertian PCR
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain
Reaction (PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk
melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini
dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini
sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan
analisis genetik. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan
untuk melipatgandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih
lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan
kuantitas molekul mRNA. Dengan menggunakan metode PCR dapat
meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah
semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang
 diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. DNA cetakan yang
digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR
dapat digunakan untuk melipat gandakan suatu sekuens DNA dalam genom
bakteri. PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase
adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens
tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang
menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA.
B. Tahapan-tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Proses PCR terdiri dari tiga tahapan, yaitu denaturasi DNA templat,
penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA.
Denaturasi merupakan proses pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas
tunggal DNA yang menjadi cetakan (templat) sebagai tempat penempelan
primer dan tempat kerja DNA polimerase, dengan pemanasan singkat pada
suhu 90-95°C selama beberapa menit.
1. Denaturasi.
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua
untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi
menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang
komplemen.Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya
reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya.Denaturasi biasanya
dilakukan antara suhu 900C – 950C.
2. Penempelan Primer.
Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah
yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada proses annealing
ini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen
pada templat. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50 0C – 600C.
Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen
tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila
dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya misalnya pada 720C.
3. Reaksi Polimerisasi (Extension)
Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada
suhu 720C. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan
pada sisi 3” nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat
oleh DNA polimerase. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah
yang dibatasi oleh dua primer akan di amplifikasi secara eksponensial
(disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy
yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x
adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA
sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah
2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya.
 Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan
menggunakan enzim Taq DNA polimerase pada akhir dari setiap siklus akan
menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3‟ dari potongan
DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning
dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-
ujung 5‟-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebut
thermocycler.
Selain ketiga proses tersebut, secara umum PCR didahului dan diakhiri
oleh tahapan berikut:
1. Pradenaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan
kesempurnaan denaturasi dan mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start
alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).
2. Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-720C) selama 5-15
menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah
diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR
terakhir.
C. Komponen-Komponen Polymerase Chain Reaction (PCR)
Beberapa komponen-komponen PCR antara lain:
1. Enzim DNA Polymerase
Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow fragment
DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini ternyata tidak
aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga peneliti harus
menambahkan enzim di setiap siklusnya. Selain itu, enzim ini hanya bisa
dipakai untuk perpanjangan 200 bp dan hasilnya menjadi kurang
spesifik.Untuk mengatasi kekurangan tersebut, dalam perkembangannya
kemudian dipakai enzim Taq DNA polymerase yang memiliki keaktifan pada
suhu tinggi. Oleh karenanya, penambahan enzim tidak perlu dilakukan di
setiap siklusnya, dan proses PCR dapat dilakukan dalam satu mesin.
2. Primer
Primer merupakan oligonukleotida pendek rantai tunggal yang
mempunyai urutan synthesizer. komplemen dengan DNA templat yang
akan diperbanyak. Panjang primer berkisar antara 20-30 basa.Untuk
merancang urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan
akhir DNA target.Primer oligonukleotida disintesis menggunakan suatu
alat yang disebut DNA.
 3. Reagen lainnya
Selain enzim dan primer, terdapat juga komponen lain yang ikut
menentukan keberhasilan reaksi PCR. Komponen tersebut adalah dNTP
untuk reaksi polimerisasi, dan buffer yang mengandung MgCl2.
Konsentrasi ion Mg2+dalam campuran reaksi merupakan hal yang sangat
kritis. Konsentrasi ion Mg2+ ini sangat mempengaruhi proses primer
annealing, denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim dan fidelitas
reaksi.
D. Manfaat Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reaction (PCR Polymerase Chain) dapat digunakan untuk Amplifikasi
urutan nukleotida. Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang
mengalami mutasi. Bidang kedokteran forensik. Melacak asal-usul sesorang
dengan membandingkan “finger print”. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas
untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:
1. Isolasi Gen.
Para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi.
Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari
pancreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses
yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena
insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen
penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel
bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin.
Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh
manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat,
mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus
„mengorbankan‟ sapi atau babi. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA
pencari atau dikenal dengan nama „probe‟ yang memiliki urutan basa
nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat
dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
2. DNA Sequencing.
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA
Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger
(chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-
dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan
pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR
biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide
yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa
berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa
ditentukan.
3. Identifikasi Forensik.
Seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban),
atau korban kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan.Jika identifikasi
secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA
adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh
manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi
bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA sidik
jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya dibandingkan
dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah,
misalnya ibu atau bapak kandung.Jika memiliki kecocokan yang sangat
tinggi maka bisa dipastikan identitas orang yang dimaksud.
4. Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi
sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi.
Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan
akurat.PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini
memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut
akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan
ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau
makhluk lainnya