IMUNOBIOTEKNOLOGI

IDENTIFIKASI ANTIGEN SALMONELLA TYPHI

DENGAN MICROARRAY

Oleh :
Nosa Ika Cahyariza

NIM :
091724353006

Dosen Pembimbing :
Prof. Dr. Fedik A Rantam, drh

PROGRAM STUDI MAGISTER IMUNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2019

1
 KATA PENGANTAR

Segala puji syukur kehadirat Allah SWT, yang telah memberikan penulis
kemudahan dan kelancaran sehingga penulis dapat menyelesaikan paper yang
berjudul “Identifikasi antigen Salmonella typhi dengan Microarray”. Penyusunan
paper ini merupakan salah satu syarat untuk menyelesaikan tugas akhir semester
mata kuliah Imunobioteknologi. Penulis menyadari bahwa terselesaikannya paper
ini tidak lepas dari dukungan dan bantuan dari banyak pihak. Oleh karena itu pada
kesempatan ini, penulis ingin menyampaikan ucapan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. Fedik A Rantam, drh selaku dosen pengampu mata kuliah
Imunobioteknologi.
2. Teman-teman yang membantu dan memberikan semangat sehingga
terselesainya paper ini.
Penulis menyadari masih banyak ketidak sempurnaan dan kekurangan dalam
penulisan tugas paper ini. Kritik dan saran yang membangun. Semoga paper ini
dapat bermanfaat bagi para pembaca.

Penulis

i
 DAFTAR ISI

Kata Pengantar ......................................................................................... i

Daftar Isi .................................................................................................... ii
Daftar Gambar .......................................................................................... iii
Daftar Tabel............................................................................................... iv

BAB 1 PENDAHULUAN ......................................................................... 1

1.1 Latar Belakang .............................................................................. 1
1.2 Rumusan Masalah ......................................................................... 3
1.3 Tujuan ........................................................................................... 3
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ................................................................ 4
2.1 Definisi Demam Tifoid ................................................................. 4
2.2 Bakteri Salmonella enterica .......................................................... 4
2.3 Faktor Virulensi ............................................................................ 7
2.4 Diagnosis Demam Tifoid .............................................................. 9
2.5 Microarray..................................................................................... 13
BAB 3 METODOLOGI PEMERIKSAAN ............................................. 17
3.1 Bahan Percobaan ........................................................................... 17
3.2 Prosedur Kerja .............................................................................. 17
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 22
4.1 Hasil .............................................................................................. 22
4.2 Pembahasan................................................................................... 34
BAB 5 PENUTUP...................................................................................... 38
5.1 Kesimpulan ................................................................................... 38

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 39

ii
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Salmonella enterica serovar Thypi (S. typhi) ...................... 5

Gambar 2.2 Kesamaan Genetis S. Typhi dan E. coli ................................. 6
Gambar 2.3 Microarray ............................................................................. 14
Gambar 2.4 Representasi skematis dari langkah-langkah microarray....... 16
Gambar 4.1 Komposisi Immunoproteom IgG dan IgM ............................ 24
Gambar 4.2 Profil IgG manusia ................................................................. 26
Gambar 4.3 Profil IgM manusia ................................................................ 28
Gambar 4.4 Tumpang tindih antara profil IgM dan IgG ........................... 28
Gambar 4.5 Immunostrips ......................................................................... 33
Gambar 4.6 Gabungan Na¨ıve bayes classifier pada peringkat antigen
seroreaktif dan serodiagnostik..................................................................... 33

iii
 DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Na¨ıve Bayes memberi peringkat antigen serodominan ............. 34

Tabel 4.2 Na¨ıve Bayes peringkat antigen serodiagnostik ........................ 34

iv
 BAB 1
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Salmonella enterica adalah penyebab paling umum dari infeksi bakteri
gastrointestinal (GI) di seluruh dunia, menyebabkan lebih dari 93 juta infeksi
baru setiap tahun (Marshall & Gunn, 2015). Salmonella enterica serovar
Typhi (S. typhi) adalah patogen yang terdapat pada manusia yang merupakan
penyebab utama tipus. Insiden tifoid yang tinggi telah sering dilaporkan di
wilayah Afrika (Afrika Sub-Sahara), wilayah Asia (India, Indonesia, Cina,
Pakistan, dan Vietnam), Amerika Tengah dan Selatan, Timur Tengah dan
beberapa negara Eropa Selatan dan Timur (J. Kaur & Jain, 2012). Salmonella
typhi menyebabkan demam enterik yang merupakan masalah kesehatan
masyarakat utama, baik di negara berkembang maupun negara maju. Sekitar
21 juta kasus dan 222.000 kematian per tahun disebabkan di seluruh dunia
oleh Salmonella typhi (A. Kaur, Kapil, Elangovan, Jha, & Kalyanasundaram,
2018).
Demam tifoid adalah penyakit bakteri sistemik yang sangat umum di
masyarakat. Penyakit ini ditularkan dari orang ke orang karena
terkontaminasi dengan kotoran, makanan, dan air. Penyebabnya adalah
Salmonella enterica serovar Typhi (S. typhi), yang merupakan inang alami
dan reservoir bagi manusia. Manusia dapat menjadi pembawa kronis dan
penanganan makanan yang buruk dapat menyebabkan kontaminasi dan
penularan S. typhi (Ramani et al, 2018).
Demam tifoid adalah masalah kesehatan global yang signifikan dengan
beban tertinggi di negara berkembang. Tingkat keparahan penyakit ini sering
dianggap remeh, dan saat ini tes diagnostik serologis yang tersedia tidak
memadai karena kurangnya sensitivitas dan spesifisitas yang diperlukan. Hal
ini menggarisbawahi kebutuhan mutlak untuk mengembangkan diagnostik
yang andal dan akurat yang akan bermanfaat bagi pengendalian dan

1
pengobatan penyakit jangka panjang dan untuk memahami beban penyakit
yang sebenarnya. Organisme tipus adalah patogen siluman, dengan
kemampuan untuk mengatur respon imun inang selama infeksi. Namun,
sebagian besar pasien memiliki respon antibodi yang terdeteksi terhadap
polisakarida kapsuler Vi, O (lipopolisakarida), dan antigen H (flagellar)
selama infeksi aktif dan untuk periode yang lama setelahnya. Prevalensi sero
paling tinggi di negara-negara endemik, meskipun titer individu bervariasi
sesuai dengan lokasi geografis, usia, dan tingkat paparan. Hal ini disorot oleh
individu di daerah endemik yang sering memiliki peningkatan antibodi Vi
dan titer antibodi O tanpa riwayat klinis tipus dan oleh ketidakmampuan yang
sering untuk mendeteksi peningkatan respon antibodi pada pasien yang
dikonfirmasi dengan biakan. Tes Widal, pertama kali diperkenalkan pada
tahun 1896, mendeteksi antibodi aglutinating terhadap antigen O dan H dari
S. Typhi. Antigen ini bersifat reaktif silang dengan antibodi dari serovar
Salmonella lain dan bakteri Gram-negatif terkait, menghasilkan tingkat false-
positive yang tinggi. Meskipun demikian, tes Widal masih banyak digunakan
untuk diagnosis tipus di negara berkembang. Tes serologis komersial, seperti
Tubex dan Typhidot, yang biasanya menditrasi dan membedakan IgM dan
IgG terhadap antigen O dan H, dipenuhi dengan keterbatasan yang sama dari
tes Widal, masing-masing memiliki sensitivitas dan spesifisitas masing-
masing sekitar 70% dan 80% (Liang et al., 2013).
Pengetahuan terkini tentang repertoar antigen yang dikenali oleh pasien
selama infeksi tifoid akut jarang terjadi, membatasi interogasi terperinci
terhadap kekebalan, paparan dan menghambat pengembangan vaksin
praklinis. Protein microarray telah digunakan sebelumnya untuk menyelidiki
respon imun alami terhadap banyak infeksi, menambah wawasan tentang
patogenisitas dan riwayat alami infeksi bakteri, virus, dan parasit. Penelitian
pada paper ini bertujuan untuk merinci gambaran komprehensif penargetan
antigenik menggunakan serum dari pasien yang terinfeksi S. Typhi, dengan
demam tifoid aktif dan akut. Di sini dijelaskan identifikasi antigen target IgG

2
 dan IgM spesifik Salmonella setelah infeksi manusia alami setelah memeriksa
microarrays protein yang mewakili >2.700 S. antigen S. Typhi. Studi ini
menyediakan marker antibodi selama infeksi S. Typhi akut, dan
mengidentifikasi antigen baru yang cocok untuk pengembangan vaksin dan
diagnostik.
1.2 Rumusan Masalah
Bagaimana gambaran komprehensif penargetan antigenik menggunakan
serum dari pasien yang terinfeksi S. Typhi, dengan demam tifoid akut maupun
kronis, dan identifikasi antigen target IgG dan IgM spesifik Salmonella setelah
infeksi manusia dengan pemeriksaan microarrays untuk pengembangan vaksin
dan diagnostik?
1.3 Tujuan
Untuk mengetahui gambaran komprehensif penargetan antigenik
menggunakan serum dari pasien yang terinfeksi S. Typhi, dengan demam tifoid
akut maupun kronis, dan identifikasi antigen target IgG dan IgM spesifik
Salmonella setelah infeksi manusia dengan pemeriksaan microarrays untuk
pengembangan vaksin dan diagnostik.

3
 BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Definisi Demam Tifoid

Demam tifoid adalah penyakit yang disebabkan oleh bakteri Salmonella
enterica subsp. enterica serovar Typhi. Patogen yang sangat beradaptasi
dengan manusia ini telah mengembangkan mekanisme luar biasa untuk
kegigihan di inangnya yang membantu memastikan kelangsungan hidup dan
penularannya (Parry, Dougan, White, Farrar, & Hien, 2002). Penyakit ini
disebabkan oleh kurangnya akses terhadap air bersih dan sanitasi, yang
merupakan masalah utama di negara-negara berkembang. Angka kejadian
global demam tifoid diperkirakan mencapai 12 juta kasus dan 130.000
kematian pada tahun 2010. Hal ini melampaui 100 kasus per 100.000 orang /
tahun di negara-negara Asia Tenggara, dan memiliki angka kejadian tinggi di
India (Veeraraghavan et al, 2018).
Infeksi Salmonella pada manusia dapat dikategorikan menjadi dua
jenis: pertama, disebabkan oleh serotipe virulensi rendah Salmonella enterica
yang menyebabkan keracunan makanan, dan kedua disebabkan oleh serotipe
virulensi tinggi Salmonella enterica typhi (S. typhi), yang menyebabkan tipus,
dan kelompok dari serovars, yang dikenal sebagai S Paratyphi A, B dan C,
yang menyebabkan Paratyphoid. Manusia adalah satu-satunya inang dari
kelompok patogen ini. S. typhi adalah patogen spesifik manusia yang sangat
beradaptasi, dan penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini merupakan
masalah kesehatan masyarakat yang serius (Dewan et al, 2013).
2.2 Bakteri Salmonella enterica
Salmonella adalah bakteri anaerob fakultatif Gram-negatif berbentuk
batang yang umumnya berukuran 2-5 mikron dengan lebar 0,5-1,5 mikron
dan motil oleh flagela peritrichous. Ukuran genom Salmonella bervariasi di
antara serovar dengan kisaran 4460 hingga 4857 kb. Salmonella termasuk
dalam keluarga Enterobacteriaceae dan merupakan patogen yang penting

4
secara medis bagi manusia dan hewan. Salmonella membentuk kelompok
bakteri kompleks yang terdiri dari dua spesies dan enam subspesies dan
mencakup lebih dari 2.579 serovar. Dua spesies saat ini dikenal dalam genus
Salmonella, S. enterica dan S. bongori. S. enterica dapat dibagi lagi menjadi
subspesies enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae, dan indica
berdasarkan modifikasi biokimia dan genomik. Mayoritas Salmonellae
adalah fermentor laktosa, produsen hidrogen sulfit, oksidase negatif, dan
katalase positif. Sifat biokimia lain yang memungkinkan identifikasi
Salmonella termasuk kemampuan tumbuh pada sitrat sebagai sumber karbon
tunggal, dekarboksilat lisin, dan hidrolisis urea (Andino & Hanning, 2015).

Gambar 2.1 Salmonella enterica serovar Thypi (S. typhi) (Hardanti et

al, 2018)

Salmonella enterica subspesies enterica serovar Typhi (S. typhi) adalah

bakteri penyebab demam tifoid, infeksi sistemik yang parah dan mengancam
nyawa pada manusia. Beberapa gen S. typhi telah diidentifikasi menggunakan
PCR, seperti gen somatik antigen O (tyv dan prt), gen flagellar antigen H
(fliC-d), dan gen capsular antigen Vi (viaB) (Goay et al., 2016). Antigen O
(somatik), terletak pada lapisan luar, yang mempunyai komponen protein,
lipoposakarida (LPS) dan lipid. Sering disebut endotoksin. Antigen H
(flagella), terdapat pada flagella, fimbriae dan pili dari kuman, berstruktur
kimia protein. Antigen Vi (antigen permukaan), pada selaput dinding kuman

5
untuk melindungi fagositosis dan berstruktur kimia protein (Nasronudin,
2007).
Genom S. enterica serotipe typhi CT18, S. enterica serotipe
typhimurium LT2, dan Escherichia coli pada dasarnya berbentuk garis,
meskipun fakta bahwa E. coli dan S. enterica berbeda. Persyaratan
lingkungan yang serupa untuk bakteri enterik ini mungkin menjelaskan
konservasi urutan gen ini. Cluster gen yang unik untuk bakteri tertentu
cenderung mewakili adaptasi terhadap lingkungan tertentu atau dapat
berkontribusi terhadap patogenisitas. Tidak seperti E. coli, S. enterica
serotipe typhi memiliki beberapa insersi besar dalam genomnya, yang disebut
pulau patogenisitas salmonella, yang dianggap sebagai akuisisi horisontal
baru-baru ini dan yang menyandikan gen yang penting untuk kelangsungan
hidup inang. Selain itu, ada banyak penyisipan banyak blok gen yang lebih
kecil dan gen individu yang tersebar dalam genom yang berpotensi terlibat
dalam patogenisitas (gambar 2.1) (Parry et al., 2002).

Gambar 2.2 Kesamaan Genetis Salmonella enterica Serotype Typhi dan

Escherichia coli. Lingkaran luar menunjukkan potensial pulau-pulau
patogenisitas salmonella (hijau) dan profag (abu-abu). Dua lingkaran
berikutnya ke dalam menunjukkan gen yang disimpan antara S. enterica

6
 serotype typhi dan E. coli (biru) dan gen unik untuk S. enterica serotype typhi
(merah), ditranskripsikan dalam arah searah jarum jam dan berlawanan arah
jarum jam. Lingkaran keempat menunjukkan pseudogen berwarna cokelat.
Lingkaran hitam menunjukkan konten guanin dan sitosin (G + C) secara
grafis, relatif terhadap rata-rata kromosom, dan lingkaran dalam secara grafik
menunjukkan kemiringan G / C, yang didefinisikan sebagai (G - C) / (G + C).
Warna zaitun menunjukkan kemiringan G / C satu atau lebih, dan kemiringan
G / C ungu kurang dari satu (Parry et al., 2002).

S. enterica serotipe typhi CT18 menampung dua plasmid. Plasmid

konjugatif yang lebih besar, pHCM1, adalah panjangnya 218 kb dan berbagi
sekitar 168 kb DNA dengan plasmid R27, dengan identitas urutan lebih dari
99 persen. R27 adalah plasmid incH1, yang pertama kali diisolasi pada 1960-
an dari S. enterica, yang terkait erat dengan plasmid yang resistan terhadap
kloramfenikol yang terdeteksi pada S. enterica serotipe typhi pada 1970-an.
Plasmid pHCM1 mengkodekan resistensi terhadap kloramfenikol (catI),
ampisilin (TEM-1, bla), trimetoprim (dhfr1b), sulfonamid (sulII), dan
streptomisin (strAB). Plasmid yang lebih kecil, pHCM2, memiliki panjang
106,5 kb dan secara fenotip samar, tetapi memiliki homologi yang mencolok
dengan plasmid Yersinia pestis yang terkait dengan virulensi terkait Yersinia
pestis (Parry et al., 2002).
2.3 Faktor Virulensi
Kunci dari faktor virulensi yang diekspresikan oleh sebagian besar
strain S. typhi adalah kapsul polisakarida, disebut antigen Vi (virulensi).
Kapsul Vi dikodekan oleh lokus viaB, yang terdiri dari beberapa gen yang
diperlukan untuk biosintesis dan ekspor kapsul. Dengan tidak adanya kapsul
Vi, S. typhi secara bersifat lebih sensitif terhadap pembunuhan dalam serum
daripada serovar lainnya, seperti S. typhimurium. Kapsul Vi memiliki sifat
imunomodulator yang diduga berkontribusi terhadap patogenesis penyakit,
termasuk membatasi komplemen, mengurangi aktivasi imun, membantu
dengan penghindaran fagositosis, dan menghambat aktivitas bakterisida
serum. Kapsul Vi membentuk komponen utama vaksin tifoid parenteral,

7
termasuk vaksin konjugat baru. Vi-antigen diekspresikan oleh bakteri lain
termasuk Citrobacter freundii, S. Paratyphi C, dan S. dublin.
Genom S. typhi terkenal karena akumulasi beberapa pseudogen, diduga
mencerminkan sifat restriksi host Salmonella tifoid sebagai proses yang
serupa telah diamati pada patogen yang dibatasi host lainnya. Selain itu, S.
typhi memiliki sekitar 300-400 gen spesifik yang tidak ditemukan dalam
serovar Salmonella lainnya. Banyak dari produk gen ini dikodekan di
“Salmonella Pathogenicity Island (SPI)” yang relatif unik untuk S. typhi
(mis., SPI-5, SPI-15, SPI-17, dan SPI-18). Misalnya, S. typhi dan Paratyphi
A memiliki eksotoksin yang disebut typhoid-toksin, yang dipostulatkan
memiliki peran sentral dalam patogenesis demam enterik. Karakterisasi
faktor virulensi yang mungkin memiliki peran penting dalam patogenesis
penyakit (Gibani et al, 2018).
SPI1 dan SPI2 mengkodekan sistem sekresi tipe III, yang memberikan
karakteristik virulensi utama dari S. enterica. SPI1 berperan dalam invasi sel
inang dan peradangan khususnya sel fagositik atau non-fagositik pada
mukosa usus. Pada host, SPI1 menginvasi gen invA, yang ditemukan pada
sebagian besar strain Salmonella. SPI2 diperlukan untuk mengkodekan
protein yang terlibat dalam kelangsungan hidup intraseluler dan replikasi
dalam fagosit. SPI2 juga berkontribusi terhadap penyebaran Salmonella
sistemik. SPI2 mengandung gen spiC yang mengkodekan komponen
struktural dan sekresi dan membantu untuk memulai produksi mediator
dengan fungsi yang cukup besar dalam virulensi Salmonella. spiC juga
terlibat dalam ekspresi komponen filamen flagela dan memainkan peran
penting dalam infeksi Salmonella. SPI3 ada pada semua garis keturunan.
Distribusi SPI4 dan SPI5 belum ditetapkan, meskipun peran mereka
diketahui. SPI4 berperan dalam interaksi awal dengan epitel usus dan
berkontribusi dalam jangka panjang. SPI4 berisi gen orfL, yang diperlukan
untuk kelangsungan hidup dalam makrofag dan mungkin membawa sistem
yang terlibat dalam sekresi racun. SPI5 berperan dalam realisasi beberapa

8
 proses patogen selama infeksi. Gen pertamanya, pipD SPI5, memiliki target
di permukaan atau di dalam sel inang (Dougnon et al., 2017).
2.4 Diagnosis Demam Tifoid
Diagnosis laboratorium demam tifoid didasarkan pada isolasi dan
identifikasi Salmonella typhi dari spesimen klinis seperti darah, tinja, urin,
sumsum tulang, dan aspirasi duodenum melalui kultur, deteksi antibodi
spesifik S. typhi dengan uji serologis dan antigen dengan imunologis uji dan
identifikasi asam nukleat dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) (Sultana
et al, 2016). Diagnosis pasti ditegakkan bila ditemukan adanya kuman S.typhi,
tetapi teerdapat kelemahan seperti waktu yang lama, sulit dilakukan di daerah,
adanya penggunaan antibiotika, jumlah bakteri yang sangat minimal, volume
spesimen yang tidak mencukupi dan waktu pengambilan spesimen yang tidak
tepat (Marleni et al, 2014).
a. Widal
Tes Widal adalah tes yang paling banyak digunakan dalam
diagnosis demam tifoid karena relatif lebih murah, mudah dilakukan dan
membutuhkan pelatihan dan peralatan yang minimal (Andualem et al.,
2014). Tes Widal telah digunakan selama lebih dari satu abad di negara-
negara berkembang untuk diagnosis tetapi telah dilaporkan memiliki
sensitivitas, spesifisitas dan nilai prediksi positif yang rendah
(Lalremruata et al, 2014).
Tes widal didasarkan pada adanya aglutinin (antibodi) dalam
serum individu yang terinfeksi, terhadap antigen H (flagellar) dan O
(somatik) dari Salmonella typhi. Antigen “O” adalah antigen somatik S.
typhi dan digunakan bersama oleh S. paratyphi A, S. paratyphi B, spesies
Salmonella lainnya dan anggota keluarga Enterobacteriaceae lainnya.
Antibodi terhadap antigen O sebagian besar adalah IgM, naik lebih awal
(muncul pada hari ke 6 sampai 8) pada penyakit dan menghilang lebih
cepat. Antigen H adalah antigen flagellar S. typhi, paratyphi A dan
paratyphi B. Antibodi terhadap antigen H keduanya IgM dan IgG,

9
 muncul terlambat (pada hari 10 sampai 12) pada penyakit dan bertahan
untuk waktu yang lebih lama. Diagnosis serologis bergantung pada titer
antibodi dalam sampel dengan interval 10 hingga 14 hari (Sultana et al.,
2016).
Tes Widal memiliki sensitifitas dan spesifisitas rendah. Tes ini
dapat memberikan hasil negatif sampai 30% dari pembuktian tes kultur
yang positif penyakit demam typhoid. Hal ini disebabkan karena
pemberian terapi antibiotik sebelum pemeriksaan dapat menumpulkan
respon antibodi. Prinsip tes Widal adalah pasien dengan demam typhoid
atau demam enteric akan memiliki antibodi di dalam serumnya yang
dapat bereaksi dan beraglutinasi dilusi ganda (Wardana, Herawati, &
Yasa, 2011).
b. Tubex TF
TUBEX® TF merupakan suatu rapid test in vitro dengan metode
Inhibition Magnetlc Binding Immunoasay (IMBI) yang dapat mendeteksi
IgM yang spesifik terhadap antigen O9 Salmonella enterica Serovar
Typhi yang terdapat dalam serum penderita. Interpretasi dari hasil
pemeriksaan ini bersifat semi-kuantitatif yaitu dengan membandingkan
warna yang timbul pada hasil reaksi pemeriksaan dengan wama standar
yang memiliki skor yang terdapat pada kit TUBEX® TF (Ilham,
Nugraha, & Purwanta, 2017).
Antigen LPS O-9 sangat spesifik terhadap salmonella serogrup D
karena mengandung gula yang sangat jarang yaitu epitop α-D-tyvelose
sehingga reaksi silang dengan kuman salmonella nontyphi atau non-
salmonella typhi sangat kecil terjadi. Antigen LPS O-9 adalah tipe
thymus-independent, sangat imunogenik dan responsif terutama pada
anak. Prosedur mudah, praktis, tidak perlu tenaga terlatih dan hasilnya
cepat (Marleni et al., 2014). Secara imunologi, antigen O9 bersifat
imunodominan sehingga dapat merangsang respon imun secara
independent terhadap timus dan merangsang mitosis sel B tanpa bantuan

10
 dari sel T, oleh karena itu respon terhadap antigen O9 berlangsung cepat
sehingga deteksi terhadap anti O9 dapat dilakukan lebih dini, yaitu pada
hari ke 4-5 untuk infeksi primer dan hari ke 2-3 untuk infeksi sekunder
(Nazilah & Suryanto, 2013).
c. Typhidot
Typhidot merupakan suatu pemeriksaan serologi yang didasarkan
pada deteksi antibodi spesifik IgM maupun IgG terhadap Salmonella
enterica Serovar Typhi. Pemeriksaan menggunakan suatu membran
nitroselulosa yang diisi 50-kDa spesifik protein dan antigen kontrol.
Deteksi antibodi IgM menunjukkan tahap awal infeksi pada demam
tifoid akut sedangkan adanya peningkatan IgG menandakan infeksi yang
lebih lanjut. Pada Typhidot-M yang merupakan modifikasi dari metode
Typhidot telah dilakukan inaktivasi dari IgG total sehingga
menghilangkan pengikatan kompetitif dan memungkinkan pengikatan
antigen terhadap IgM spesifik. Walaupun kultur merupakan pemeriksaan
gold standar, perbandingan kepekaan Typhidot-M dan metode kultur
adalah >93%. Typhidot-M sangat bermanfaat untuk diagnosis cepat di
daerah endemis demam tifoid. Hasil positif pada pemeriksaan Typhidot
didapatkan 2-3 hari setelah infeksi dan dapat mengidentifikasi secara
spesifik antibodi IgM dan IgG terhadap antigen Salmonella enterica
Serovar Typhi seberat 50-kDa yang terdapat pada strip nitroselulosa
(Ilham et al., 2017).
d. Pemeriksaan antibodi IgA dari spesimen saliva
Saliva mudah didapatkan dan mengandung IgA dalam jumlah
besar, sehingga dapat memainkan peran penting dalam diagnosis.
Beberapa peneliti telah mencoba memastikan kegunaan mengukur IgA
selama infeksi tifoid. Antibodi IgA saliva meningkat pada tahap akut
penyakit dan deteksi IgA dalam serum dan cairan usus telah dicoba
sebelumnya. Saliva mengandung antibodi IgA konsentrasi tinggi (19 mg
/ ml) bahkan selama periode istirahat, deteksi antibodi IgA saliva selama

11
 fase akut tifoid akan berguna dalam diagnosis dini. Tidak adanya faktor
Rh dalam sekresi saliva meningkatkan spesifisitas pengujian, karena
faktor Rh yang ada dalam serum tampaknya mempengaruhi ELISA
dengan tidak secara spesifik mengikat antigen yang digunakan untuk
melapisi fase padat (Herath, 2003). Pemeriksaan diagnostik yang
mendeteksi antibodi IgA dari lipopolisakarida Salmonella typhi dari
spesimen saliva memberikan hasil positif pada 33/37 (89,2%) kasus
demam tifoid. Pemeriksaan ELISA ini menunjukkan sensitivitas 71,4%,
100%, 100%, 9,1%, dan 0% pada minggu pertama, kedua, ketiga,
keempat, dan kelima perjalanan penyakit demam tifoid (Hadinegoro,
2012).
e. Biakan Bakteri
Diagnosis pasti dengan ditemukan bakteri Salmonella typhi pada
salah satu biakan darah, feses, urine, sumsum tulang ataupun cairan
duodenum. Waktu pengambilan sampel sangat menentukan keberhasilan
pemeriksaan bakteriologis tersebut. Misalnya, biakan darah biasanya
positif pada minggu pertama perjalanan penyakit, biakan feses dan urine
positif biasanya pada minggu kedua dan ketiga, biakan sumsum tulang
paling baik karena tidak dipengaruhi waktu pengambilan ataupun
pemberian antibiotika sebelumnya. Kemungkinan ditemukannya biakan
yang positif pada sumsum tulang (84%), pada darah (44%), feses (65%),
cairan duodenum (42%) (Rampengan, 2008).
Hasil biakan yang positif memastikan demam tifoid, akan tetapi
hasil biakan negatif tidak mengenyampingkan diagnosis demam tifoid,
karena hasilnya bergantung pada beberapa faktor. Faktor-faktor yang
mempengaruhi hasil biakan adalah jumlah darah yang diambil, perbaikan
volume darah dengan media empedu dan waktu pengambilan sampel.
Media pembiakan yang direkomendasikan untuk Salmonella typhi
adalah media empedu (Gall) dari sapi, dimana media ini dapat

12
 meningkatkan positifitas hasil karena hanya Salmonella typhi yang dapat
tumbuh pada media tersebut (Hasibuan, 2009).
f. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Nested Polymerase Chain Reaction (PCR) menghasilkan fragmen
teramplifikasi yang terlihat setelah elektroforesis gel agarosa. Seluruh
prosedur untuk mengidentifikasi DNA S. typhi dalam darah dengan
elektroforesis gel agarosa hanya membutuhkan waktu 16 jam,
menunjukkan PCR menjadi metode spesifik dan cepat untuk diagnosis
dini demam tifoid. Selama 10 tahun ke depan, beberapa penelitian telah
melaporkan metode PCR yang menargetkan gen flagelin, gen somatik,
gen antigen Vi, area spacer 5S-23S dari gen RNA ribosom, gen invA dan
gen hilA dari S. typhi untuk diagnosis demam tifoid (Sultana et al., 2016).
Penelitian Ambati di India pada tahun 2007 mendapatkan
pemeriksaan PCR dari darah dan urine memiliki sensitivitas 82% dan
spesifitas 100%. Kendala yang sering dihadapi pada pemeriksaan ini
meliputi risiko kontaminasi yang menyebabkan positif palsu yang terjadi
bila prosedur teknis tidak dilakukan secara cermat, adanya bahan-bahan
dalam spesimen yang bisa menghambat proses PCR (hemoglobin dan
heparin dalam spesimen darah serta bilirubin dan garam empedu dalam
spesimen feses), biaya yang cukup tinggi dan teknis yang relatif rumit
(Sucipta, 2015).
2.5 Microarray
Teknologi microarray adalah salah satu alat yang digunakan oleh
banyak ahli biologi untuk memantau tingkat genome ekspresi gen dalam
organisme tertentu. Microarray biasanya merupakan slide kaca di mana
molekul DNA dipasang secara teratur di lokasi tertentu yang disebut bintik-
bintik (fitur). Microarray mengandung ribuan bintik-bintik dan setiap bintik
mengandung jutaan salinan molekul DNA identik yang secara unik sesuai
dengan gen (Aydadenta & Adiwijaya, 2018).

13
 Microarray memberikan dasar untuk genotipe ribuan lokus berbeda
pada suatu waktu, yang berguna untuk studi asosiasi dan hubungan untuk
mengisolasi daerah kromosom yang terkait dengan penyakit tertentu.
Microarray ini juga dapat digunakan untuk menemukan penyimpangan
kromosom yang berhubungan dengan kanker, seperti segmen
ketidakseimbangan alelik, yang dapat diidentifikasi dengan hilangnya
heterozigositas. Dengan teknik hibridisasi genomik komparatif pada DNA
genomik, daerah yang diamplifikasi atau dihapus dalam kromosom dapat
diidentifikasi (Kaliyappan, Palanisamy, Govindarajan, & Duraiyan, 2012).

Gambar 2.3 Sebuah microarray dapat berisi ribuan tempat. Setiap tempat
mengandung banyak salinan dari urutan DNA yang sama yang secara unik
mewakili gen dari suatu organisme. Tempat-tempat diatur secara teratur ke
dalam Pengroups (Aydadenta & Adiwijaya, 2018).

Mikroarray hibridisasi DNA umumnya dibuat pada substrat kaca,

silikon, atau plastik. Microarray memiliki ratusan hingga ribuan situs uji yang
dapat berkisar dari 10 hingga 500 mikron. Microarrays kepadatan tinggi
memiliki hingga 106 lokasi uji dalam area 1-2 cm2. Probe DNA secara

14
selektif terlihat atau ditujukan ke masing-masing lokasi pengujian dengan
berbagai teknik. Probe dapat mencakup oligonukleotida sintetis, amplikon,
atau fragmen DNA / RNA yang lebih besar. Probe DNA dapat secara kovalen
atau nonkovalen melekat pada bahan pendukung. Bergantung pada format
array, probe dapat menjadi sekuens DNA atau RNA target yang mana
"reporter probe" lainnya selanjutnya akan digabungkan. Konstruksi
sebenarnya dari microarray melibatkan imobilisasi atau sintesis in situ dari
probe DNA ke lokasi uji spesifik bahan pendukung padat atau substrat.
Susunan DNA berdensitas tinggi dapat dibuat menggunakan teknik
penyampaian fisik (mis., Teknologi pengendapan inkjet atau mikrojet) yang
memungkinkan pengeluaran dan penandaan volume nano / picoliter ke lokasi
lokasi uji spesifik pada microarray. Dalam beberapa kasus, probe atau
oligonukleotida pada microarray disintesis in situ menggunakan proses
fotolitografi. Perangkat microarray dengan kepadatan lebih rendah dari lokasi
pengujian telah dikembangkan yang menyediakan deteksi elektronik
langsung dari reaksi hibridisasi. Perangkat microarray elektronik aktif yang
menyediakan pengalamatan elektronik atau bercak probe serta analisis
hibridisasi berkinerja tinggi yang cepat sekarang juga tersedia untuk
penelitian dan aplikasi diagnostik (Heller, 2002).
Microarray dapat dibedakan berdasarkan karakteristik seperti sifat
probe, dukungan permukaan padat yang digunakan, dan metode spesifik yang
digunakan untuk mengatasi probe dan / atau deteksi target. Ditinjau dari
metodologi printed and in situ-synthesized microarrays, high-density bead
arrays, dan electronic and suspension bead microarrays. Dalam semua
pendekatan ini, probe mengacu pada sekuens DNA yang terikat pada
permukaan padat dalam microarray, sedangkan targetnya adalah sekuens
yang “tidak diketahui”. Secara umum, probe disintesis dan diimobilisasi
sebagai fitur diskrit, atau bintik-bintik. Setiap fitur berisi jutaan probe identik.
Target diberi label dengan fluoresensi dan kemudian diseragamkan ke probe
microarray. Hibridisasi yang sukses antara target yang berlabel dan probe

15
yang tidak bergerak akan menghasilkan peningkatan intensitas fluoresensi
pada tingkat latar belakang, yang dapat diukur menggunakan pemindai
fluoresen. Data fluoresensi kemudian dapat dianalisis dengan berbagai
metode. Rincian eksperimental termasuk panjang dan sintesis probe, jumlah
fitur yang mungkin (yaitu, kepadatan microarray), dan permukaan padat yang
digunakan bervariasi tergantung pada jenis microarray yang digunakan
(Miller & Tang, 2009).

Gambar 2.4 Representasi skematis dari langkah-langkah yang terlibat dalam

microarray. (A) Panel atas menggambarkan teknologi dua saluran, sedangkan
(B), panel bawah menggambarkan teknologi saluran tunggal.
ContohpPercobaan ini dirancang untuk membandingkan profil ekspresi
mRNA plasenta dari wanita dengan kehamilan normal dengan plasenta dari
pasien dengan pre-eklampsia (penyakit). mRNA dari plasenta diekstraksi.
Pada panel A, mRNA normal dan penyakit diberi label dengan dua pewarna
yang berbeda, dicampur dan kemudian diseragamkan pada array yang sama.
Setelah dicuci, susunan dipindai pada dua panjang gelombang yang berbeda
untuk menghasilkan dua gambar: satu untuk plasenta pasien normal dan satu
untuk plasenta pasien dengan preeklampsia. Pada panel B (saluran tunggal),
masing-masing sampel diberi label dengan pewarna fluoresen yang sama,
tetapi secara hibridisasi pada array yang berbeda (Tarca, Romero, & Draghici,
2006).

16
 BAB 3
METODOLOGI PEMERIKSAAN

3.1 Bahan Percobaan

3.1.1 Sampel
Sampel dalam penelitian ini berupa serum. Untuk keperluan
penelitian ini, serum dikumpulkan dari individu dengan demam tifoid
akut dan dari kelompok kontrol tanpa penyakit yang berasal dari studi
epidemiologi atau klinis. Untuk semua pasien demam akut dengan
etiologi yang dikonfirmasi, serum dipisahkan dari 2 ml darah vena
dalam waktu tiga hari demam dan masuk rumah sakit. Anak-anak
terdaftar dengan kriteria yang sama dengan orang dewasa, dan tidak
ada anak-anak yang berusia 1 tahun karena pertimbangan etis dalam
mengambil volume darah yang diperlukan untuk serologi.
Sekelompok 27 individu kontrol tanpa gejala demam tifoid
sebelumnya diuji.
3.2 Prosedur Kerja
3.2.1 Fabrikasi dan Pemeriksaan Microarray
Gen diamplifikasi dan dikloning menggunakan PCR
highthroughput dan metode rekombinasi. ORF dari genomik DNA S.
Typhi TY2 diidentifikasi menggunakan GenBank NC_004613 dan
diamplifikasi menggunakan primer spesifik gen yang mengandung 20
bp nukleotida ekstensi komplementer ke ujung vektor pXT7 linier,
yang memungkinkan rekombinasi homolog antara produk PCR dan
vektor pXT7 dalam sel DH5a yang kompeten. Protein fusi yang
dihasilkan juga mengandung epitop hemagglutinin pada ujung 39 dan
polihistidin pada ujung 59. ORF dengan panjang lebih dari 3 kb
dipecah menjadi beberapa segmen tumpang tindih dalam bingkai yang
lebih pendek dari 3 kb untuk kloning. Plasmid diekspresikan pada
24°C selama 16 jam dalam sistem transkripsi/translasi E. coli secara

17
 in-vitro (kit jalan bebas hambatan dari Invitrogen). Tanpa kontrol
DNA, tidak ada DNA plasmid yang ditambahkan ke jumlah reagen
yang sama dari transkripsi / translasi E.coli sistem in vitro untuk
menguji reaktivitas latar belakang E.coli.
Untuk microarray, 10 ml reaksi dicampur dengan 3,3 ml 0,2%
Tween 20 untuk memberikan konsentrasi akhir 0,05% Tween 20, dan
dicetak ke kaca dilapisi nitroselulosa FAST slide (Whatman)
menggunakan printer microarray Omni Grid 100 (Genomic
Solutions). Ekspresi dan pencetakan protein dipantau oleh
immunoprobing dengan anti-polyhistidine (clone-1, Sigma) dan anti-
hemagglutinin (clone 3F10, Roche). Lipopolysaccharide Salmonella
enterica dan lipopolysaccharide E.coli didapatkan dari Sigma dan
dicetak pada 0,1 mg / mL dan 0,01 mg / mL (L6511, L2880, Sigma).
Sampel serum manusia diencerkan menjadi 1: 200 dengan 10 mg / ml
E. coli lysate (Mclab). Slide microarray diinkubasi dalam antibodi
sekunder yang terkonjugasi biotin (Jackson ImmunoResearch)
diencerkan 1/200 dalam buffer penyumbat, dan dideteksi dengan
inkubasi dengan SureLightH P-3 bertingkat yang terkonjugasi
berkonjugasi P-3 (Columbia Biosciences). Slide dicuci dan di udara
kering dengan sentrifugasi singkat. Slide microarray dipindai dan
dianalisis menggunakan pemindai microarray HT Perkin Elmer
ScanArray Express. Intensitas diukur menggunakan perangkat lunak
QuantArray. Semua intensitas sinyal dikoreksi untuk latar belakang
spesifik tempat. Semua intensitas sinyal dikoreksi untuk latar
belakang spesifik tempat.
3.2.2 Ekspresi Protein dan Pemeriksaan Imunostrips
Enam plasmid yang diamati adalah koloni tunggal yang
dimurnikan dan diubah menjadi sel BL21. Koloni tunggal diambil dan
diinokulasi ke dalam 3 ml LB dengan 50 ug / ml Kanamycin dan
diinkubasi semalaman dengan suhu 37°C pada 300 rpm. Kultur

18
 semalam dipindahkan ke TB sampai OD600 nm mencapai 0,6.
Isopropil b-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) kemudian
ditambahkan pada 0,4 mM dan protein diinduksi selama 3 jam dengan
suhu 30°C pada 200 rpm. Sel dipanen dan dilisiskan dalam larutan
Bugbuster 1% (Novagen). Pelet yang tersisa dilarutkan dalam urea 7
M, dan disaring melalui filter 0,2 mm. Protein kemudian diukur dan
dicetak pada sekitar 0,1 mg / ml pada Optitran BA-S 85 0,45 mm
Nitroselulosa membran (Whatman) menggunakan BioJet dispenser
(BioDot). Membran kemudian dipotong menjadi strip 3 mm.
Untuk pemeriksaan immunostrips, serum manusia diencerkan
menjadi 1/200 dalam larutan susu kering tanpa lemak 5% dilarutkan
dalam 10 mM Tris (pH 8,0) dan 150 mM NaCl yang mengandung
0,05% (v / v) Tween 20 (T-TBS) yang mengandung 10 mg / ml E. coli
lysate (McLab). Setiap strip kemudian diinkubasi dengan serum
pretreated selama 2 jam pada suhu kamar dengan pencampuran halus.
Strip dicuci secara luas dan kemudian diinkubasi dalam keledai alkali
fosfatase terkonjugasi anti-manusia imunoglobulin (anti-IgG, khusus
fragmen Fcc, Jackson ImmunoResearch) antibodi sekunder,
diencerkan menjadi 1/2000, dan setelah dicuci secara luas, pita reaktif
divisualisasikan dengan menginkubasi dengan 1-StepTM Nitro-Blue
Tetrazolium Chloride / 5-Bromo-4-Chloro-39-Indolyphosphate p-
Toluidine Salt (NBT / BCIP) yang mengembangkan buffer (Thermo
Fisher Scientific). Immunostrip dipindai dengan pemindai dokumen
Hewlett-Packard, dan dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak
Image J (NIH).
3.2.3 Analisis Data
Semua analisis dilakukan dengan menggunakan statistik R
(http://www.r-project.org) dan perangkat lunak statistik SAS
(http://www.sas.com/). Metode vsn diimplementasikan sebagai
bagian dari rangkaian Bioconductor (www.bioconductor.org)

19
diterapkan pada intensitas array terkuantifikasi. Selain menghapus
heteroskedacity, prosedur ini mengoreksi efek noise non-spesifik
dengan menemukan kemungkinan maksimum pergeseran dan
parameter penskalaan untuk setiap array sehingga varians probe
kontrol diminimalkan. Antigen dianggap 'serodominan' dengan
reaktivitas rata-rata di antara pasien tifoid yang lebih besar dari 3 kali
standar deviasi di atas rata-rata kontrol DNA. Antigen protein dengan
banyak segmen dianggap ‘serodominan’ jika satu atau lebih segmen
protein ini ‘serodominan’.
Biomarker diagnostik tifoid ditentukan dengan membandingkan
tifoid dan kelompok kontrol menggunakan uji t yang diatur Bayes
yang diadaptasi dari Cyber-T untuk susunan protein. Untuk
menjelaskan beberapa kondisi pengujian, metode Benjamini dan
Hochberg (BH) digunakan untuk mengontrol tingkat penemuan palsu.
Setelah koreksi Benjamini dan Hochberg, nilai p yang lebih kecil dari
0,05 dianggap signifikan, dan protein yang sesuai dianggap berbeda
diakui atau serodiagnostik, sedangkan protein yang tidak dikenali
secara berbeda atau protein reaktif memiliki nilai p lebih besar
daripada 0,05. Pengganda multipleks dibangun menggunakan Support
Vector Machines (SVMs) linear dan non-linear menggunakan paket R
‘e1071’. SVM adalah metode pembelajaran terawasi yang telah
berhasil diterapkan pada data microarray yang ditandai dengan ukuran
sampel kecil dan sejumlah besar atribut. Pendekatan SVM, seperti
halnya pendekatan klasifikasi terawasi lainnya, menggunakan dataset
pelatihan untuk membangun model klasifikasi dan set pengujian
untuk memvalidasi model. Untuk menghasilkan set pelatihan dan
pengujian yang tidak bias, Leave One Out Cross-Validation
(LOOCV) digunakan. Dengan metodologi ini, setiap titik data diuji
dengan pengklasifikasi yang dilatih menggunakan semua titik data

20
yang tersisa. Plot kurva Receiver Operating Characteristic (ROC)
dibuat dengan paket R ‘ROCR’.
Program-program berikut digunakan untuk prediksi komputasi
fitur struktural. TMHMM v2.0 digunakan untuk prediksi domain
transmembran (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), SignalP
v3.0 untuk prediksi sinyal peptida (http://www.cbs.dtu.dk/ layanan /
SignalP /), PSORTb v3.0. perangkat lunak untuk prediksi lokasi
seluler (http://www.psort.org/psortb/). Alat PI / MW dari Swiss
Institute of Bioinformatics digunakan untuk menentukan titik isolasi
(http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html). Nilai P untuk analisis
statistik pengayaan dihitung menggunakan uji eksak Fisher di
lingkungan R. Suatu gabungan pendekatan pengklasifikasi naif Bayes
yang awalnya diterapkan oleh kami untuk mengklasifikasikan antigen
dari proteom Francisella tularensis, digunakan di sini untuk
menentukan peringkat semua protein Salmonella.

21
 BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.1 Amplifikasi gen, kloning dan ekspresi protein
Satu set 2.724 ORF dari S. Typhi TY2, mewakili sekitar 63%
dari genome S. Typhi, dipilih untuk skrining. ORF ini diprioritaskan
menggunakan marker yang ditemukan dengan diperkaya antigen
seroreaktif pada spesies bakteri lainnya. Fitur-fitur ini termasuk: motif
sinyal peptida, protein dengan karakteristik 'membran luar',
'periplasma', 'heat shock', 'chaperon', 'transport protein', 'lipoprotein',
atau 'virulensi'. Untuk meminimalkan potensi reaktivitas silang latar
belakang, protein yang non-homolog (< 50% diidentifikasi pada
tingkat asam amino) terhadap E. coli juga dipilih. ORFs S. Typhi TY2
yang diklon dalam vektor pXT7 diekspresikan di bawah promotor T7
dalam sistem transkripsi / terjemahan E.coli in vitro, dicetak pada
microarray. Dengan mendeteksi ekspresi HA- atau HIS-tag, dapat
mengkonfirmasi 96% ekspresi dari protein (Gambar 4.1).
4.1.2 Profil IgG manusia dan identifikasi antigen IgG serodiagnostik.
Susunan protein yang disusun diperiksa dengan serum dari 34
pasien tifoid akut. IgG dan IgM immunoproteome, didefinisikan
sebagai jumlah total antigen yang bereaksi dengan serum dari
setidaknya 1 pasien tifoid akut, masing-masing terdiri dari 2.442
(89%) dan 809 (30%) antigen (Gambar 4.1). Subset dari proteom IgG,
yang terdiri dari 127 antigen diidentifikasi sebagai serodominan
(Bahan dan Metode, Analisis Data) (Gambar 4.2A, 4.2B, 4.2C)
dengan 16 antigen yang ditemukan secara signifikan serodiagnostik
(kemampuan untuk membedakan antara serum dari pasien tifoid akut
dan serum kontrol) (Benjamini dan Hochberg menyesuaikan nilai
Cyber-T p, 0,05). Karena ada homologi DNA yang luas dalam genus

22
Salmonella, dibandingkan seroreaktivitas pasien tifoid dengan infeksi
Salmonella nontyphoidal dari penelitian yang diterbitkan sebelumnya
(Gambar 4.2A). Ditemukan 1 dari 16 antigen tifoid serodiagnostik
(t1459), adalah juga serodiagnostik untuk pasien Salmonella
nontyphoidal. Enam dari 16 antigen serodiagnostik juga dapat
membedakan antara pasien tifoid Vietnam dan pasien Salmonella
nontyphoidal dari Afrika. 10 antigen yang tersisa bereaksi sama antara
kedua kelompok.
Selain LPS dari Salmonella enterica dan E. coli, diidentifikasi
111 antigen lebih lanjut (termasuk antigen H; ORF t0918) yang
bereaksi secara sebanding di antara semua sampel serum, terlepas dari
apakah dari kasus tipus atau dari kontrol yang tidak terinfeksi
(Gambar 4.2). Antigen cross-reactive ini mungkin mengindikasikan
paparan Salmonella di masa lalu, dan penggunaan antigen ini harus
dihindari secara selektif sebagai penanda serodiagnostik untuk tipus
akut di masa depan. Enam dari antigen cross-reactive ini berbagi
homologi dengan antigen S. Typhimurium dan secara reaktif berbeda
antara pasien Salmonella nontyphoidal dan kontrol. Selain itu, ketika
dibandingkan seroreaktivitas antara populasi manusia yang berbeda,
respon antibodi keseluruhan yang lebih tinggi secara keseluruhan
pada kelompok kontrol daripada dalam serum dari daerah
nonendemik.
Untuk menilai kemampuan antigen serodiagnostik untuk secara
akurat membedakan antara kasus kontrol dan kasus tipus, dibuat
‘leave one out cross-validation (LOOCV) receiver operating
characteristic (ROC) ’(Gambar 4.2D). Antigen serodiagnostik
dipesan dengan menurunkan nilai p BH yang dikoreksi. Digunakan
metode kernel dan mendukung mesin vektor untuk membangun
pengklasifikasi linear dan nonlinear. Sebagai input ke pengklasifikasi,
digunakan antigen peringkat 1, 3, 5, 10, dan 16 tertinggi. Hasilnya

23
 menunjukkan bahwa peningkatan jumlah antigen dari 1 ke 10
menghasilkan peningkatan signifikan dalam sensitivitas dan
spesifisitas (Gambar 2D). Ini optimal untuk 10 antigen, dengan
pengklasifikasi ini menghasilkan sensitivitas 98% dan spesifisitas
80%.

Gambar 4.1 Komposisi Immunoproteom IgG dan IgM. (A) IgG

immunoproteome terdiri dari 89% antigen yang dikloning. Ada 2.442 antigen
dengan respons IgG yang terdeteksi dalam setidaknya 1 sampel akut (3% dari
semua sampel akut), 1608 antigen reaktif pada setidaknya 9% dari semua sampel
akut, 38 antigen reaktif pada setidaknya 50% dari semua sampel akut dan 1
antigen reaktif pada 94% sampel akut. (B) IgM imunoproteom terdiri dari 30%
antigen yang dikloning. Ada 809 antigen yang reaktif dalam setidaknya 1 (3%)
sampel akut, 410 antigen pada setidaknya 9% dari sampel akut yang jatuh, 36
antigen dalam setidaknya 50% dari sampel akut, dan 118 antigen reaktif dalam
10-34 sampel.

4.1.3 Profil IgM manusia

Mengukur respons IgM adalah pendekatan yang paling cocok
untuk membedakan antara tahap awal infeksi akut dan kontrol yang
sehat. Ringkasan tanggapan IgM ditunjukkan pada Gambar 3A. Dapat
mengidentifikasi 77 antigen yang membedakan antara populasi
kontrol dan mereka dengan tifoid akut (nilai p terkoreksi-BH, 0,05;
Gambar 4.3B). Reaktivitas keseluruhan terhadap 77 antigen pada
kelompok kontrol rendah, dengan peningkatan respons terhadap
sejumlah antigen yang terdeteksi hanya dalam sejumlah kecil sampel

24
serum, yang memprediksi tingkat sensitivitas dan spesifisitas
serodiagnostik yang lebih besar daripada respons antigen IgG. Selain
itu, reaktivitas pada pasien tifoid secara signifikan lebih besar
dibandingkan dengan kelompok kontrol, menunjukkan respon IgM
yang kuat selama infeksi tifoid akut. Dua puluh dua antigen yang
bereaksi serupa di antara semua sampel manusia juga diidentifikasi,
yang menandakan reaktivitas silang antigenik yang tidak spesifik
(Gambar 4.3).
Kurva karakteristik operasi Receiver Operating Characteristic
(ROC) dihasilkan untuk menilai akurasi respon IgM terhadap 77
antigen untuk membedakan antara pasien tifoid akut dan kontrol
(Gambar 4.3). Kandidat antigen serodiagnostik terhadap IgM diberi
peringkat dengan menurunkan nilai-nilai p terkoreksi BH,
menunjukkan sensitivitas dan spesifisitas yang meningkat dari 1
hingga 30 antigen. Golongan ini menghasilkan tingkat sensitivitas dan
spesifisitas 97% dan 91%, masing-masing untuk 30 antigen IgM
teratas, namun menggabungkan semua 77 antigen menghasilkan
penurunan sensitivitas hingga 90%, dengan spesifisitas tersisa di 91%.

25
Gambar 4.2 Profil IgG manusia. Susunan yang mengandung 2724 protein
S.enterica diperiksa dengan serum dari pasien tipus akut, dan subyek kontrol di
Vietnam dan Amerika Serikat. (A) Heat map menunjukkan intensitas sinyal

26
dengan warna merah terkuat, hijau terang terlemah dan hitam di antaranya.
Hanya antigen serodiagnostik (nilai p dikoreksi Benjamini Hochberg <0,05)
yang ditampilkan. Sampel manusia dalam kolom dan diurutkan dari kiri ke
kanan dengan meningkatkan intensitas rata-rata untuk antigen serodiagnostik.
Satu antigen bertanda merah, t1459, juga ditemukan serodiagnostik untuk
salmonellosis nontyphoidal di Afrika. (B) Reaktivitas antigen lintas-reaktif
(Benjamini Hochberg dikoreksi nilai p >0,05) ditunjukkan dalam heat map. (C)
Reaktivitas IgG rata-rata antigen dibandingkan antara pasien tifoid akut dan
kontrol endemik. Antigen dengan Benjamini Hochberg dikoreksi nilai-p kurang
dari 0,05 diorganisasikan ke kiri dan antigen reaktif silang ke kanan. 16 antigen
serodiagnostik dan 22 antigen cross-reaktif paling reaktif ditampilkan. (D)
Grafik LOOCV ROC menunjukkan pengklasifikasi dengan meningkatnya
jumlah antigen IgG serodiagnostik manusia.

27
Gambar 4.3 Profil IgM manusia. Susunan S.enterica diperiksa untuk respon IgM
dengan serum dari pasien tifoid akut manusia dan subyek kontrol di Vietnam. (A)
Antigen terdaftar pada sumbu vertikal, dan masing-masing donor berada di atas.
Hanya antigen IgM serodominant yang ditampilkan. Antigen-antigen ini
disubklasifikasi oleh Benjamini Hochberg yang mengoreksi nilai uji T cyber
untuk menjadi diskriminatif (p >0,05; n577) dan non-diskriminatif (p <0.05;
n522) dengan membandingkan kelompok kontrol endemik dengan pasien tifoid
di Vietnam. Antigen diurutkan berdasarkan respons rata-rata dari kelompok
pasien tifoid, dan donor diurutkan dari kiri ke kanan dengan meningkatkan sinyal
rata-rata. (B) Reaktivitas IgM rata-rata antigen dibandingkan antara pasien tifoid
dan kontrol endemik. Antigen dengan Benjamini Hochberg dikoreksi nilai-p
kurang dari 0,05 diorganisasikan ke kiri dan antigen reaktif silang ke kanan. (C)
Grafik LOOCV ROC menunjukkan pengklasifikasi dengan meningkatnya jumlah
antigen IgM serodiagnostik manusia. Secara keseluruhan, semua 77 antigen
menghasilkan sensitivitas dan spesifisitas masing-masing 90% dan 91%.

4.1.4 Peralihan kelas dari IgM ke IgG.

Peralihan kelas imunoglobulin dari IgM ke isotipe lain adalah
komponen indikatif pematangan respons imun. Tingkat tumpang
tindih profil IgG dan IgM dari kontrol yang tidak terinfeksi dan pasien
tifoid diilustrasikan pada Gambar 4.4. Ada total 199 antigen
seroreaktif IgM dan IgG, 30 di antaranya secara konsisten dideteksi
antara IgM dan IgG, yang mengindikasikan perpindahan kelas. Lebih
lanjut, 69 antigen diamati dalam profil IgM tetapi bukan profil IgG,
dan 100 antigen tambahan diamati dalam profil IgG tetapi tidak pada
profil IgM.

28
Gambar 4.4 Tumpang tindih antara profil IgM dan IgG. Plot pencar dari respons
IgG dan IgM rata-rata yang sesuai terhadap 199 antigen target IgM dan IgG
gabungan yang membedakan antara kontrol negatif dan individu tifoid Garis
titik-titik horizontal dan vertikal masing-masing merupakan cut-off positif untuk
IgM dan IgG, yang didefinisikan sebagai rata-rata13SD dari titik kontrol
susunan 'no-DNA'.

4.1.5 Validasi akurasi serodiagnostik dengan immunostrips.

Untuk mengetahui potensi diagnostik antigen serodiagnostik,
enam protein serodiagnostik diekstraksi dari badan inklusi E. coli
BL21 in vitro (Gambar 4.5A), dan dicetak ke membran Nitroselulosa,
yang mewakili uji analitik sederhana. Imunostrip diperiksa dengan
serum dari 16 pasien tifoid akut dan 14 kontrol. Serum dari 16 pasien
tifoid menunjukkan reaktivitas yang lebih besar daripada serum dari
kontrol (Gambar 4.5B). Untuk menilai kemampuan enam antigen ini
untuk membedakan antara tipus dan kontrol, kurva LOOCV ROC
dihasilkan (Gambar 4.5C), dan menunjukkan bahwa enam antigen
yang dipilih menghasilkan sensitivitas 94% dan spesifisitas 100%.
4.1.6 Analisis pengayaan
Untuk memahami sifat respon imun terhadap S. Typhi,
dilakukan analisis rinci antigen IgG serodominan dan serodiagnostik.
Protein dijelaskan menggunakan kategori fungsional NCBI Clustered
Orthologous Group (COG), dan dalam prediksi silico dibuat untuk
domain transmembran, sinyal peptida, lokalisasi subseluler dan titik

29
isoelektrik (pI) dan dibandingkan dengan data spektrometri massa
yang dipublikasikan.
Protein dengan fungsi COG-M yang diprediksi, yang terlibat
dalam biogenesis selubung dan membran luar, diperkaya 1,8 kali lipat
dalam antigen serodominan (p = 3.42E-02) dan protein dengan fungsi
COG-N yang diprediksi, terlibat dalam motilitas dan sekresi sel,
adalah 2.0 kali lipat diperkaya dengan antigen serodominan. Protein
dengan fungsi COG-O yang diprediksi, modifikasi pasca translasi,
pergantian protein, chaperone, juga secara signifikan diperkaya pada
2,6 dan 5,5 kali lipat dalam serodominant (p = 2.15E-03) dan antigen
serodiagnostic (p = 1.53E-02), masing-masing. Sebaliknya, protein
dengan prediksi fungsi COG-G (transport karbohidrat dan
metabolisme) atau COG-K (transkripsi) secara signifikan kurang
terwakili dalam antigen serodominan.
Protein dengan satu domain transmembran juga secara
signifikan diperkaya dalam kelompok antigen serodominan dan
serodiagnostik, dengan protein yang kurang dari domain
transmembran atau lebih dari satu domain transmembran yang kurang
terwakili. Protein yang diprediksi dengan peptida sinyal (skor SignalP
> 0,7) secara signifikan diperkaya pada 2,0 kali lipat dan protein tanpa
peptida sinyal secara signifikan kurang terwakili. PSortb
memperkirakan 19 antigen periplasmik serodominan dan dua
serodiagnostik, masing-masing menghasilkan pengayaan 3,4 dan 2,9
kali lipat (masing-masing p = 1,28E-06 dan 1,53E-01). Namun,
protein membran sitoplasma dan sitoplasmik pSortb 0,5 dan 0,4 kali
lipat tidak terwakili dalam kelompok antigen serodominan.
Ditemukan bahwa protein dengan pI 9-14 adalah 0,7 kali lipat kurang
terwakili dalam kelompok antigen serodominan.
Sebagaimana didukung oleh penelitian sebelumnya (Liang et
al., 2011), ditemukan bahwa tingkat ekspresi protein merupakan

30
 faktor penting yang berkontribusi terhadap antigenisitas. Sebuah studi
spektrometri massa terbaru dari protein S. Typhi TY2
mengidentifikasi 2.062 protein yang diekspresikan, di antaranya, 923
protein diwakili dalam penelitian ini. Hasil ini menunjukkan bahwa
ekspresi adalah fitur pengayaan yang signifikan, dengan peningkatan
1,6 kali lipat dalam antigen serodominan (p = 8,11E-06). Lebih lanjut,
ketika jumlah peptida yang terdeteksi meningkat, pengayaan lipatan
juga meningkat. Ada 1,9 kali lipat pengayaan antigen serodiagnostik
dalam protein yang terdeteksi dengan setidaknya 10 peptida (p =
4,30E-02), 3,3 kali lipat dalam protein yang terdeteksi dengan
setidaknya 50 peptida (p = 2,81E-02). Namun, protein yang tidak
diidentifikasi oleh MS kurang terwakili pada 0,7 kali lipat antara
antigen serodominan dan serodiagnostik.
4.1.7 Pemeringkatan antigenitas antigen menggunakan classifier Na¨ıve
Bayes
Untuk mengetahui hubungan antara fitur proteomik dan
seroreaktivitas, digunakan skema klasifikasi Bayes naif untuk
menentukan peringkat antigenisitas semua protein S. Typhi pada chip.
Rasio kemungkinan dihitung menggunakan semua fitur proteomik
untuk semua protein yang diwakili dalam chip, protein diberi
peringkat sesuai dengan perhitungan ini untuk IgG dan antigen
serodominant atau serodiagnostik gabungan IgM.
Analisis menunjukkan bahwa perlu menyaring hanya 5% dari
genom untuk mengidentifikasi 9% dari semua antigen IgG dan IgM
seroreaktif, dan 25% dari semua antigen serodiagnostik (Gambar 4.6,
Tabel 4.1 dan Tabel 4.2), menghasilkan 1,84- dan pengayaan 5,01 kali
lipat, masing-masing. Oleh karena itu, ketika jumlah protein
meningkat, lebih banyak antigen seroreaktif dan serodiagnostik
diidentifikasi. Tepatnya 72% dari antigen serodiagnostik berada
dalam 25% teratas dari daftar peringkat antigen, namun 50% dari

31
proteom perlu diuji untuk mengidentifikasi 72% dari serangan
seroreaktif. Data ini menunjukkan bahwa respons antibodi terhadap
antigen lintas reaktif berasal dari paparan sebelumnya terhadap infeksi
yang tidak terkait dan tidak terkait dengan infeksi aktif pada kelompok
yang terinfeksi.

32
Gambar 4.5 Immunostrips. (A) Enam antigen serodiagnostik diekspresikan dalam
E. coli dan diekstraksi dari badan inklusi. Protein dimuat dalam 4–12% SDS PAGE,
diwarnai dengan noda biru atau dipindahkan ke membran nitroselulosa dan
diperiksa untuk tag HIS. Semua protein dikonfirmasi positif dengan tag HIS (B) 0,1
mg / mL masing-masing protein dicetak pada kertas nitroselulosa dalam garis-garis
yang berdekatan menggunakan dispenser jet BioDot. Membran dipotong menjadi
strip 3 mm. Strip diperiksa dengan pasien tifoid akut manusia atau sera naif
endemik. Lemahnya reaktifitas dalam kontrol sehat yang naif dapat dibedakan dari
reaktivitas yang kuat pada kelompok yang terinfeksi. (C) Kurva LOOCV ROC
dihasilkan dan sensitivitas dan spesifisitas semua 6 antigen pada tes probing
immunostrips adalah 94% dan 100%, masing-masing.

Gambar 4.6 Gabungan Na¨ıve bayes classifier pada peringkat antigen seroreaktif
dan serodiagnostik. Genom yang dikloning (2724 gen) diberi peringkat oleh
pengelompokan naif bayes berdasarkan 196 IgG / IgM seroreaktif dan 92 IgG / IgM
sero diagnostik fitur antigen. Saat persentase genom meningkat, laju prediksi juga
meningkat. Saat persentase genom meningkat, laju prediksi juga meningkat.

33
Tabel 4.1 Na¨ıve Bayes memberi peringkat antigen serodominan. Seperangkat 196
antigen IgG dan IgM serodominant Salmonella enterica TY2 yang diidentifikasi
dalam penelitian ini dianalisis untuk peringkat Na¨veve bayes terhadap kloning
2,724 gen

Tabel 4.2 Na¨ıve Bayes peringkat antigen serodiagnostik. Satu set dari 92 antigen
serodiagnostik IgG dan IgM Salmonella enterica TY2 diidentifikasi dalam
penelitian ini dianalisis untuk peringkat Na¨veve bayes terhadap kloning 2,724 gen

4.2 Pembahasan
Di sini dilaporkan analisis microarray proteome pertama dari protein S.
Typhi yang bersifat antigenik dalam konteks infeksi tipus manusia yang
didapat secara alami. Data ini memiliki implikasi mendalam untuk
memahami patogenesis bakteri dan pengembangan praktis diagnostik, terapi
dan vaksin untuk penyakit yang masih membunuh lebih dari 200.000 orang
setiap tahun.
Ketidakmampuan diagnosis serologis saat ini tentang penderita tifoid
untuk membedakan antara infeksi aktif dan paparan historis. Tes serologis
tradisional ini didasarkan terutama pada identifikasi antibodi terhadap antigen
O, antigen H atau kapsul Vi dan belum berubah secara substansial selama
lebih dari seabad. Namun, LPS terkenal reaktif silang antara spesies bakteri,

34
dan paparan terhadap antigen O, H dan Vi S. Typhi mungkin sangat lazim di
daerah endemik. Reaktivitas latar belakang yang tinggi dikonfirmasi oleh
studi microarray, di mana antigen O dan H bereaksi serupa pada kontrol
endemik dan pasien tifoid akut, menjelaskan kegunaan terbatas antigen ini
untuk diagnosis yang akurat. Sebagai perbandingan, 10 antigen IgM
diagnostik sero teratas membedakan antara kasus tifoid dan kontrol yang
sehat di Vietnam dengan sensitivitas dan spesifisitas masing-masing 94% dan
91%, dan 10 antigen IgG teratas menunjukkan sensitivitas 98% dan
spesifisitas 80% dengan immunostrips. Dengan demikian, temuan ini harus
memungkinkan pengembangan generasi baru tes diagnostik untuk infeksi
bakteri yang penting ini.
Merancang diagnostik tifoid yang digunakan lapangan membutuhkan
pemahaman tentang respons latar belakang terhadap Salmonella di daerah
endemis. Selama analisis, dicatat perbedaan yang signifikan dalam reaktivitas
latar belakang untuk protein S. Typhi pada individu yang tidak terinfeksi dari
endemik terhadap individu yang tidak terinfeksi dari daerah non-endemik.
Subyek kontrol memiliki reaktivitas latar belakang yang jauh lebih tinggi
terhadap antigen Salmonella, dibandingkan dengan subyek kontrol dari AS
(Gambar 4.2). Latar belakang yang lebih tinggi di negara-negara endemik,
membuatnya lebih sulit untuk mengidentifikasi antigen IgG yang dikenali
secara spesifik oleh infeksi aktif, sedangkan ini kurang menantang di daerah
non-endemik yang memiliki latar belakang lebih rendah. Pertimbangan
perbedaan ini penting untuk pengembangan uji diagnostik yang dimaksudkan
untuk digunakan di daerah endemik dan non-endemik. Selain itu, tidak
mengamati latar belakang tinggi antibodi IgM bahkan di negara-negara
endemik, menunjukkan bahwa IgM mungkin merupakan pendekatan yang
lebih cocok untuk mendiagnosis tifoid akut di daerah endemik.
Dua antigen yang ditemukan untuk membedakan antara pasien tifoid
dan subyek kontrol, hemolysin E (hlyE, t1477) dan protein seperti toksin yang
diduga (cdtB, t1111) telah diidentifikasi pada pasien Bangladesh dengan

35
teknik immune-affinity. Selain itu, prekursor asam fosfatase nonspesifik
(phoN, t4225), juga diidentifikasi pada pasien Bangladesh, diidentifikasi
reaktif pada pasien dan kontrol. Selanjutnya mengidentifikasi 14 antigen IgG
serodiagnostik novel dan 77 antigen IgM serodiagnostik novel yang mungkin
spesifik untuk pasien tifoid di Vietnam. Perlu dicatat, bahwa meskipun
konservasi genom tinggi dalam genus Salmonella, hanya satu antigen juga
ditemukan serodiagnostik untuk infeksi Salmonella nontyphoidal pada
individu Afrika. Lebih lanjut, enam antigen dapat membedakan antara pasien
tifoid di Vietnam dan pasien Salmonella nontyphoidal di Afrika. Studi lebih
lanjut tentang antigen diagnostik yang dapat membedakan antara tifoid,
Salmonella nontyphoidal dan penyakit demam lainnya dari wilayah geografis
yang sama memiliki kepentingan praktis yang tinggi.
Peneliti tertarik untuk memperluas utilitas kerja dengan memahami
mekanisme antigenisitas protein S. Typhi; diatasinya dengan mengidentifikasi
fitur proteomik yang diperkaya dalam set antigen serodominan. Analisis
pengayaan mengidentifikasi sembilan fitur proteomik yang lebih terwakili
dalam antigen serodominan. Fitur proteomik yang lebih terwakili termasuk;
COG M, N, O dan W, fitur yang diprediksi TMHMM51, SignalP > 0.7, pSort
periplasmic, pSort tidak diketahui, dan bukti ekspresi pada organisme yang
hidup. Tidak ada fitur proteomik tunggal atau kategori fitur yang cukup untuk
mengidentifikasi semua antigen tanda tangan. Namun, analisis ini mungkin
menunjukkan bias sebagai konsekuensi dari protein yang dipilih untuk
digunakan pada array. Namun, peneliti mengantisipasi hasil serupa dari chip
proteome penuh dan memiliki daftar antigen serodominan sebelumnya untuk
banyak bakteri dan secara konsisten menemukan fitur ini memprediksi
antigenisitas.
Untuk meningkatkan akurasi prediksi antigen diagnostik serodominan
dan sero pada seluruh proteome, digunakan semua informasi fitur proteomik
dalam pendekatan klasifikasi Bayes naive untuk memberi peringkat pada
proteom hasil kloning untuk meningkatkan kemungkinan reaktivitas sero.

36
Dengan melakukan itu, peneliti dapat memisahkan 19% protein serodominan
dan 39% protein serodiagnostik dalam 10% dari proteom hasil kloning.
Dalam 25% teratas peringkat genom yang dikloning, dapat diprediksi 45%
antigen serodominan dan 72% antigen serodiagnostik. Peneliti
mengantisipasi prediksi yang lebih tinggi dari antigen serodominan dan
serodiagnostik dalam menggunakan proteom lengkap. Pendekatan ini relevan
dan perlu untuk studi yang berfokus pada bagian kecil dari proteome yang
paling mungkin mengandung antigen serodiagnostik (Liang et al., 2013).

37
 BAB 5
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Demam tifoid adalah penyakit yang disebabkan oleh bakteri Salmonella
enterica subsp. enterica serovar Typhi. Penyakit ini terutama disebabkan oleh
kurangnya akses terhadap air bersih dan sanitasi, yang merupakan masalah
utama di negara-negara berkembang. Tingkat keparahan penyakit ini sering
dianggap remeh, dan saat ini tes diagnostik serologis yang tersedia tidak
memadai karena kurangnya sensitivitas dan spesifisitas yang diperlukan.
Pendekatan mempelajari infeksi tifoid memberikan dasar empiris untuk
memahami luasnya dan spesifisitas respon imun manusia terhadap S. Typhi.
Hasil yang disajikan di sini mewakili analisis 63% protein yang diprediksi
dalam genom S. Typhi. Selain itu, subset antigen diagnostik yang
diidentifikasi di sini memberikan perkiraan tingkat akurasi awal 90% untuk
diagnosis demam tifoid dan akan membuka pintu bagi diagnosis cepat yang
sangat dibutuhkan untuk infeksi terbatas pada manusia yang penting dan
belum diteliti.

38
 DAFTAR PUSTAKA

Andino, A., & Hanning, I. (2015). Salmonella enterica: Survival, colonization,

and virulence differences among serovars. Scientific World Journal, 2015, 1–
16. https://doi.org/10.1155/2015/520179

Andualem, G., Abebe, T., Kebede, N., Selassie, S. G., Mihret, A., & Alemayehu,
H. (2014). A comparative study of Widal test with blood culture in the
diagnosis of typhoid fever in febrile patients. BMC Research Notes, 7, 653.
https://doi.org/http://dx.doi.org/10.1186/1756-0500-7-653

Aydadenta, H., & Adiwijaya. (2018). On the classification techniques in data

mining for microarray data classification. Journal of Physics: Conference
Series, 971(1). https://doi.org/10.1088/1742-6596/971/1/012004

Dewan, A. M., Corner, R., Hashizume, M., & Ongee, E. T. (2013). Typhoid Fever
and Its Association with Environmental Factors in the Dhaka Metropolitan
Area of Bangladesh: A Spatial and Time-Series Approach. PLoS Neglected
Tropical Diseases, 7(1), 12–15. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001998

Dougnon, T. V., LEGBA, B., DEGUENON, E., HOUNMANOU, G.,

AGBANKPE, J., AMADOU, A., … DOUGNON, T. J. (2017).
Pathogenicity, Epidemiology and Virulence Factors of Salmonella species: A
Review. Notulae Scientia Biologicae, 9(4), 466–472.
https://doi.org/10.15835/nsb9410125

Gibani, M. M., Britto, C., & Pollard, A. J. (2018). Typhoid and paratyphoid fever.
Current Opinion in Infectious Diseases, 31(5), 440–448.
https://doi.org/10.1097/qco.0000000000000479

Goay, Y. X., Chin, K. L., Tan, C. L. L., Yeoh, C. Y., Ja’afar, J. N., Zaidah, A. R.,
… Phua, K. K. (2016). Identification of Five Novel Salmonella Typhi-
Specific Genes as Markers for Diagnosis of Typhoid Fever Using Single-
Gene Target PCR Assays . BioMed Research International, 2016, 1–9.
https://doi.org/10.1155/2016/8905675

Hardanti, S., Wardani, A. K., & Putri, W. D. R. (2018). Isolasi dan Karakterisasi
Bakteriofag Spesifik Salmonella Typhi dari Kulit Ayam. Jurnal Teknologi
Pertanian, 19(2), 107–116.

Heller, M. J. (2002). DNA Microarray Technology: Devices, Systems, and

Applications. Annual Review of Biomedical Engineering, 4(1), 129–153.
https://doi.org/10.1146/annurev.bioeng.4.020702.153438

39
Herath, H. M. T. U. (2003). Early diagnosis of typhoid fever by the detection of
salivary IgA. Journal of Clinical Pathology, 56(9), 694–698.
https://doi.org/10.1136/jcp.56.9.694

Ilham, I., Nugraha, J., & Purwanta, M. (2017). Deteksi IgM Anti Salmonella
Enterica Serovar Typhi dengan Pemeriksaan Tubex TF dan Typhidot-M.
Jurnal Biosains Pascasarjana, 19(2).
https://doi.org/10.20473/BSN.V19I2.5703

Kaliyappan, K., Palanisamy, M., Govindarajan, R., & Duraiyan, J. (2012).

Microarray and its applications. Journal of Pharmacy and Bioallied
Sciences, 4(6), 310–314. https://doi.org/10.4103/0975-7406.100283

Kaur, A., Kapil, A., Elangovan, R., Jha, S., & Kalyanasundaram, D. (2018).
Highly-sensitive detection of Salmonella typhi in clinical blood samples by
magnetic nanoparticle-based enrichment and in-situ measurement of
isothermal amplification of nucleic acids. PLoS ONE, 13(3), 1–14.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0194817

Kaur, J., & Jain, S. K. (2012). Vi antigen of Salmonella enetrica serovar Typhi -
biosynthesis, regulation and its use as vaccine candidate. Central European
Journal of Biology, 7(5), 825–838. https://doi.org/10.2478/s11535-012-0082-
8

Lalremruata, R., Chadha, S., & Bhalla, P. (2014). Retrospective audit of the widal
test for diagnosis of typhoid fever in pediatric patients in an endemic region.
Journal of Clinical and Diagnostic Research, 8(5), 22–25.
https://doi.org/10.7860/JCDR/2014/7819.4373

Liang, L., Juarez, S., Nga, T. V. T., Dunstan, S., Nakajima-Sasaki, R., Huw
Davies, D., … Felgner, P. L. (2013). Immune profiling with a Salmonella
Typhi antigen microarray identifies new diagnostic biomarkers of human
typhoid. Scientific Reports, 3, 1–10. https://doi.org/10.1038/srep01043

Liang, L., Tan, X., Juarez, S., Villaverde, H., Pablo, J., Nakajima-Sasaki, R., …
Felgner, P. L. (2011). Systems biology approach predicts antibody signature
associated with Brucella melitensis infection in humans. Journal of Proteome
Research, 10(10), 4813–4824. https://doi.org/10.1021/pr200619r

Marleni, M., Iriani, Y., Tjuandra, W., & Theodorus. (2014). Ketepatan Uji Tubex
TF ® dalam Mendiagnosis Demam Tifoid Anak pada Demam Hari ke-4.
Jurrnal Kedokteran Dan Kesehatan, 1(1), 7–11.

Marshall, J. M., & Gunn, J. S. (2015). The O-antigen capsule of Salmonella

enterica serovar typhimurium facilitates serum resistance and surface

40
 expression of FliC. Infection and Immunity, 83(10), 3946–3959.
https://doi.org/10.1128/IAI.00634-15

Miller, M. B., & Tang, Y. W. (2009). Basic concepts of microarrays and potential
applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology Reviews, 22(4),
611–633. https://doi.org/10.1128/CMR.00019-09

Nazilah, A. A., & Suryanto. (2013). Hubungan Derajat Kepositifan TUBEX TF

dengan Angka Leukosit pada Pasien Demam Tifoid Patients with Typhoid
Fever. Mutiara Medika, 13(3), 173–180.

Parry, C. M., Dougan, G., White, N. J., Farrar, J. J., & Hien, T. T. (2002).
Typhoid Fever. The New England Journal of Medicine, 347(22), 1770–1783.

Ramani, E., Park, J. Y., Wierzba, T. F., Mogasale, V. V., & Mogasale, V. (2018).
Estimating Typhoid Fever Risk Associated with Lack of Access to Safe
Water: A Systematic Literature Review. Journal of Environmental and
Public Health, 2018, 1–14. https://doi.org/10.1155/2018/9589208

Sultana, S., Maruf, M. A. Al, Sultana, R., & Jahan, S. (2016). Laboratory
Diagnosis of Enteric Fever: A Review Update. Bangladesh Journal of
Infectious Diseases, 3(2), 43–51. https://doi.org/10.3329/bjid.v3i2.33834

Tarca, A. L., Romero, R., & Draghici, S. (2006). Analysis of microarray

experiments of gene expression profiling. American Journal of Obstetrics
and Gynecology, 195(2), 373–388.
https://doi.org/10.1016/j.ajog.2006.07.001

Veeraraghavan, B., Pragasam, A. K., Bakthavatchalam, Y. D., & Ralph, R.

(2018). Typhoid fever: issues in laboratory detection, treatment options &
concerns in management in developing countries. Future Science OA, 4(6).
https://doi.org/10.4155/fsoa-2018-0003

Wardana, I. M. T. N., Herawati, S., & Yasa, I. W. P. S. (2011). Diagnosis Demam

Thypoid Dengan Pemeriksaan Widal.

41