IDENTIFIKASI BAKTERI

PEWARNAAN
Cara identifikasi bakteri
Pewarnaan
Menggunakan zat kimia
Uji sifat biokimia
Uji genetik
 PEWARNAAN BAKTERI
Prosedur pewarnaan bakteri :3

Simple stain (Pewarnaan sederhana)

Differensial Stain (Pewarnaan differensial)
Special stain (Pewarnaan negatif)
Simple stain
Tujuan: mewarnai seluruh sel sehingga
bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat
terlihat
Hanya digunakan 1 zat warna
Biasanya ditambahkan bahan kimia
sebagai penajam (mordant)
Example: carbol fuhsin & safranin
 Differential stain
Tujuan : membedakan bakteri
Use 1 atau lebih pewarna
1. Pewarnaan gram (sering digunakan)
◦ Gram stain ditemukan oleh Hans Christian Gram seorang ilmuan
dan ahli fisika (1884)
◦ Dapat membedakan 2 kelompok besar bakteri: Gram Positif dan
Gram negatif
2. Pewarnaan tahan asam ( Ziehl neelsen)
The gram stain
The gram stain is the most widely used staining procedure in
bacteriology.
It is called a differential stain since it differentiates between gram-
positive and gram-negative bacteria.
Bacteria that stain purple with the gram staining procedu re are
termed gram-positive;
those that stain pink are said to be gram-negative.
The terms positive and negative have nothing to do with electrical
charge, but simply designate two distinct morphological groups of
bacteria.
Gram-positive and gram-negative bacteria stain differently
because of fundamental differences in the structure of their
cell walls.
The bacterial cell wall serves to give the organism its size
and shape as well as to prevent osmotic lysis.
The material in the bacterial cell wall that confers rigidity is
peptidoglycan.
 Pewarnaan gram
Pewarna yang gunakan:
Kristal violetpewarna primer (sifat basa)
Safranin pewarna skunder ( basa)
Iodin (lugol) mordan
Alkohol decoloring agent
Gambar Mikroskop
Beberapa bakteri Gram(+) dan Gram(-)
Gram (+) Gram (-)
 Staphylococcus aureus  Escherichia coli
 Staphylococcus  Salmonella sp
epidermidis  Bacillus sp
 Vibrio parahaemoliticus
 Pewarna tahan asam
Acid-fast 1.Merah Carbol fuhsin (MCF)
Dipanaskan
Pengecatan Ziehl neelsen Bbrp menit penetrasi
2.Cuci dg airmengalir
Zat warna ini terikat kuat 3. Alkohol sbg peluntur
Jika Bukan BTA maka merah
pada bakteri yg memiliki carbol fuhsin akan luntur sel
transparan
lilin pd dinding selnya Pada BTA warna MCF tetap
BTA (bakteri tahan asam) melekat
4. Ditambah metilen Blue non
contoh: BTA Biru

Genus mycobacterium * MCF larut dlm lipid

( M.tuberculosis & M.
leprae
Negatif Stain
Digunakan untuk mewarnai kapsul
bakteri,tidak dapat berpenetrasi kedalam
sel bakteri.
Tinta cina, nigrosin,Congo red
Kapsul bakteri akan terlihat terang
dengan latar belakang gelap.
UJI BIOKIMIA
Hasil reaksi biokimia
◦ 1. Teknik API20E System
◦ 2. Teknik Biolog
 Principles
The API 20E System is a standardized, miniaturized version of
conventional biochemical procedures used in the identification of
Enterobacteriaceae and other gram-negative bacteria.
A total of 127 taxa can be identified with this system.
It is a ready-to-use, microtube system that performs 22 standard
biochemical tests on pure bacterial cultures from appropriate,
primary isolation media.
This system consists of a strip containing 20 chambers (figure 35.1),
each consisting of a microtube and a depression called a cupule.
The tubes contain dehydrated substrates.
The substrates are rehydrated by adding a bacterial saline suspension.
To create anaerobic conditions, sterile mineral oil is added to several
of the microtubes.
Teknik API 20E System
 The strip of microtubes is then incubated for 18 to 24 hours at
35° to 37°C so that the bacterium can act on the substrates.
 The strip is read by noting color changes after the various
indicator systems have been affected by the metabolites or
added reagents (table 35.1).
 The identification of the unknown bacterium is
 achieved by determining a seven-digit profile index number
and consulting the API 20E Profile Recognition System or
the API 20E Profile Index Booklet.

 Charts can also be used to determine the unknown

 bacterium (see appendix G).
Biolog System
Metoda Biolog dirancang untuk mengidentifikasi
bakteri, jamur dan yeast berdasarkan reaksi
biokimia yang terjadi karena perbedaan sumber
karbon yang terdapat didalam 95 lubang
mikroplate.
Mikroplate Biolog pertama kali diperkenalkan
pada tahun 1989.
Sumber karbon ini berasal dari polimer, gula,
gula fosfat, asam amino, alkohol, asam
karboksilat.
Disetiap lubang mikroplate terdapat indikator
tetrazolium yang akan tereduksi oleh reaksi yang
terjadi antara bakteri dengan sumber karbon yang
tersedia.
Reaksi yang terjadi sangat khas untuk setiap jenis
bakteri oleh karena itu disebut “metabolic fingerprint”.
Hasil ini akan dibandingkan dengan database yang ada
pada software MicroStation Reader (MicroLog™).
Database Biolog mempunyai data 2.112 spesies bakteri
aerob, bakteri anaerob, yeast dan jamur.
beberapa rangkaian pengujian yang harus
dilakukan:
1.Uji pengelompokan bakteri dengan
menggunakan pereaksi KOH 3%.
Suspensi berbentuk lendir menandakan bakteri
gram negatif sedangkan suspensi encer
menandakan bakteri gram positif.
Prinsip reaksi ini yaitu perbedaan ketebalan
dinding sel, bakteri gram negatif dinding selnya
lebih tipis sehingga dengan hanya penambahan
KOH 3% dinding selnya pecah.
Sedangkan gram positif memerlukan lisozim
untuk memecah dinding selnya.
2. Uji oksidase dengan menggunakan oxidase
test-strip
Enzim sitokrom oksidase dapat aktif karena
terjadinya transfer elektron ke molekul oksigen.
Adanya molekul oksigen pada enzim oksidase
mampu mereduksi substan-substan organik seperti
N,N-dimetil-1,4-fenilen diamonium diklorida dan
naftol yang terdapat dalam oxidase test-strip.
Warna biru violet pada test strip menunjukan positif
bakteri non enterik dan untuk bakteri enterik tidak
terjadi perubahan warna pada oxidase test-strip.
3.Uji katalase dengan penambahan pereaksi
hidrogen peroksida
Uji ini bertujuan untuk mengelompokan bakteri aerob
dan anaerob dengan mendeteksi keberadaan enzim
katalase.
Enzim ini hanya terdapat pada bakteri yang mempunyai
metabolisme aerobik.
Reaksi positif bakteri aerob ditandai dengan
terbentuknya gelembung gas setelah penambahan
hidrogen peroksida.
Sedangkan bakteri anaerob tidak terbentuk gelembung
gas
4.Pembacaan hasil dengan menggunakan
MicroStation Reader (MicroLog™)
◦ Sebelum kultur bakteri diinokulasikan ke
mikroplat, terlebih dahulu koloni bakteri
tersebut disuspensikan dengan larutan
inokulasi gram negatif atau gram positif.
◦ Kemudian diukur transmitannya dengan
menggunakan Biolog Turbidimetri.
Uji genetik
Menggunakan PCR
Elektroforesis
TEKNIK PCR
Pengertian PCR
Apakah PCR itu ?
◦ PCR merupakan singkatan dari Polymerase Chain Reaction
atau reaksi rantai polimerase

◦ Ditemukan pertama kali oleh Kary B. Mullis tahun 1985

◦ Merupakan suatu teknik amplifikasi rantai DNA yang

diinginkan secara in vitro.

◦ PCR memungkinkan untuk dihasilkannya produk DNA

sebanyak mungkin dari hanya beberapa kopi DNA awal.
Inijelas terlihat bahwa PCR bisa digunakan untuk
menghasilkan sejumlah DNA yang bisa dideteksi
hanya dari satu molekul saja pada awalnya.

PCR bisa digunakan untuk mengidentifikasi,

mengkarakterisasi dan menganalisa bagian
spesifik dari DNA maupun RNA.

Mikroorganisme dapat diidentifikasi secara PCR

karena mempunyai DNA.
 Prinsipterjadinya reaksi akibat adanya sifat
komplementasi (=berpadanan) rantai DNA dengan
pasangannya dan dimanipulasi melalui tiga tahapan
suhu:

◦ denaturasi ( pemisahan rantai ),

◦ annealing ( penempelan primer ),
◦ extension :perpanjangan rantai oleh DNA
Polimerase.
Primer :
adalah potongan pendek rantai DNA
Biasanya terdiri 18 – 24 nukleotida
Didesain berkomplemen dengan
rantai DNA templat ,
dan menjadi titik batas multiplikasi
segmen DNA target.

DNA target (template DNA ) :

adalah segmen DNA
yang dimultiplikasi dalam reaksi PCR
dengan titik batas primer kiri
dan primer kanan.
Secara teoritis, jika efisiensi reaksi pelipatgandaan seratus persen,
Dan dilakukan putaran 30 siklus reaksi rantai
( denaturasi-penempelan-perpanjangan ) maka PCR akan dihasilkan
sebanyak kurang lebih satu milyar molekul DNA target.

Reaksi komplementasi DNA terjadi sangat spesifik sedemikian rupa sehingga

dapat dipakai dalam identifikasi bakteri yang mengkontaminasi sediaan
farmasi dan sampel biologis lainnya. 
Mesin PCR
Hasil perbanyakan DNA kemudian di
elektroforesa untuk memisahkan
potongan-potongan gen.
 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 K- M

Bobot molekul
10.000 bp

1500 bp
1000 bp

750 bp

500 bp
385 bp

250 bp

Gambar . Hasil elektroforesis amplifikasi gen ctx pada Vibrio cholerae

dengan metoda PCR pada gel agarosa 1.2%
 Sekian,
terimakasih