Prinsip pemeriksaan metode

Elisa, PCR dan

Elektroforese
Prinsip pemeriksaan Imunologis
Umumnya berdasarkan pada interaksi
antigen(Ag) dan antibodi(Ab).
Interaksi antigen dan antibodi tba :
- Tingkat primer.
- Tingkat sekunder.
- Tingkat tertier.
 Tingkat primer

Merupakan awal reaksi ikatan

molekuler antara Ag dan Ab
Reaksi tidak terlihat dengan mata
telanjang(biasa)
Perlu indikator
indikator :
- Radioisotop
- Enzim atau
- zat warna flouresen.

Indikator dilengketkan ke Ag atau Ab.

Nama metode pemeriksaan, untuk
menentukan interaksi antara Ag dan
Ab disesuaikan dengan nama
indikator diatas.
Ilmu yang mempelajari tentang reaksi
Ag dan Ab  serologi
 Radioisotop Radio Immuno Assay
(RIA).
Enzim  Enzyme Immuno Assay
(EIA)  Elisa
Flouresen  Immunoflouresensi

Metode ini untuk menentukan kadar Ag

atau Ab yang rendah  ng
Tingkat sekunder
Presipitasi
Aglutinasi.
Tingkat tertier

Interaksi antara Ag dan Ab terjadi

dalam tubuh manusia/ invivo.
Teknik ELISA

Untuk menentukan kadar Ag atau Ab.

Indikator berupa enzim dilenketkan
pada Ag atau Ab.
Ada beberapa metode.
 Prinsip Metode Elisa

Bila kita mau menditeksi antigen(Ag):

Ag(serum) + AbE Ag- AbE komplek
cuci
Inkubasi dengan substrat kromogenik
(semula tak berwarna) berwarna,bila
dihidrolisis oleh enzim intensitas
warna yang terjadidiukur dengan
fotometer/ spektrofotometer  kadar
antigen.
Prinsip Metode Elisa[Sambungan]
Hidrolisis oleh enzim berlangsung dalam
waktu ttt.
Reaksi berhenti bila ditambahkan asam
atau basa kuat.
Reaksi harus berlangsung dalam
keaadan optimal dimana
-kadar reaktan
- temperatur
-masa inkubasi yang telah ditentukan
secara eksperimental  setiap reagen
dari fabrik ber beda prosedur berbeda.
 Reaksi optimal sudah ditentukan
secara eksperimental,dengan
penetapan
- kadar reaktan
- temperatur
- masa inkubasi
 setiap reagen dari fabrik berbeda
prosedur berbeda.
Metode Elisa

Metode kompotitif
Non kompotitif [Langsung]
Indirek atau sandwich
 Metode kompotitif

 Umumnya untuk menentukan Ag.

 Ab spesifik [dilekatkan pada partikel
/sumur ] dicampur bersama sama Ag *
tambahkan serum [Ag] yang akan
bersaing dengan Ag*untuk mengikat
Ab diatas kompleks Ag*-Ab-Ag
Metode Elisa[sambungan]

Non kompotitif[  menentukan Ab

atau Ag
Indirek/sandwich  menentukan Ab
dan Ag
-Ag-Ab-AntiAb* antibodi yang
dicari
-Abs –Ag –Ab*Ag yang dicari
Elektroforese

Dikenalkan oleh Tiselius,1930

berkembang  menentukan protein
serum dan urin
Elektroforese merupakan teknik
pemeriksaan yang berguna untuk
pemisahan dan mengukur kadar
makromolekul (protein)
Komponen komponen
Elektroforese
Dapar/Buffer
Media pendukung.
- Media gel agarosa
- Media selulosa asetat
Power suply unit
Pewarna Protein
Densitometer
Power suply unit

 Menghasilkan energi pada kedua

elektroda  pergerakan dan
pemisahan molekul protein.
 Tegangan dan besar arus dapat
dikendalikan.
Pewarna Protein
Panceou red
amino black
Coomassie blue
Densitometer

Alat pengukur kuantitas berdasarkan

intensitas warna pita pada
elektroforese, saat media pendukung
melalui sistem optik yang bekerja
seperti fotometer
Prinsip Dasar Elektroforese

Tergantung pada :
A. Muatan partikel
B. Kecepatan migrasi.
A. Muatan :
Partkel bermuatan, dalam media pendukung
nya, bila terpapar dengan medan listrik, akan
bergerak kearah elektroda yang berlawanan.
Molokul protein bersifat ampoter. Bila protein
berada pada lingkungan pH dibawah titik iso
elektrisnyaprotein akan bermuatan neto
positip dan sebaliknya
Pada pH isoelektrik protein tidak bermuatan
listrik atau muatannya nol
B. Kecepatan Migrasi.
Kecepatan migrasi protein tergantung
pada :
1. Kekuatan medan listrik.
Makin besar perbedaan muatan
neto makin cepat gerakan.
2. Ukuran molekul :
Makin kecil mol makin cepat
gerakan
3. Media pendukung :
Pori pori media bersifat filter.
4. Viscositas media
Makin tinggi viscositas makin lambat
gerakan
5. Kekuatan medan listrik : tegangan listrik
besarmigrasi cepat.
6. Endoosmosis yaitu gerakan berlawanan
arah dalam media pendukung.
7. Kadar ion dalam dapar: kadar ion
rendah  migrasi cepat
8. Suhu: suhu tinggi  migrasi cepat.
6.Endoosmosis:
yaitu gerakan berlawanan arah dalam
media pendukung.
7.Kadar ion dalam dapar:
kadar ion rendah  migrasi cepat
8.Suhu:
suhu tinggi  migrasi cepat.
Fraksi fraksi Serum Protein Elektroforesis
Dengan gel agarosa :
- Prealbumin
- Albumin
- Alfa 1 globulin
- Alfa 2 globulin
- Beta globulin
- Gama globulin
Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita
pita yang spesifik letaknya  dan
digambarkan densitometer berupa kurva
Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita
pita yang spesifik letaknya.
Densitometer menghasilkan fraksi
protein berupa kurva
Berdasarkan Pergerakan SPE
Prealbumin
- Fraksi protein yang bermigrasi paling
dekat ke anoda.
Albumin,
- Fraksi protein terbanyak.
- Fungsi mempertahankan tekanan
osmotik
Alfa1 globulin
Alfa 2 globulin.
Beta1globulin.
Beta 2 globulin.
Gamma globulin migrasi terdekat ke
katoda.
Polymerase Chain Reaction(PCR).

Metode yang cepat dan sederhana,

untuk mengkopi dan memperbanyak
urutan DNA spesifik yang dinginkan
dan divisualisasikan sebagai pita yang
jelas pada agarose gel.
Scara mendasar sebenarnya PCR
mengulangi siklus :
- Denaturasi
- Hibridasi dari DNA yang dinginkan
dengan bantuan DNA primer
- Extensi regio DNA tsb oleh enzim
DNA polymerase.
Pada PCR konvensional
- Target amplifikasi adalah asam
nukleat harus dilakukan terlebih
dahulu sampai selesai
- Baru diditeksi.
Pada PCR yang baru amplifikasi
dilakukan terhadap sinyal sedangkan
target asam nukleat tidak diamplifikasi.
Pada PCR yang baru
Amplifikasi dilakukan terhadap sinyal.
Target asam nukleat tidak di
amplifikasi.
 Prinsip PCR
1. Ekstraksi DNA
2. Alat PCR
a. Target DNA
b. Persiapan larutan reaksi PCR (d NTP,,bufer,primer DNA
danTaq DNA polymerase
c. Denaturasi DNA
Initial denaturation : 5 menit,t 94 C
Denaturation : 1 menit 94 C
Primer annealing : 1 menit 50 C
Copying of DNA by DNA polymerase
final elongation 10 menit ,72 C

Program alat PCR bisa dilakukan 25 -30 siklus