Metode PCR (Polymerase chain

reaction) dalam mendekteksi

isolat klinis Mycobacterium
tuberculosis pada Anak
dr. Putu Ayunda Trisna
dr. Ni Putu Wirantari
dr. Putu Diah Pratiwi

PENDAHULUAN

PENDAHULUAN

PENDAHULUAN
Baku emas dalam penegakan diagnosis adalah adanya
mikobakterium pada biakan sampel cairan tubuh atau
jaringan PERLU WAKTU
pengecatan bakteri tahan asam akan tetapi cara ini kurang sensitif
dibandingkan kultur

Saat ini mulai berkembang pemeriksaan

molekular dimana sensitifitas lebih baik
dibandingkan pengecatan bakteri tahan asam
dengan hasil lebih cepat dibanding pemeriksaan
kultur

Tuberkulosis
Penyakit akibat infeksi kuman Mycobacterium
tuberkulosis sistemis sehingga dapat mengenai
hampir semua organ tubuh, dengan lokasi
terbanyak di paru yang biasanya merupakan
lokasi infeksi primer

Patogenesis TBC1

Skoring Tuberkulosis
Parameter
Kontak TBC

0
tidak jelas

Uji Tuberkulin

Negative

BB/keadaan gizi
Demam tanpa sebab
yang jelas

1
laporan keluarga
BTA(-) atau tidak
tahu

3
BTA (+)

Positif > 10 mm,

atau > 5 mm
pada keadaan
imunosupresi
BB/TB < 90% atau
BB/U <80%

Klinis gizi buruk

atau BB/TB < 70%
atau BB/U <60%

> 2 minggu

Batuk
Pembesaran kelenjar
limfe koli, aksila,
inguinal

> 3 minggu
> 1 cm, jumlah > 1,
tidak nyeri

Pembengkakan
tulang/sendi panggul,
lutut, falang

Ada pembengkakan

Foto rontgen toraks

2
kavitas (+)
BTA tidak
jelas

Normal/tid Infiltrate, pembesaran

ak jelas
kelenjar, konsolidasi
segmental/lobar

Klasifikasi+infiltra
te, pembesaran
kelenjar +
infiltrate

Petunjuk diagnosis TBC menurut WHO

Dicurigai tuberkulosis
Anak sakit dengan riwayat kontak penderita tuberkulosis dengan
diagnosis pasti (BTA Positif)
terdapat reaksi kemerahan cepat setelah penyuntikan BCG
(dalam 3-7 hari),
terdapat gejala umum TBC
Mungkin tuberkulosis
Anak dicurigai tuberkulosis dengan tambahan :
Uji tuberkulin positif (10 mm/ lebih)
Foto rontgen paru sugestif tuberkulosis
Pemeriksaan histologis biopsi sugestif tuberkulosis
Respon yang baik pada pengobatan OAT
Pasti tuberkulosis
Ditemukan basil tuberkulosis pada pemeriksaan langsung atau
biakan. Identifikasi Mycobacterium tuberculosa pada karakteristik
biakan.

Pemeriksaan Penunjang

Uji Tuberkulin
Gambaran radiologis
Bakteriologis
Serodiagnosis: ELISA
Teknik biomolekular
Patologi anatomik

Diagnosis biomolekular pada Tuberkulosis

Mendeteksi asam nukleat (DNA maupun RNA) suatu patogen
- Ekstrasi Asam Nukleat : Proses ekstrasi harus dilakukan di
- Amplifikasi : Asam Nukleat pada sampel ataupun kultur di amplfikasi.
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan salah satu metode
amplifikasi.
- Deteksi : Metode yang digunakan untuk mendeteksi asam nukleat yang
telah di amplifikasi dapat dengan cara elektroporesis, line probe assay
atau real time detection

Alur sampel pada pemeriksaan molekuler tuberkulosis

Bagan prookol pemeriksaan biomolekular pada pasien Tuberkulosis

Mengidentifikasi M.tuberkulosis menggunakan PCR

Prinsip prosedur PCR adalah denaturasi thermal DNA sampel,
diikuti hibridisasi primer oligonukleotida (annealing) ke utas DNA
Pada proses PCR khususnya dalam mendeteksi M. Tuberkulosis
diperlukan beberapa komponen yang memegang peranan penting
1. DNA cetakan
2. Primer
3. Proses amplifikasi DNA
4. Analisis DNA hasil amplifikasi

DNA Cetakan
Perlu diperhatikan kemurnian dan jumlah DNA sasaran
menurunkan efesiensi PCR
Dalam hal mendeteksi kumat Tuberkulosis ekstrasi nya
dengan cara, bakteri yang sudah tumbuh, dibuat
suspensi dengan menambahkan larutan NaCl 0,9% (b/v)
ke dalam kultur tersebut
Suspensi kemudian dipanaskan, disentrifugasi, dan
dicuci sebanyak 2 kali
Pelet bakteri kemudian dilarutkan dengan larutan
penyangga TE/Tris-EDTA pH 8,0.
Ekstraksi DNA dilakukan sesuai dengan prosedur

Primer
Primer adalah oligonukleotida dengan panjang 20 30
basa yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksi
pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA.
Primer merupakan basa komplemen dari masingmasing ujung 5 fragmen DNA yang akan diperbanyak.
PCR diperlukan sepasang primer.
Primer pertama sebagai upstream primer dan primer
kedua sebagai downstream primer

Proses amplifikasi DNA

Amplifikasi DNA dilakukan dengan metode PCR menggunakan
primer oligonukleotida Pt8 (5'-GTGCGGATGGTCGCGAGAT-3') dan
Pt9 (5'-CTGGATGCC CTC ACG GTTCA-3')
larutan penyangga (10mM Tris-HCl pH 8,3 + 50 mM KCl), 2,0 mM
MgCl2, 0,01% (b/v) gelatin, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Proses PCR dilakukan dalam DNA thermocycler (Perkin-Elmer)
dengan tahap denaturasi 1,5 menit pada suhu 94oC, annealing pada
suhu 65oC, 2 menit, tahap extension 3 menit pada suhu 72oC, dan
extended extension pada suhu 72oC selama 7 menit, untuk tiap
siklus.
Jumlah siklus yang diperlukan 40 siklus.

Analisis DNA hasil amplifikasi

Teknik elektroforesis gel agarosa digunakan untuk menganalisis
DNA hasil amplifikasi dengan konsentrasi agarosa 1,5% (b/v)
Pewarnaan DNA hasil elektroforesis dilakukan dengan
menggunakan larutan etidium bromida
Gel kemudian divisualisasi melalui ultraviolet transilluminator
Menentukan ukuran fragmen DNA, digunakan penanda berat
molekul HaeIIIX174 yang dinyatakan dengan pasangan basa
(basepair = bp).

Analisis DNA hasil amplifikasi

Batas deteksi uji PCR, yaitu jumlah DNA minimum yang
memberikan hasil positif dengan metode PCR dan elektroforesis
gel agarosa, ditunjukkan dengan adanya pita DNA pada gel dari
isolat M. tuberkulosis
Sensitivitas uji PCR yang ditunjukkan dengan batas deteksi tersebut
untuk 6 isolat yang digunakan dalam penelitian ini bervariasi. Pada
umumnya makin tinggi tingkat kemurnian DNA, sensitivitas
uji PCR makin meningkat

Tahap Reaksi PCR