Tutor Divisi Mikrobiologi & Penyakit Infeksi

KULTUR DARAH BAKTERI

ANAEROB
Rabu, 15 Mei 2013

Yulia Nadar I. / Aryati

14/03/2018 1
PATOLOGI KLINIK - FK UNAIR
 I. PENDAHULUAN

Bakteri
Bakteri Anaerob
Endogen : Eksogen :
Bakteri flora
Anaerob normal C. tetani, C.
tubuh botulinum,C.
perfringens

14/03/2018 2
 Bacteroides spp. : Prevotella dan
Bacteroides fragilis Porphyromonas spp.

80%
Infeksi
Anaerob

Peptrostreptococcus CClostridium spp. :

spp. : Clostridium
Peptostreptococcus perfringens
magnus

14/03/2018 3
 Lokasi Anatomis Flora Normal
Rongga mulut & saluran nafas atas :
• Gram negatif : Bacteroides
ureolyticus, Veillonella, Fusobacterium
• Gram positif : Peptostreptococcus
Usus Besar :
• Gram negatif : Bacteroides fragilis
• Gram positif : Bifidobacterium,
Clostridium
Uretra bagian distal :
• Gram negatif : Prevotella, Fusobacterium
• Gram positif : Propionibacterium,
Peptostreptococcus
14/03/2018 4
 II. PENGAMBILAN & PENGIRIMAN
SPESIMEN

• Faktor keberhasilan isolasi bakteri

anaerob :
1. Pengambilan spesimen
2. Pengiriman spesimen
3. Lingkungan inkubasi

14/03/2018 5
 • Spesimen klinis yang sesuai untuk kultur
anaerob (Bailey & Scott’s, 2007) :
- Cairan empedu
- Biopsi jaringan endometrium
- Darah
- Sumsum tulang
- Cairan serebrospinalis
- Cairan sendi
- Aspirasi abses
14/03/2018 6
 Gambar 1. Sistem transpor Gambar 2. Sistem transpor
anaerob utk spesimen cair anaerob utk spesimen swab

Sumber : Bailey & Scott’s , 2007

14/03/2018 7
 Gambar 3. Sistem transpor anaerob
untuk spesimen jaringan

(Sumber : Bailey & Scott’s, 2007)

14/03/2018 8
 Tabel 1. Waktu yang dianjurkan untuk pengiriman
spesimen
JENIS SPESIMEN WAKTU OPTIMAL

Material aspirasi : - volume < 1 ml ≤ 10 menit

- volume 1 ml ≤ 30 menit
- volume > 2 ml ≤ 2-3 jam
- dalam alat transpor anaerobik ≤ 2-3 jam
Material biopsi atau jaringan :
- dalam kontainer steril ≤ 30 menit
- dalam kantong anaerobik ≤ 2-3 jam

Anaerobic swab :
- dalam tabung ≤ 1 jam
- dalam media transpor ≤ 2-3 jam

14/03/2018 (Sumber : Essential Procedures for Clinical Microbiology, 1998) 9

 III. PEMILIHAN MEDIA, PROSES, DAN TEKNIK
INKUBASI

IV.1. Pemilihan Media

• Keberhasilan isolasi bakteri anaerob tergantung

pada pemilihan media pertumbuhan primer dan
kondisi lingkungan.
• PRAS (Prereduced, Anaerobically Sterilized
Media) sangat baik dalam mendukung
pertumbuhan bakteri anaerob.

14/03/2018 10
 Tabel 2. Media anaerob yang umum digunakan
MEDIA KOMPONEN PENGGUNAAN

Anaerobic blood agar Columbia, Schaedler, CDC, Media nonselektif untuk

Brucella, BHI dg suplemen isolasi anaerob & anaerob
darah domba5%, ekstrak fakultatif.
yeast 0,5%, hemin, L-
cystin, Vitamin K1.
Bacteroides bile esculin Trypticase soy agar dengan Selektif & diferensial untuk
agar (BBE) ferric ammonium citrate & grup Bacteroides fragilis,
hemin; bile salt dan baik untuk identifikasi
gentamicin sebagai presumtif.
inhibitor.
Laked kanamycin- Brucella agar base dengan Selektif untuk isolasi
vancomycin blood agar kanamycin (75µg/mL), Prevotella dan Bacteroides
(LKV) vancomycin(7,5µg/mL), vit spp.
K1, , dan 5% laked blood.
Anaerobic phenylethyl Nutrient agar base, darah Selektif untuk menghambat
alcohol agar (PEA) 5%, phenylethy l alcohol. batang gram negatif enterik
dan swarming clostridia.
14/03/2018 11
 ... lanjutan tabel 2 (Bailey & Scott’s, 2007)
Egg-yolk agar (EYA) Egg yolk base.
Cycloserine cefoxitin Egg yolk base dengan
fructose agar (CCFA) fruktosa, sikloserin (500
mg/L), dan cefoxitin (16
mg/L); indikator neutral red.
Cooked meat (Chopped Partikel daging padat.
meat) broth
Thiogllycollate broth Kasein, soy broth, glukosa,
dapat ditambah hemin dan
vit K1.
14/03/2018
Nonselektif untuk
menentukan clostridia
dan fusobacteria
penghasil lesitinase dan
lipase.
Selektif untuk Clostridium
difficile.
Nonselektif utk
pertumbuhan organisme
anaerob, dg penambahan
glukosa. Dapat digunakan
untuk gas-liquid
chromatograhpy.
Nonselektif untuk
pertumbuhan anaerob, baik
anaerob fakultatif dan
aerob.
12
Gambar 4. PRAS plated media Gambar 5. Brucella blood agar
(Bailey & Scott’s, 2007) (Sumber : jcm.asm.org)

14/03/2018 13
 Gambar 6. Algoritma prosedur untuk proses spesimen klinis bakteri anaerob

Properly obtained clinical specimen

Direct Gram Stain

Plating medium :
Brucella, BBE, KVLB, PEA, EYA

Isolated Colonies

EYA Brucella Gram Stain Aerotolerance

Use for Clostridium-like organisms, Incubate CHOC in

pigmented gram-negative rods, or CO2 incubator for
Fusobacterium necrophorum-like 48 hours.
organisms.
14/03/2018 14
(Sumber : Essential Procedures for Clinical Microbiology, 1998)
IV.2. Teknik Inkubasi

1) Anaerobic chamber

Gambar 6. Anaerobic chamber.

14/03/2018 (Sumber : www.epsovens.com) 15

 2) Anaerobic jar

(Sumber : kmle.co.kr) (Sumber : eplantscience.com)

Gambar 7. Anaerobic Jar Gambar 8. Anaerobic Jar 16

 3) Anaerobic bag/pouch

Gambar 9. Anaerobic pouch ; PRAS media

(Sumber : hardydiagnostics.com)
14/03/2018 17
 Kultur Darah Bakteri Anaerob
di Laboratorium Mikrobiologi
RSUD Dr. Soetomo Surabaya

18
 Persiapan alat dan media:
• Botol Bactec anaerob • Metronidazole disc
• Spuit 3 cc • Media Brucella
• Katalisator palladium • Aquadest
• Gas generating kit • Anaerobic jar
anaerobic system • Inkubator
BR0038B
• Media Simon sitrat dengan
Pseudomonas aeruginosa

19
 Langkah pemeriksaan:
1. Pengambilan spesimen secara aspirasi yang
langsung dimasukkan ke botol Bactec anaerob.
2. Inkubasi kedalam Bactec 9120.
3. Dilakukan kultur jika tumbuh bakteri pada botol
Bactec.
4. Kultur pada media Brucella (letakkan
Metronidazole disc) dan dikondisikan anaerob
dengan cara dimasukkan ke dalam anaerobic jar
bersama katalisator, gas generating kit
anaerobic system BR0038B yang telah diberi
aqua ±10 cc , serta media Simon sitrat yang
sudah ditanami Pseudomonas aeruginosa.
20
5.Dipastikan gas generating kit bekerja
efektif,dengan indikator peningkatan tekanan
sampai angka 5 barr pada anaerobic jar.
6. Anaerobic jar beserta isinya, dimasukkan
kedalam inkubator pada suhu 37⁰C selama 18-
24 jam.
7. Setelah diinkubasi, dilihat media Simon sitrat,
jika tidak terjadi perubahan warna, maka
suasana yang ada pada anaerobic jar benar-
benar anaerob.
21
8. Kuman anaerob dinyatakan positif jika
terbentuk zona hambatan pada media
Brucella.

22
• Persiapan sampel

Inkubator, Siap
Tumbuh
37C, 24 jam dikultur
kuman

23
• Persiapan anaerobic jar & media simon sitrat

Dilihat ada pertumbuhan

Inkubator, 37◦C,
Pseudomonas aeruginosa 24jam
atau tidak

24
• Persiapan kultur anaerob

Teteskan ( 1 tetes) Tempelkan

Ambil sampel dari dan streaking metronidazole
botol Bactec pada media disc diatas
dengan spuit 3 cc. Brucella. streaking

Hasil : Inkubator,
Positif, jika ada 37◦C, 24 jam
zona hambatan;
Negatif, jika
tidak ada zona
hambatan.
25
 V. PELAPORAN HASIL

14/03/2018 26
14/03/2018 27
 Tabel 3. Metode Tes Kepekaan Antibiotik
Bakteri Anaerob (Bailey & Scott’s, 2007)

KONDISI TES DILUSI AGAR BROTH MICRODILUTION

& MACRODILUTION

Media Agar Brucella yg ditambah Brucella Broth yg ditambah

hemin (5µg/mL), vit K dan hemin (5µg/mL), vit K dan
5% laked sheep blood. 5% lysed horse blood.

Ukuran Inokulasi 1x105 CFU/spot 1x106CFU/mL

Kondisi Inkubasi Anaerob, 35º-37⁰C Anaerob, 35º-37⁰C

Lama Inkubasi 48 jam 48 jam

14/03/2018 28
Media agar Brucella :

• Media nonselektif yang diperkaya.

• Ditambah vitamin K1 dan hemin utk pemulihan
dan produksi pigmen Prevotella melaninogenica.
• Ditambah darah domba utk observasi reaksi
hemolitik  zona β-hemolitik pada Clostridium
perfringens.

www.anaerobesystems.com

14/03/2018 29
 HEMIN

14/03/2018 30
 HEMIN

• Hemin (trade name Panhematin) is an iron-

containing porphyrin. More specifically, it is
Protoporphyrin IX containing a ferric iron ion
(Heme B) with a chloride ligand.

• Hematin is considered the "X factor" required for

the growth of Haemophilus influenzae.

www.en.wikipedia.org
14/03/2018 31
 Levels of Anaerobe Identification that
Laboratories Typically Perform

• Level I :
pure culture isolation; assess colonial and
cellular morphology; aerotolerance testing.
• Level II :
special potency disks and spot tests are used to
presumptively identify some clinically significant
anaerobes, such as differentiation of the
B.fragilis group and identification of Clostridium
perfringens.

14/03/2018 32
 Levels of Anaerobe Identification that
Laboratories Typically Perform

• Level III :
biochemical tests and sometimes gas-liquid
chromatography are used for definitive
identification of most clinically significant
anaerobes.

Sumber : Essentials of Diagnostic Microbiology, 1999

14/03/2018 33
 Tes Aerotoleransi
• Prinsip : menentukan isolat kuman suatu obligat
anaerob, fakultatif anaerob , atau anaerob
aerotoleran.
• Metode :
1. Subkultur utk isolasi tiap jenis morfologi
kuman di media coklat (5%-10% CO2), aerobic
sheep blood agar plate (non-CO2), & anaBAP
(kondisi anaerob), inkubasi 24 jam, 35º-37ºC.
2. Observasi media tiap hari selama 72 jam :
tidak tumbuh (anaerob obligat), scant growth
(anaerob aerotoleran), tumbuh baik (anaerob
fakultatif).
14/03/2018 34
 3. Isolat anaerob dilakukan pewarnaan Gram,
tes disk potensial khusus, dan tes spot
sederhana.
• QC : dilakukan tiap bulan  kuman kontrol :
B.fragilis, Propionibacterium acnes, & E.coli.
• Hasil :
-B.fragilis tidak tumbuh pada media aerob
(anaerob obligat)
-P.acnes scant growth pada media aerob
(aerotoleran)
-E.coli tumbuh pada media aerob (anaerob
fakultatif)
Sumber
14/03/2018 : Essentials of Diagnostic Microbiology, 1999 35