ISOLASI & INOKULASI

Biakan murni : biakan yg hanya terdiri dari

satu spesies tunggal mikrob

Mengapa perlu biakan murni ?

Isolasi : teknik utk mendapatkan koloni terpisah

suatu mikrob (memisahkan koloni
tunggal suatu mikrob dari suatu
campuran mikrob)

Inokulasi : menanam satu jenis (sel tunggal)

mikrob pada suatu media
Teknik isolasi : 1. cawan gores

2. cawan sebar

3. cawan tuang
KEBUTUHAN PEMBIAKAN MIKROBA
METODE INOKULASI
Streak Plate
INOKULASI AGAR MIRING
DAN TEGAK
Metode tuang
Metode Swab
 ANALISIS KOLIFORM
Bakteri koliform adalah kelompok bakteri yang mempunyai sifat :
• aerob
• aerob fakultatif
• gram negatif
• tidak memiliki spora
• berbentuk batang pendek (basil pendek)
• dapat melakukan fermentasi pada media laktose broth kurang
dari 2 x 24 jam pada suhu 37oC dan menghasilkan asam dan
gas
Kelompok koliform dibedakan menjadi koliform asal tinja
(koliform fekal) dan bukan-tinja (koliform non fekal)
UJI KOLIFORM DENGAN METODE MOST PROBABLE NUMBER (MPN)

• Metode MPN/APM merupakan metode yang menggunakan uji deretan

tabung berisi media yang dapat menyuburkan pertumbuhan koliform
(misalnya media laktose broth).

• Jumlah tabung yang menghasilkan gas dan asam dapat dihitung sehingga
diperoleh nilai untuk menduga jumlah koliform dalam sampel yang diuji.

• Jumlah koliform ini bukan penghitungan yang tepat,namun merupakan

angka yang mendekati jumlah yang sebenarnya

• Pengujian koliform dengan metode MPN dilakukan dalam 3 tahap :

1. Uji Penduga (Presumtive Test)
2. Uji penguat (Confirmed Test)
3. Uji pelengkap (Completed Test)
1. Uji Penduga (Presumtive Test)

• Uji pendahuluan untuk menduga ada/tidaknya bakteri koliform dalam

sampel

• Dinyatakan (+) jika terbentuk gas pada tabung fermentasi

• Hasil yang (+) bisa juga disebabkan bakteri lain yang mampu
memfermentasi laktosa dengan menghasilkan gas

2. Uji penguat (Confirmed Test)

• Uji penguat dilakukan melalui identifikasi bentuk koloni pada media
selektif

• Dilakukan dengan cara meneruskan pengujian perkiraan yang positif

ke dalam media BGLB (Brilliant Green Laktosa Bila Broth) atau
dengan menanam pada media EMB agar (Eosin Metilen Blue) agar
dan Endo Agar
3. Uji Pelengkap (Completed Test)

• Dilakukan untuk meyakinkan hasil uji penguat melalui

pewarnaan gram dan pewarnaan spora biakan murni
pada uji penguat.

• Uji ini merupakan uji terakhir identifikasi koliform.

• Pengujian lengkap dinyatakan (+) :

ü Bila terbentuk gas pada medium laktosa broth

ü Pada pewarnaan Gram  bersifat Gram (-)

ü Bentuk sel batang dan tidak membentuk spora

Analisis Koliform dengan Metode Penyaringan
q Metode penyaringan atau membrane filter (MF) memberikan hasil
lebih cepat dibandingkan dengan metode MPN.

q Metode ini sebaiknya tidak digunakan untuk menentukan jumlah

koliform sampel air yang keruh.

q Untuk menentukan dan menghitung koliform non fekal dan koliform

fekal disediakan media khusus.

q Koliform non fekal menggunakan m-Endo agar, sedangkan koliform

fekal menggunakan media-Faecal agar
 Preparat untuk Pemeriksaan Mikroskop

Ada 2 teknik umum utk membuat preparat :

1. Suspensi dalam cairan

teknik lekapan basah & tetes gantung

Digunakan untuk / bila :

• melihat mikrob dlm keadaan hidup
• melihat motilitas mikrob
• morfologi mikrob rentan thd pns & bhn kimia

• mikrob sukar diwarnai

Preparat Tetes Gantung & Lekapan Basah
 Preparat untuk Pemeriksaan Mikroskop

2. Lapisan/olesan tipis yg dikeringkan, difiksasi, dan diwarnai

teknik pewarnaan

Digunakan untuk :

• identifikasi bagian-bagian struktural sel

• membantu identifikasi & membedakan organisme yang

serupa

• melihat lebih jelas bentuk/morfologi secara kasar

Pewarnaan Negatif
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram
Pewarnaan Spora
 Ciri Kimia Suatu Pewarna

Substansi pewarna merupakan senyawa organik yang terdiri atas cincin

benzena , kromofor dan gugus auksokrom

Benzena Pelarut organik Kromogen

Senyawa berwarna Pewarna

Kromofor Gugus kimia yang memberi bukan pewarna
warna benzena

Auksokrom Gugus kimia yang

mengionisasi kromogen
sehingga membentuk garam
dan dapat terikat pada sel,
serat atau jaringan
Contoh Struktur Molekul Zat Warna
 Pewarnaan Bakteri

1. Pewarnaan positif

menggunakan zat warna basa, bakteri berwarna & lapangan

pandang transparan

Dibedakan menjadi :
a. Pewarnaan tunggal / sederhana : menggunakan 1 (satu) macam zat warna

b. Pewarnaan diferensial : menggunakan  1 macam zat warna

Contoh : pewarnaan Gram, spora, dsb

2. Pewarnaan negatif
menggunakan zat warna asam, bakteri transparan & lapang pandang
berwarna
 Hal-hal yang harus diperhatikan
dalam penyiapan olesan mikrob

❖ olesan tdk boleh terlalu tebal atau terlalu tipis

❖ bila difiksasi dg panas akan tahan pencucian 1

( s a t u ) k a l i a t a u l e b i h s e h i n g g a m i k ro b t d k
t e rc u c i & s e l nya t d k r u s a k

❖ k a c a o b j e k t d k b o l e h t e rg o re s & h a r u s b e r s i h
perbesaran objektif :
• 4x (scanning) : jarak kerja
9 – 10 mm
• 10x (low power) : 5 – 8 mm
• 40x (high power) :
0.5 – 0.7 mm

▪ 100x (immersion oil) :

0.13 – 0.18 mm
 Perbandingan Berbagai Macam Mikroskop

Macam Perbesaran Tampang Terapan

Mikroskop Maksimum Spesimen
Ciri morfologi keseluruhan
Medan terang 1000 – 2000 Diwarnai / tdk bakteri, fungi, alga &
protozoammed

Tdk diwarnai dlm gelap Utk mikrob yg memiliki ciri

Medan gelap 1000 - 2000 morfologi yg khas

Berbagai derajat kegelapan Utk pemeriksaan pd sel hdp

Fase kontras 1000 - 2000 berukuran besar

Cerah & berwarna fluoresens identifikasi

Fluoresens 1000 - 2000
Pemeriksaan objek yg amat
kecil;virus & ultra struktur sel
Elektron 200.000 sampai 400.000 Cerah, pada layar fluoresens mikrob
 Cara menghitung jumlah mikrob dapat dibagi menjadi 3 yaitu :
1. Total cell count
yaitu melihat sel secara langsung dengan bantuan mikroskop dan
haemositometer, baik sel hidup atau sel mati terhitung semua contoh
menghitung total mikrob cara breed. Pada cara ini suspensi bakteri yang
telah diketahui volumenya di siapkan pada kaca objek. Melalui teknik
pewarnaan dilakukan pengamatan menggunakan mikroskop dan rata-rata
jumlah bakteri setiap lapang pandang dihitung dengan satuan jumlah
sel/mL/ cm2 area pandang.

2. Viable count
menghitung hanya sel yang hidup melalui hitungan koloni yang disebut
plate count atau colony count. Pada cara ini hitungan jumlah mikrob adalah
dari jumlah koloni yang tumbuh dimedia dan cara perhitungannya mengikuti
aturan yang berlaku.

3. Hitungan massa sel

yaitu melalui teknik disentrifugasi, maka endapannya diukur sebagai bobot
kering atau suspensi biakan bakteri diukur kekeruhannnya secara
turbidimetri. atau mengukur serapan larutan pada alat spektrofotometer
dengan satuan unit nya adalah absorbansi.
ØPemilihan media pertumbuhan juga sangat penting.

ØPenggunaan media cair (nutrien broth) dapat dilakukan untuk

menghitung massa sel

Ø Media agar cawan sangat umum digunakan pada metode hitungan

cawan tuang yang disebut sebagai metode Total Plate Count (TPC)
dan metode penyaringan (filtrasi ). Perbedaan keduanya adalah pada
cara TPC suspensi bakteri atau hasil pengencerannnya
diinokulasikan pada media agar cawan dan setelah diinkubasi
hasilnya dihitung sesuai aturan hitungan cawan, sedangkan pada
teknik filtrasi, sampel disaring menggunakan membran filter
berbentuk cakram dan membran berisi mikrob tersebut ditumbuhkan
pada media agar cawan kemudian di hitung jumlahnya.

Ø Cara hitungan mikrob lainnya adalah dengan dugaan yang mengacu

pada metode angka paling mungkin (APM), misalnya pada analisis
bakteri koliform / E. coli dalam sampel air
Dilution and Plate Count (1)
Pengenceran 10-1 10-2 10-3 10-4

465 50 75 10
TBUD 2 x 102 15 0
Jumlah Koloni 20 0 0 0
TBUD TBUD 3 x 103 260

Soal no.3 : Kurang dari 25 x 101 (20 x 101) sel/mL atau sel/g
Soal no. 4 : Lebih dari 250 x 104 (260 x 104) sel/mL atau
sel/g sampel