Prinsip pemeriksaan metode

Elisa, PCR dan

Elektroforese
Dr.Ozar Sanuddin, SpPK(K)
Bagian Patologi Klinik
Fakultas kedokteran USU/UISU
Medan

Prinsip pemeriksaan Imunologis

Umumnya berdasarkan pada interaksi
antigen(Ag) dan antibodi(Ab).
Interaksi antigen dan antibodi tba :
- Tingkat primer.
- Tingkat sekunder.
- Tingkat tertier.

Tingkat primer
Merupakan awal reaksi ikatan
molekuler antara Ag dan Ab
Reaksi tidak terlihat dengan mata
telanjang(biasa)
Perlu indikator

indikator :
- Radioisotop
- Enzim atau
- zat warna flouresen.
Indikator dilengketkan ke Ag atau Ab.

Nama metode pemeriksaan, untuk

menentukan interaksi antara Ag dan
Ab disesuaikan dengan nama
indikator diatas.
Ilmu yang mempelajari tentang reaksi
Ag dan Ab serologi

Radioisotop Radio Immuno Assay

(RIA).
Enzim
Enzyme Immuno Assay
(EIA) Elisa
Flouresen Immunoflouresensi
Metode ini untuk menentukan kadar Ag
atau Ab yang rendah ng

Tingkat sekunder
Presipitasi
Aglutinasi.

Tingkat tertier
Interaksi antara Ag dan Ab terjadi
dalam tubuh manusia/ invivo.

Teknik ELISA
Untuk menentukan kadar Ag atau Ab.
Indikator berupa enzim dilenketkan
pada Ag atau Ab.
Ada beberapa metode.

Prinsip Metode Elisa

Bila kita mau menditeksi antigen(Ag):
Ag(serum) + AbE Ag- AbE komplek
cuci
Inkubasi dengan substrat kromogenik
(semula tak berwarna) berwarna,bila
dihidrolisis oleh enzim intensitas
warna yang terjadidiukur dengan
fotometer/ spektrofotometer kadar
antigen.

Prinsip Metode Elisa[Sambungan]

Hidrolisis oleh enzim berlangsung dalam
waktu ttt.
Reaksi berhenti bila ditambahkan asam
atau basa kuat.
Reaksi harus berlangsung dalam
keaadan optimal dimana
- kadar reaktan
- temperatur
- masa inkubasi yang telah ditentukan
secara eksperimental setiap reagen
dari fabrik ber beda prosedur berbeda.

Reaksi optimal sudah ditentukan

secara eksperimental,dengan
penetapan
- kadar reaktan
- temperatur
- masa inkubasi
setiap reagen dari fabrik berbeda
prosedur berbeda.

Metode Elisa
Metode kompotitif
Non kompotitif [Langsung]
Indirek atau sandwich

Metode kompotitif
Umumnya untuk menentukan Ag.
Ab spesifik [dilekatkan pada partikel
/sumur ] dicampur bersama sama Ag *
tambahkan serum [Ag] yang akan
bersaing dengan Ag*untuk mengikat
Ab diatas kompleks Ag*-Ab-Ag

Metode Elisa[sambungan]
Non kompotitif[ menentukan Ab
atau Ag
Indirek/sandwich menentukan Ab
dan Ag
- Ag-Ab-AntiAb* antibodi yang
dicari
- Abs Ag Ab*Ag yang dicari

Elektroforese
Dikenalkan oleh Tiselius,1930
berkembang menentukan protein
serum dan urin
Elektroforese merupakan teknik
pemeriksaan yang berguna untuk
pemisahan dan mengukur kadar
makromolekul (protein)

Komponen komponen
Elektroforese
Dapar/Buffer
Media pendukung.
- Media gel agarosa
- Media selulosa asetat
Power suply unit
Pewarna Protein
Densitometer

Power suply unit

Menghasilkan energi pada kedua
elektroda pergerakan dan
pemisahan molekul protein.
Tegangan dan besar arus dapat
dikendalikan.

Pewarna Protein
Panceou red
amino black
Coomassie blue

Densitometer
Alat pengukur kuantitas berdasarkan
intensitas warna pita pada
elektroforese, saat media pendukung
melalui sistem optik yang bekerja
seperti fotometer

Prinsip Dasar Elektroforese

Tergantung pada :
A. Muatan partikel
B. Kecepatan migrasi.

A. Muatan :
Partkel bermuatan, dalam media pendukung
nya, bila terpapar dengan medan listrik, akan
bergerak kearah elektroda yang berlawanan.
Molokul protein bersifat ampoter. Bila protein
berada pada lingkungan pH dibawah titik iso
elektrisnyaprotein akan bermuatan neto
positip dan sebaliknya
Pada pH isoelektrik protein tidak bermuatan
listrik atau muatannya nol

B. Kecepatan Migrasi.
Kecepatan migrasi protein tergantung
pada :
1.Kekuatan medan listrik.
Makin besar perbedaan muatan
neto makin cepat gerakan.
2.Ukuran molekul :
Makin kecil mol makin cepat
gerakan

3.Media pendukung :
Pori pori media bersifat filter.
4.Viscositas media
Makin tinggi viscositas makin lambat
gerakan
5.Kekuatan medan listrik : tegangan listrik
besarmigrasi cepat.
6.Endoosmosis yaitu gerakan berlawanan
arah dalam media pendukung.
7.Kadar ion dalam dapar: kadar ion
rendah migrasi cepat
8.Suhu: suhu tinggi migrasi cepat.

6.Endoosmosis:
yaitu gerakan berlawanan arah dalam
media pendukung.
7.Kadar ion dalam dapar:
kadar ion rendah migrasi cepat
8.Suhu:
suhu tinggi migrasi cepat.

Fraksi fraksi Serum Protein Elektroforesis

Dengan gel agarosa :
- Prealbumin
- Albumin
- Alfa 1 globulin
- Alfa 2 globulin
- Beta globulin
- Gama globulin
Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita
pita yang spesifik letaknya dan
digambarkan densitometer berupa kurva

Fraksi fraksi protein terlihat berupa pita

pita yang spesifik letaknya.
Densitometer menghasilkan fraksi
protein berupa kurva

Berdasarkan Pergerakan SPE

Prealbumin
- Fraksi protein yang bermigrasi paling
dekat ke anoda.
Albumin,
- Fraksi protein terbanyak.
- Fungsi mempertahankan tekanan
osmotik

Alfa1 globulin
Alfa 2 globulin.
Beta1globulin.
Beta 2 globulin.
Gamma globulin migrasi terdekat ke
katoda.

Polymerase Chain Reaction(PCR).

Metode yang cepat dan sederhana,
untuk mengkopi dan memperbanyak
urutan DNA spesifik yang dinginkan
dan divisualisasikan sebagai pita yang
jelas pada agarose gel.

Scara mendasar sebenarnya PCR

mengulangi siklus :
- Denaturasi
- Hibridasi dari DNA yang dinginkan
dengan bantuan DNA primer
- Extensi regio DNA tsb oleh enzim
DNA polymerase.

Pada PCR konvensional

- Target amplifikasi adalah asam
nukleat harus dilakukan terlebih
dahulu sampai selesai
- Baru diditeksi.
Pada PCR yang baru amplifikasi
dilakukan terhadap sinyal sedangkan
target asam nukleat tidak diamplifikasi.

Pada PCR yang baru

Amplifikasi dilakukan terhadap sinyal.
Target asam nukleat tidak di
amplifikasi.

Prinsip PCR
1. Ekstraksi DNA
2. Alat PCR
a. Target DNA
b. Persiapan larutan reaksi PCR (d NTP,,bufer,primer DNA
danTaq DNA polymerase
c. Denaturasi DNA
Initial denaturation : 5 menit,t 94 C
Denaturation : 1 menit 94 C
Primer annealing :
1 menit 50 C
Copying of DNA by DNA polymerase
final elongation 10 menit ,72 C
Program alat PCR bisa dilakukan 25 -30 siklus