PRINSIP DASAR UJI SARING

IMLTD

Unit Transfusi Darah Pusat

PALANG MERAH INDONESIA

PDTTD 4.1.b 1
 TUJUAN PEMBELAJARAN
• Menjelaskan berbagai prinsip uji saring
terhadap infeksi menular lewat transfusi
darah.
• Menjelaskan perbedaan antara masing-2
jenis uji saring.
• Menjelaskan prinsip dasar penentuan
pilihan metoda uji saring darah.

PDTTD 4.1.b 2
 TERMINOLOGI
Bbrp terminologi harus dipahami dengan benar :
• Positif / Negatif
Hanya dipakai untuk hasil pemeriksaan awal yg
telah dikonfirmasi oleh satu atau lebih asay
lainnya.
• Reaktif / Non Reaktif
Hasil pemeriksaan awal sebelum dikonfirmasi.
• Equivocal / Indeterminate
Hasil yang tidak jelas apakah positif atau negatif
(meragukan).

PDTTD 4.1.b 3
 METODA UJI SARING SIFILIS

• Dikenal 2 tes serologis terhadap sifilis :

1. Non spesifik : Tes Non Treponema
2. Spesifik : Tes Treponema
• Umumnya mrp uji terhadap keberadaan Ab
• Metoda :
1. Aglutinasi--> banyak utk uji saring darah
2. EIA (Enzyme Immuno Assay)
3. Rapid
PDTTD 4.1.b 4
 TES NON TREPONEMA
• Tujuan : mengetahui ada / tidaknya reagin.
• Reagin : Ab thd lemak jaringan.
• Mudah, murah, tapi perlu konfirmasi.
• Non spesifik : positif pd peny. lain spt GO,
TB, Malaria, Lepra, SLE, dll
• Prinsip aglutinasi berdasarkan :
1. Reaksi Presipitasi : VDRL, Kahn, RPR
2. Reaksi Fiksasi Komplemen : Wassermann

PDTTD 4.1.b 5
 TES TREPONEMA
• Tujuan : mengetahui ada / tidaknya Ab
terhadap T. pallidum --> spesifik
• Konfirmasi dari tes non treponema.
• Jenis tes :
1. TPI (T. pallidum Immobilization).
2. FTA-ABS (Fluorescent T. pallidum Abs).
3. TPHA (T. pallidum Hemaglutination
Assay), dll.
PDTTD 4.1.b 6
TES PRESIPITASI : VDRL, RPR & KAHN

• Prinsip : terjadinya presipitasi dari ikatan

Ag-Ab.
• Assay :
- Ag : kardiolipin, lecithin dan kholesterol
- Indikator : karbon (pd RPR)
• Bila pd serum tdp reagin (Ab) --> terjadi
ikatan Reagin-Ag --> presipitasi.

PDTTD 4.1.b 7
 TPHA
• Prinsip : terjadinya aglutinasi sdm bila
terdapat ikatan Ag (pd permukaan
sdm) dg Ab (pada serum sampel).
• Assay :
- Ag : eri domba yg disensitisasi T.
pallidum
• Bila pd serum sampel tdp Ab --> terjadi
ik. Ag-Ab --> aglutinasi eritrosit.
PDTTD 4.1.b 8
 METODA UJI SARING HEPATITIS
DAN HIV
• Jenis Metoda :
1. EIA
2. Aglutinasi
3. Dot Blot
4. Metoda lain : Fluorescent, Radioimmuno assay
5. Tes Konfirmnasi : WB, PCR
EIA :
1. Indirek 4. EIA Kombinasi Ag-Ab
2. Direk / kompetitif 5. EIA HIV Gen O
3. Sandwich 6. EIA Capture
PDTTD 4.1.b 9
EIA : Enzyme Immuno Assay (1)
• Solid phase : well, bead, kertas nitroselulosa
 pembawa Ag / Ab.
• Konjugat : Ab / Ag berlabel enzim
• Enzim :
- Alkali fosfatase
- Horseradish peroxidase
• Deteksi Ab : pada assay tdp Ag
• Deteksi Ag : pada assay tdp Ab
• Ag : Viral lysate, recombinant, peptide

PDTTD 4.1.b 10
EIA : Enzyme Immuno Assay (2)

• Substrat : Chromogen (pembawa warna)

- 4 Nitrofenilfosfat – Alk. Fosfatase
- O fenildiamin 2 HCL (OPD) – HRP
• Generasi EIA : Tgt Ag dan Format Assay
- First gen EIA : Viral lysate, Ind/Dir EIA
- Second gen EIA : Recomb/Peptide,
Ind/Dir EIA
- Third gen EIA : Recomb/Peptide,
Sandwich EIA
PDTTD 4.1.b 11
 EIA INDIREK
• Prinsip : Ab konjugat berikatan dg Ab
sampel bukan dengan Ag assay.
substrat
konjugat
Ab sampel

Ag assay
Terbentuk warna Tidak terbentuk
warna

Reactive Non reactive

PDTTD 4.1.b 12
 EIA DIREK / KOMPETITIF
• Prinsip : terdapat persaingan antara Ab sampel
dg Ab konjugat untuk mengikat Ag assay.

Substrat
Ab Ab konj
Sampel Ag Assay

Tidak terbentuk Terbentuk

warna  warna 
Reaktif Non Reaktif
PDTTD 4.1.b 13
 EIA SANDWICH

• Prinsip : pd deteksi Ab sampel, konjugat

mengandung Ag  double deteksi Ab sampel
oleh Ag assay dan Anti-IgG konjugat) 
sensitifitas & spesifisitas tinggi.

substrat
konj (Anti IgG)
Ab sampel

Ag assay

Terbentuk warna Tidak terbentuk

warna
Reactive Non reactive
PDTTD 4.1.b 14
 EIA HIV KOMBINASI Ab-Ag (1)
• Prinsip : EIA Sandwich, deteksi Ab & Ag HIV
• Assay :
- Solid phase : Gp 160, env HIV-2, anti-P24.
- Konjugat : HRP- Gp160, env HIV-2, anti-P24.
• Hasil reaktif : sample mungkin mengandung
P24 dan atau anti-Gp160, anti env HIV-2.
• Memperpendek WP o.k P24 mrp Ag yang
pertama muncul.
PDTTD 4.1.b 15
 EIA HIV KOMBINASI Ab-Ag (2)

Solid phase anti-HIV-1 HRP labelled TMB

HIV-1/HIV-2/HIV-1 gr O anti-HIV-2 mixture of Substrate
anti-HIV-1 anti-HIV-1 gr O HIV-1/HIV-2/
mixture HIV-1 Ag HIV-1 gr O
in sample anti-HIV1

Incubatie 60 min at 37 C Incubate

30 min at 15
to 30 C

PDTTD 4.1.b 16
 EIA HIV GEN O

• Prinsip : EIA Sandwich.

• Assay : digunakan Ag HIV-1 group O.
• Kegunaan :
- Dapat mendeteksi Ab thd HIV-1 group O.
- HIV-1 group O --> ditemukan di Cameroon.
- Manfaat untuk di Indonesia ?

PDTTD 4.1.b 17
 PEMBACAAN HASIL EIA (1)
• Hasil EIA assay akan dibaca dengan alat
spektrofotometer melalui penilaian jumlah
cahaya dg pj glb tertentu yang terabsorbsi
oleh warna yg terbentuk akibat adanya ik.
Ag-Ab.
• Absorbans cahaya akan dikalkulasi secara
komputerisasi --> didapat nilai absorbans.
• Nilai cut off ditentukan dari perhitungan nilai
abs rata-2 kontrol negatif dan kontrol positif.

PDTTD 4.1.b 18
 PEMBACAAN HASIL EIA (2)
• Pembacaan lar. Blank -->perlu untuk
QC alat spektrofotometer.
• Untuk EIA indirek dan sandwich :
- hasil positif : bila nilai abs-nya > cut
off value
• Untuk EIA direk :
- hasil positif : bila nilai abs-nya < cutt
off value
PDTTD 4.1.b 19
 METODA AGLUTINASI (1)

• Prinsip : reaksi aglutinasi akibat adanya

ikatan Ag-Ab
• Assay :
- Carrier Ag : sdm, Latex, gelatin
- Carier sdm --> passive hemaglutination
• Masalah : fenomena prozone akibat
jumlah Ab yg berlebihan (pengenceran
kurang)
PDTTD 4.1.b 20
METODA AGLUTINASI (2)

Particle coated with Ag Absent of agglutination

Ab in sample due to prozone Ab
excess

PDTTD 4.1.b 21
 METODA DOT BLOT & FLUORESCEN
• Prinsip : Imunochromatografi dan EIA
• Assay :
- Solid phase :
- Dot Blot : kertas nitroselulosa.
- Fluorescen : kaca slide dg well mgd
limposit T yg telah diinfeksi
- Konjugate fluorescen : mgd Fluorochrome.
• Hasil positif : terbentuk “Dot” / Fluoresensi pd
sitoplasma sel limposit.

PDTTD 4.1.b 22
 METODA FLUORESCEN
Fluorescen detected
under UV light
anti-human Ig labeled with
a fluorochrome

Ab in sample cell infected

attaches to with HIV
HIV in cells

Perlu tenaga terlatih

PDTTD 4.1.b 23
 WESTERN BLOT (1)

• Prinsip :
1. Pemisahan Ag viral lysate menurut
Berat Molekulnya dg elektroforesa.
2. Transfer (blotting) dari Ag yang sudah
dipisahkan keatas kertas nitroselulosa.
3. Tes sampel keatas kertas nitroselulosa
yang sudah terblotting --> prinsip EIA.

PDTTD 4.1.b 24
 WESTERN BLOT (2)
(A) Preparation of the Western Blot Strips

prot Katoda
migra- (BM tg)
tion
viral
lysate Anoda
(BM rdh)
SDS-PAGE Transfer of separated Ag
on to nitrocellulosa
gp160
gp120
Chromogen
p66
p55
p51 Anti-human Ab withh
enzyme label
gp41
specific Ab
p31
p24
p17
p15 separated Ag
PDTTD 4.1.b 25
 WESTERN BLOT (3)
• Interpretasi hasil :
- Positif : terlihat band P24, Gp41.
- Indeterminate : salah satu GAG
protein.
- Negatif : Weak P17.
• Keuntungan dan kerugian :
- Mahal, lama, butuh tenaga ahli.
- Spesifik.
PDTTD 4.1.b 26
 MEMILIH ASSAY UJI SARING
• Bbp hal yg perlu dipertimbangkan dalam memilih assay uji saring
yg tepat :
- Prinsip ilmiah assay.
- Kerumitannya.
- Waktu reaksi.
- Sensitifitasnya.
- Spesifisitasnya.
- Kecocokannya pada berbagai situasi yg berbeda.
- Ketersediaannya.
- Harganya.
• Pedoman WHO :
- Donasi sp dengan 35 ktg/mg--> Dot Blot
- Donasi 35 - 60 ktg/mg --> Aglutinasi
- Donasi > 60 ktg/mg --> EIA

PDTTD 4.1.b 27
 SENSITIFITAS DAN SPESIFISITAS
• Sensitifitas :
Kemampuan suatu asay mendeteksi sampel
yang positif.
Sensitifitas (%) = True positive X 100
True positive + False negative
• Spesifisitas :
Kemampuan suatu asay untuk tidak mendeteksi
sampel positif non spesifik atau false positif.
Spesifisitas (%) = True negative X 100
True negative + False positive

PDTTD 4.1.b 28
 FAKTOR-2 YG MEMPENGARUHI
PROGRAM UJI SARING
• Pelatihan petugas.
• Peralatan dan reagen yg diperlukan.
• Penyediaan asay.
• Penyimpanan asay.
• Kecocokan dan kondisi sampel yg akan dites.
• Penyediaan sampel EQC.
• Keterbatasan waktu untuk uji saring.
• Biaya uji saring.

PDTTD 4.1.b 29
PELATIHAN PETUGAS
• Meliputi pelatihan bagaimana melakukan uji
saring, menindak lanjuti hasil uji saring, mencatat
hasil uji saring dan melaporkan hasil uji saring.

PERALATAN DAN REAGEN

• Pertimbangkan keperluan peralatan dan
reagen yg tidak tercakup didalam kit asay serta
penyediaannya :
- pipet tip disposabel
- botol plastik ntuk mempersiapkan reagen
- distilled water
- larutan asam (H2SO4)
PDTTD 4.1.b 30
 PENYEDIAAN KIT ASAY
Pada dasarnya ada 4 hal yg harus dipertimbangkan :
1. Perhitungan penggunaan kit saat ini : tgt jlh donasi
yg diharapkan pada periode waktu tertentu,
kebutuhan uji saring ulang, uji saring sampel
IQC/EQC , jumlah tes gagal.
2. Tentukan jumlah stok yg tepat : tgt luas tempat
penyimpanan, keterbatasan biaya, masa
kadaluarsa reagen.
3. Waktu pengiriman reagen : tgt transportasi, buat
pesanan jika 80% reagen telah terpakai.
4. Kontrol thd batch kit

PDTTD 4.1.b 31
PENYIMPANAN ASAY
• Tgt pada kekuatan listrik, besarnya ruang pendingin /
refrigerator, kontrol suhu tempat penyimpanan (2-80C)
dan suhu ruang (18-250C)

JENIS DAN KUALITAS SAMPEL

• Tgt instruksi pabrik reagen : serum / plasma / darah
lengkap.
• Sampel segar, beku lengkap, tersimpan baik, tidak lisis,
tidak lipemik.

SAMPEL QC
• Memonitor performans asay : sensitifitas & spesifisitas.
• Brp serum yg diketahui status serologiknya.
• Iqc sampel dan EQC sampel.

PDTTD 4.1.b 32
KETERBATASAN WAKTU

• Stok darah sedikit  donor pengganti meningkat  waktu

untuk uji saring terbatas  kesalahan mudah terjadi 
alternatif rapid asay.

BIAYA UJI SARING, dipengaruhi oleh :

• Jlh donasi yg harus dites.
• Jenis asay.
• Tambahan alat dan reagen yg diperlukan.
• Reliabilitas asay.
• Spesifisitas asay.
• Prevalensi IMLTD pada populasi donor.
• Pengambilan darah.
• Jlh petugas.

PDTTD 4.1.b 33
 RINGKASAN (1)
• Darah untuk transfusi harus bebas dari agen IMLTD.
• Berbagai metoda deteksi agen IMLTD tersedia.
• Untuk uji saring darah donor --> harus sensitif, karena untuk
menyingkirkan darah yg terkontaminasi.
• Persyratan reagensia:
Sensitifitas >99%, spesifisitas ≥ 98%
Reagen sudah dievaluasi oleh LRN/UTDP PMI
Reagen memp kontrol internal
Reagen sdh disosialisasikan
• Untuk uji diagnostik --> selain sensitif juga harus spesifik o.k
menentukan pengobatan dan prognosa.

PDTTD 4.1.b 34
 RINGKASAN (2)
• Pertimbangkan berbagai kriteria pemilihan
metoda  gunakan jenis asay yg paling
sesuai dg kondisi UTD.
• Petugas harus terlatih untuk asay tertentu.
• Asay tersimpan pada kondisi yg tepat.
• Kualitas sampel terjamin.
• Wlp waktu terbatas uji saring harus
dilakukan sebelum darah ditransfusikan.
• Biaya uji saring tgt berbagai faktor.

PDTTD 4.1.b 35
 HASIL PEMBELAJARAN
Sekarang anda mampu :
• Menjelaskan prinsip uji saring IMLTD.
• Menjelaskan perbedaan masing-2 jenis uji saring.
• Mengidentifikasi jenis asay paling cocok dg UTD
masing-masing.
• Menyebutkan faktor yg perlu dipertimbangkan
dalam menentukan metoda uji saring darah.
• Menjelaskan sensitifitas dan spesifisitas.
• Menilai faktor-2 yg mempengaruhi keseluruhan
biaya uji saring.

PDTTD 4.1.b 36