Gel Elektroforesis dan

Capillary Elektroforesis
Minggu 14
CPMK
Mahasiswa dengan memanfaatkan teknologi informasi menelusuri literatur atau
informasi yang sesuai dengan permasalahan.

Indikator
Mahasiswa dapat menjelaskan dengan benar pengertian gel elektroforesis dan
Capillary Zone Elektroforesis (CZE) dan mekanisme pemisahannya
Gel Electrophoresis
Pengertian
● Elektroforesis merupakan proses untuk memisahkan molekul bermuatan pada media pembantu
berdasarkan pergerakan mereka melalui suatu fluida dalam pengaruh medan listrik.
● Setiap spesi muatan bergerak berdasarkan fungsi muatan, ukuran, dan bentuk.
● Media pembantu direndam dalam larutan elektrolit pembawa yang mempertahankan pH dan
menyediakan konduktivitas yang cukup untuk mengalirkan ion atau molekul yang dipisahkan.
Pengertian
Setiap analit akan terpisah membentuk zona masing-masing.
Prosedur

1. Menuangkan gel
2. Mengaplikasikan sampel
3. Menjalankan pemisahan
4. Merendam gel dalam reagen
pendeteksi
5. Melakukan foto terhadap gel atau
menggunakan gel scanner
Media Pembantu
1. Paper strips
2. Cellulose Acetate
3. Gel agarosa
4. Gel poliakrilamid (PAGE)
Paper Strips
● Media pembantu yang pertama kali dikembangkan adalah kertas saring yang
dijenuhkan dengan larutan buffer
● Material kertas yang digunakan adalah minimal 96% selulosa
Cellulose Acetate
● Penggunaan media ini memberikan
resolusi yang lebih tajam dan waktu
yang lebih singkat
● Jika menggunakan media ini,
cellulose acetate harus diletakkan
pada permukaan buffer, bukan
direndam karena cenderung
menghasilkan gelembung udara.
Gel Agarosa
● Penggunaan agarosa membuat arus yang diaplikasikan bisa lebih tinggi dari dua media
sebelumnya. Namun demikian, keuntungan paling utama penggunaan agarosa adalah penyaringan
akibat pori yang dimilikinya.
● Selain itu, efek adsorpsi dapat diabaikan dan kandungan muatan rendah sehingga mengurangi
terjadinya osmosis.
● Kekurangan penggunaan gel agarosa adalah menimbulkan difusi, yang mana fenomena tersebut
menghambat elektroforesis.
Gel Poliakrilamid (PAGE)
● Gel ini lebih fleksibel, kuat, dan mudah ditangani dibanding gel lain.
● Elektro-osmosis dan difusi pada gel dapat diabaikan,
● Buffer bervariasi dapat digunakan,
● gel bersifat non-ionik, inert, dan thermostable. Ukuran pori bervariasi dari 2 - 5 nm.
● Kekurangannya adalah reagen pewarna lama dihilangkan dari gel dan monomer bersifat toksik. Area yang
terekspos monomer harus langsung dicuci dengan sabun dan air segera.
Mobilitas Elektroforesis
Spesi bermuatan positif akan bergerak menuju katoda sementara spesi bermuatan negatif
bergerak menuju anoda. Laju perpindahan keduanya ditentukan berdasarkan hasil total
muatan spesi dan kekuatan medan X yang didefinisikan oleh persamaan

E = perbedaan tegangan antara probe test yang dimasukkan ke dalam media pembantu
S = jarak (cm)
Mobilitas Elektroforesis
Mobilitas elektroforetik suatu ion (μ) diberikan oleh persamaan

d = jarak linier yang dlalui oleh spesi yang bermigrasi (cm)

t = waktu (detik)
E/s = gradien tegangan

Migrasi dalam elektroforesis berbanding lurus dengan kekuatan medan. Meningkatkan kekuatan medan akan
meningkatkan kecepatan fraksinasi, meningkatkan resolusi, dan menurunkan waktu proses pemisahan
sehingga akan meminimalisir kesempatan difusi fraksi. Oleh sebab itu, sistem perlu dibuat dingin.
Faktor-faktor yang Berperan dalam Pemisahan
Muatan total yang dibawa oleh spesi (μ’) bergantung pada pH. pH larutan buffer dan
kekuatan ion penting dalam proses pemisahan sebagaimana rumus berikut

Ka = konstanta ionisasi

Selain itu, ada beberapa faktor yang mempengaruhi migrasi dalam elektroforesis:
1. Difusi molekul
2. Elektroosmosis
3. Gradien temperatur
4. Interaksi intermolekular antara analit dan media pembantu
Elektroforesis Secara Umum
● Ion divalen akan bermigrasi dua kali lebih cepat dibanding monovalen dengan
ukuran yang mirip
● Kation akan bermigrasi dengan arah yang berlawanan dari anion
● Ion berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding ion berukuran
besar
● Viskositas pelarut yang rendah akan meningkatkan mobilitas
● Tegangan yang tinggi akan menghasilkan pemisahan yang lebih cepat
Elektroforesis secara Umum
● Untuk pemisahan kation, elektroforesis biasanya berjalan pada pH
intermediate menggunakan agen pengompleks seperti asam laktat, tartrat,
atau asam sitrat.
● Sementara untuk memisahkan anion atau asam lemah seperti asam
karboksilat dan fenol, dibutuhkan larutan basa untuk menghindari terjadinya
dua kondisi ionisasi pada saat kesetimbangan.
● Pemisahan basa lemah berion seperti amina dan alkaloid sebaiknya
dilakukan pada pH rendah.
● Kekuatan ion buffer diatur pada 0,05 sampai 0,1 karena kisaran ini
meminimalisir panas yang meningkat.
Konsentrasi Larutan Elektrolit (Buffer)
● Elektrolit dibutuhkan untuk membawa arus dan menurunkan resistansi media
pembantu.
● Namun demikian, konsentrasi elektrolit yang tinggi bisa tidak menguntungkan karena
ketika kekuatan ion meningkat, mobilitas menurun, yang mana hal tersebut tidak
diinginkan.
● Penyebab penurunan mobilitas adalah ion mengalami gradien tegangan yang lebih
rendah akibat terjadinya agregrasi ion counter. Sebagai contoh, lapisan anion akan
meliputi kation sebaliknya lapisan kation akan meliputi anion.
Elektroosmosis
● Selama pemisahan spesi menuju elektroda yang cocok, ion yang terhidrasi
membawa molekul air. Oleh sebab itu, dimungkinkan ratusan molekul pelarut
akan mengikuti ion yang bermigrasi.
● Kation biasanya membawa air lebih banyak daripada anion sehingga aliran
total cairan kebanyakan mengarah ke katoda sehingga molekul netral akan
terseret ke katoda.
● Adanya fenomena ini membuat perlunya koreksi mobilitas yang dilakukan
dengan mengamati migrasi spesi tidak bermuatan.
Deteksi Pemisahan

1. Pemberian warna 2. Autoradiografi

● Deteksi ini melibatkan komponen

radioaktif pada senyawa yang ingin
dideteksi, seperti 3H (asam amino),
33
P (fosfat), 35S (metionin), 13C (asam
amino), atau 125I (iodoasetamida).
● Sampel diletakkan pada bagian atas
lapisan X-Ray.
● Teknik ini 150 kali lebih sensitif dari
staining, namun membutuhkan waktu
lama.
Gel Elektroforesis di Laboratorium
Elektroforesis Kapiler
Elektroforesis Konvensional vs Elektroforesis Kapiler
Pengertian
● Pada elektroforesis kapiler, media bantu pada elektroforesis konvensional yang semula
gel digantikan dengan pipa kapiler berbahan silika (diameter 15 - 100 μm)
● Panjang pipa kapiler (L) bervariasi di antara 20 - 80 cm, diisi dengan larutan elektrolit
berupa buffer pada kedua reservoirnya
● Untuk memberikan kontrol yang baik terhadap waktu migrasi, disarankan pipa kapiler
diletakkan pada oven termostat
● Dengan diameter yang kecil, pemanasan dapat dikurangi hingga diabaikan sehingga
dapat digunakan medan listrik tegangan tinggi untuk pemisahan yang sangat cepat
(tegangan yang diberikan bisa mencapai 30 kV)
● Detektor diletakkan di dekat kompartemen katode dengan jarak l
Aliran Elektroosmotik
● Bila permukaan pipa kapiler berkontak
dengan larutan dalam air maka permukaan
gel akan dilapisi anion (SiO-) yang berasal
dari reaksi hidrolisis silika dengan air
sehingga permukaan pipa kapiler bermuatan
negatif
● Kation dari buffer menutupi lapisan negatif
pipa kapiler sehingga menjadi lapisan kedua
pada permukaan pipa kapiler
● Jika ada arus yang diaplikasikan pada ujung-
ujung pipa kapiler, maka kation yang melapisi
permukaan pipa kapiler akan bergerak
menuju katoda (kutub negatif)
Aliran Elektroosmotik
● Dengan demikian, secara
keseluruhan aliran menuju ke satu
arah yaitu katoda, baik itu molekul
bermuatan maupun netral
● Ion positif akan bergerak menuju
katoda paling cepat, disusul oleh
molekul netral, dan ion negatif
paling lambat karena alirannya
berlawanan dengan aliran
elektroosmosis
Output
Efisiensi Elektroforesis Kapiler

Peak elektroforesis yang semakin tajam menunjukkan semakin efisiennya

pemisahan. Efisiensi pemisahan elektroforesis (N) dapat dinyatakan dengan
rumus

μef = mobilitas elektroforetik

μeo = mobilitas elektroosmotik
E = tegangan listrik yang diberikan
D = koefisien difusi
Instrumentasi Elektroforesis Kapiler

1. Pipa kapiler
2. Larutan Buffer
3. Detektor
4. Rekorder
Pipa Kapiler
● Media pemisah kertas atau gel pada elektroforesis konvensional diganti
dengan pipa kapiler yang terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar
antara 25 - 100 μm dan panjang 50 - 100 cm
● Dimensi pipa kapiler, diameter, dan panjang, akan mempengaruhi efisiensi
(N) pemisahan elektroforesis kapiler. Semakin kecil ukuran diameter dan
semakin pendek pipa, semakin besar harga N
Pipa Kapiler
Cuplikan berupa larutan yang akan dipisahkan dimasukkan melalui ujung pipa kapiler yang
tercelup dalam anoda. Teknik pemasukan cuplikan ke dalam pipa kapiler dapat dilakukan
berdasarkan tekanan atau elektrokinetik yang masing-masing diformulasikan sesuai dua
persamaan berikut.

Q = jumlah yang disuntikkan η = viskositas

P = beda tekanan di antara kedua ujung pipa
kapiler
r = jari-jari pipa kapiler
t = lama pengaliran tegangan listrik
C = konsentrasi cuplikan
μef = mobilitas elektroforetik
μeo = mobilitas elektroosmotik
E = kuat arus
L = panjang pipa kapiler
Larutan Buffer
● Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut
tercelup dalam larutan buffer
● Larutan buffer selain berfungsi sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan
arus listrik juga berfungsi sebagai pengontrol muatan molekul
● Buffer juga menahan pH
● Larutan buffer bisa bersifat asam (fosfat atau sitrat) atau basa (borat) atau
amfoter
Detektor

A. Deteksi dengan UV/Vis

Deteksi dilakukan dengan absorbansi yang dicatat oleh diode array detector.
Jendela sangat kecil dibuat dengan membakar poliimida yang melindungi kapiler
sehingga cahaya dapat melewati pipa dan terukur.
B. Deteksi dengan fluoresensi
Analit dilabeli dengan fluorofor terlebih dahulu.
C. Deteksi dengan spektrometri massa
Persamaan dan Perbedaan dengan HPLC
● Pemisahan menggunakan elektroforesis kapiler dapat dibilang setara dengan
HPLC dalam pemisahan biopolimer
● Keberhasilan pemisahan bergantung pada pemilihan buffer
● Sampel yang dibutuhkan sangat sedikit dan sensitivitasnya tinggi
Elektroforesis Kapiler di Laboratorium
Further Explained

1. Method (min. 22: 45 - end)

https://youtu.be/tQVAorhd1N8

2. Modes of CE and Detection (min. 15:47 - end)

https://youtu.be/Y8S2jZ5pyII