ELEKTROFORESIS

Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel atau spesies atau ion atau partikel
koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa larutan
buffer, sebagai respon adanya suatu medan listrik (Harvey, 2000). Secara teknis elektroforesis
merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus
listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya teknik dari cikal-bakal elektroforesis
digunakan untuk menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik, 2004). Teknik elektroforesis
ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju
pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik (Rouessac, 2007). Buffer elektroda
digunakan untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi diantara 2 elektroda
sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik (Skoog, 2002).

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.

Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan
dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negative
dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negative ke kutub
positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap masanya serta
tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz,
yang berkaitan dengan sifat sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris
lingkungan.

Metode elektroforesis mulai berkembang pada akhir abad ke-19 setelah ditemukan
penelitian yang menunjukan adanya efek dari listri terhadap partikel-partikel atau molekul-
molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein
(PORNET,KUINCKE,HARDY). Dalam Richardson dkk (1988) elektroforesis berasal dari
Bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik.
Metode elektroforesis merupakan pengembangan di bidang biologi molekuler. Metode ini telah
digunakan didalam teknik Analisa untuk penelitian-penelitian di bidang biologi dan genetika. Di
bidang ilmu biologi ataupun biologi molekuler metode elektroforesis banyak digunakan untuk
taksonomi,sistematik dan genetic dari hewan maupun tumbuhan. Metode elektroforesis baru
benar-benar dipakai oleh para peneliti genetic di tahun 1957 setelah HUNTER & MOLLER
mempunyai ide penelitian dengan menggunakan sifat-sifat enzim sebagai katalisator untuk
memeperlihatkan keberadaannya secara kimia histologi (zona elektroforesis) (PASTEUR dkk.
1998).

Definis Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan
molekul-molekul protein bermuatan didalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul
dalam medan listrik dipengaruh oleh bentuk,ukuran,besar muatan dan sifat kimia dari molekul
(Tirtawani, 1996). Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan
muatan listrik yang dikandung oleh makromolekul tersebut. Menurut Stenesh teknik
elektroforesis dapat dibedakan menjadi du acara yaitu : Elektroforesis larutan (Moving boundary
electrophoresis) dan Elektroforesis daerah (Zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis
larutan, yang mengandung makromolekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri
arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya
pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis
daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media penunjang yang
berisi (diberi) larutan penyangga.

Media penunjang yang bisa dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliagrilamida dan
kertas sellulose poliasetat. Adapun menurut SARGENT & GEORGE (1975) elektroforesis
daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertical.
Metode yang biasa dilakukan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan
yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim
tertentun dapat dihasilkan pemisahan yang lebih baik.

Kegunakan Metode Elektroforesis

Telah disebutkan diatas bahwa pola protein tertentu dari satu spesies hewan berbeda,
secara elektroforesis akan memperhatikan pola protein yang berbeda pula pada hewan lainnya.
Faktor tersebutlah yang menyebabkan pola protein dapat digunakan untuk membedakan spesies
hewan. Perbedaan pola protein inilah yang sering kali digunakan sebab untuk menbedakan
populasi secara tepat kadangkala tidak dapat dilakukan apabila hanya menggunakan pengamatan
melalui morfologi saja. Fenomena ini pula yang menyebabkan metode Elektroforesis banyak
digunakan untuk pengamatan taksonomi dan sistematik serta untuk mengidentifikasi spesies
hewan maupun tumbuhan (bio-sistematik). Dapat pula digunakan untuk melihat phylogenetic
reconstruction (rekonstruksi secara filogenetik) dari suatu jenis hewan ataupun tumbuhan.

Teknik Elektroforesis

1. IMUNOELEKTROFORESIS
Untuk mendeterminasi konsentrasi antigen
2. ISATOCHOPORESIS
Untuk memisahkan molekul-molekul hanya berdasarkan jumlah muatan bukan
berdasarkan ukuran molekul
3. ELEKTRODENTASI
Untuk memurnikan koloida. Prinsip: jika larutan kolidal dialiri arus listrik, maka terjadi
pemisahan menjadi dua bagian, satu diantaranya koloida. Dua lapisan dapat terpisah
dibedakan dari warna atau refraksi indeknya. Aplikasi: untuk memurnikan hemoglobin
dan serum albumin.
Jenis-jenis Elektroforesis dan Cara kerja

1. Elektroforesis Kertas

Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal
tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu,
tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi
melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian
menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Ternyata mereka menggunakan
suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya
yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui
pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu dinamakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat
dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga
(buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik
dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.

Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi
menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul
RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-
monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan
mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis
komponen tersebut terpisah-pisah, sehingga dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap
komponen tersebut.
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan
partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat
adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas
tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan,
konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.

2. Elektroforesis Gel

Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar.
Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat
digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan
menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji
tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam
(stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu. Ternyata
elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan
kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer
akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya
menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.

Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian
ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk
melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan
campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis
makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk
memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA
kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.
  Adapun prosedur kerja dalam melakukan elektroforesis DNA menggunakan teknik
elektroforesis gel agarosa sebagai berikut :

Bahan dan Alat :

1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII

2. Sampel DNA, misalnya :

3. DNA kromosom bakteri,

4. DNA plasmid hasil isolasi (uncut)

5. DNA plasmid hasil restriksi (cut)

6. Agarosa

7. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH
8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)

8. Akuades

9. Gelas Ukur 1000 ml

10. Labu Erlenmeyer 50 ml

11. Tabung mikrosentrifuga

12. Sarung tangan

13. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

14. Kertas parafilm

15. seperangkat alat elektroforesis

16. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000;
EDTA 120 mM)

17. larutan Etidium Bromid (EtBr)

18. UV transluminator
19. Kaca mata UV

20. kamera digital

Cara Kerja

1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245
ml akuades.

2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer
TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna.

3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa
selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki)

4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir
menyentuh dasar baki

5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya
sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN
KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik).

6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel
agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.

7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.

8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi
dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE).

9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.

10. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan
cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm
menggunakan mikropipet.

11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan.
12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang
tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi
baki/gel ke arah sebaliknya).

13. nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan
45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.

14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber
arus.

15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh
adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis.

16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas
UV transluminator).

17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.

Hasil

Pita-pita DNA hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Perkirakan
ukuran masing-masing fragmen/pita dengan membandingkannya dengan posisi migrasi pada
DNA marker. Metode ini didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media
penyangga matriks stabil, di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan
adalah sel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan
fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal,
sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertical.
Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan DNA (sekuensing).

Larutan yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel
agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan
buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutub positif. Laju migrasi DNA dalam medan
listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran
panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat
dibandingkan yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA
berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida
yang akan masuk diantara ikatan hydrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan
kelihatan dibawah lammpu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya
dengan pita DNA standar.

Karena pita-pita atau puncak-puncak protein terlalu rapat cenderung saling tumpah-tindih,
metode pemisahan satu dimensi, seperti elektroforesis gel poliakrilamida SDS atau kromatografi,
hanya mampu menguraikan protein dalam jumlah yang relatif kecil (umumnya kurang dari 50).
Sehingga digunakan elektroforesis gel dua dimensi yang menggabungkan dua prosedur
pemisahan yang berbeda. metode ini dapat menguraikan lebih dari 1000 macam protein melalui
pemetaan dua dimensi.

3. Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)

Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor memberitahukan ide cerdasnya untuk memisahkan
campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakan Pulse-field
Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik
tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli
biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada
patogen.

Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang
biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium
biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis,
DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan,
sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis selain
dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada
teknik elektroforesis ini.

Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :

1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki
karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah
kasus.
2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.

3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

4. Kelebihan Teknik Elektroforesis

a. Mudah untuk molekul besar dan bermuatan.Mudah untuk molekul besar dan bermuatan.

b.Dapat digabungkan dengan kromatografi(Lempeng tipis).

c.Lebih cepat dari kromatografi biasa.

d. Alat dan teknik sederhana.

Kelemahan Teknik Elektroforesis

a.Sulit untuk analisis kuantitatif, kecuali denga.EF tidak berpendukung.

b.Sukar mendeteksi konsentrasi rendah.

c.Sukar untuk senyawa tidak bermuatan.