Uji dan Informasi yang berhubungan

dengan Mikrobiologi dalam Farmakope

Indonesia edisi V 2014
<51> Uji Batas Mikroba
<61> Uji Efektivitas Pengawet
<65> Uji Kinerja Resistensi Indikator Biologi
<71> Uji Sterilitas
<81> Desain dan Analisis Penetapan Hayati
<91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12
<121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat
<131> Penetapan Potensi Antibiotik Secara
Mikrobiologi
<201> Endotoksin bakteri
<1321> Indikator biologik untuk Sterilisasi
<1352> Praktek Laboratorium Mikrobiologi yang
baik
<1371> Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas pada
Suatu Sediaan
 <51> Uji Batas Mikroba
• Dilakukan untuk memperkirakan jumlah mikroba aerob
viabel di dalam semua jenis perbekalan farmasi, mulai dari
bahan baku hinga sediaan jadi
• Untuk menyatakan bahwa perbekalan farmasi tersebut bebas
dari spesies mikroba tertentu
• Pengerjaan harus dilakukan secara aseptik
• Jika tidak dinyatakan lain, “inkubasi” adalah menempatkan
wadah di dalam ruang terkendali secara termostatik pada
suhu antara 30 – 35°C selama 24 – 48 jam
• Istilah “tumbuh” ditujukan untuk pengertian adanya dan
kemungkinan adanya perkembangan mikroba viabel
 Perhitungan
mikroorganisme
Ismi Rahmawati, M.Si., Apt
 Perhitungan mikroorganisme
Penentuan jumlah angka mikroorganisme sangat
penting dilakukan untuk menetapkan keamanaan
suatu sediaan farmasi dan makanan Dan untuk
penelitian produk farmasi
Metode perhitungan bakteri dengan 2 cara:
• Cara langsung (ruang penghitung dan dengan
spektrofotometri)
• Cara tidak langsung (Cara pengenceran dan
metode MPN)
 Perhitungan secara langsung menggunakan
ruang penghitung
Cara perhitungan mikroorganisme secara langsung
menggunakan ruang penghitung (direct counts using counting
chamber) relatif mudah tetapi tidak dapat membedakan sel
yang hidup dengan sel yang telah mati.

Sampel diteteskan pada alat (alat berupa lempeng kaca kecil

berisi kasa-kasa). Yang biasa dipakai adalah kamar hitung
model Petroff-Hauser dan Levy. Pengamatan dilakukan
mikroskop amati dulu dengan perbesaran 10 x untuk mencari
kotak besarnya, baru diamati dengan perbesaran 40 x dan
dihitung sedikitnya 50 kotak kecil.
Jika sel berada pada garis kotak hitung sel yang berada
pada garis atas dan kiri saja. Sel yang berada di garis
bawah dan kanan tidak dihitung. Jika sel terlalu padat
encerkan sampel dan lakukan percobaan dan
penghitungan kembali.
Kelemahan bilik hitung:
• Sel yang mati dan hidup semua akan terhitung
• Sel yang berukuran kecil kadang-kadang tidak terlihat
sehingga tidak terhitung
• Tidak dapat untuk menghitung sel bakteri pada sampel
yang banyak mengandung komponen misalnya
makanan.
 Perhitungan jumlah kuman:
Jumlal sel yang terhitung x jumlah kotak pada
ruang penghitung yang digunakan x volume setiap
kotak x faktor pengenceran sampel

Contoh soal:
Jumlah yeast dalam sampel =

25 X 5 X (0,05 X 0,05 X 0,1)X102

 Perhitungan kuman secara langsung dengan
turbidimeter/neflometer
Cara ini merupakan perhitungan kerapatan suatu materi
(sel) di dalam larutan yang diberi cahaya. Kualitas bias
cahaya yang dilakukan identik dengan kerapatan materi sel
yang berada di dalam larutan.
Kelemahan dari metode turbidimetri: Tidak bisa
menghitung bakteri yang medianya mengganggu
pengukuran (misalnya makanan).
Serapan (A) yang diperoleh adalah:
A = 2 - log %T
A= serapan
T= transmisi
 STANDAR MC FARLAN
• Membandingkan kekeruhan suspensi biakan
bakteri ~ 108 sel bakteri
 Cara Pengenceran
Cara paling umum digunakan adalah menghitung jumlah bakteri
hidup dengan metode pengenceran berseri dari sampel yang
mengandung mikroorganisme ditanam pada media pertumbuhan
yang sesuai.
Suspensi sampel dapat disebarkan (spread plate method) atau
ditaburkan (pour plate method) pada pelat agar dalam cawan petri
lalu diinkubasi pada kondisi dimana mikroorganisme bisa
bereproduksi dan dapat membentuk koloni yang terlihat tanpa
bantuan mikroskop.
Diasumsikan setiap koloni bakteri akan muncul dari satu sel bakteri.
Karena itu dengan menghitung jumlah koloni dan
memperhitungkan faktor pengenceran, jumlah bakteri pada
sampel asal bisa ditentukan
Kelemahan utama dari metode ini adalah
keselektifannya sehingga hasilnya kadangkala
sering bias.

Kondisi pertumbuhan kuman termasuk komposisi

media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu dan
pH, sangat menentukan jenis bakteri bisa tumbuh
dari seluruh populasi yang ada.

Tidak ada kondisi yang universal untuk membuat

seluruh organisme bisa tumbuh dengan baik.
Skema cara penghitungan mikroorganisme:
 Metode ALT (Angka Lempeng Total) atau TPC
(Total Plate Count)
Keuntungan metode TPC (ALT)
• Hanya sel yang hidup yang terhitung
• Beberapa mikrob/bakteri dapat dihitung sekaligus
• Dapat digunakan untuk mengisolasi bakteri yang mempunyai
bentuk tampak pertumbuhan spesifik
Kelemahannya
• Hasil perhitungan mungkin tidak menunjukkan jumlah sel yang
sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin
membentuk satu koloni
• Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda akan menghasilkan
nilai yang berbeda
 Untuk TPC (ALT) dipakai SPC (Standard Plate
Counts) dengan cara:

• Petri yang diperoleh mengandung koloni 30-300

• Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu
kumpulan koloni besar yang jumlahnya diragukan
dihitung sebagai satu koloni
• Satu deretan rantai koloni yang terlibat sebagai suatu
garis tebal dihitung sebagai satu koloni
 Cara melaporkan dan perhitungan koloni:
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka
yaitu:
• Angka pertama satuan
• Angka kedua desimal
• Jika angka ketiga ≥ harus dibulatkan angka lebih tinggi
pada angka ke …
Contoh:
ALT air susu= 2,3 X 10 2 uk/ml
ALT bedak = 1,45 X 10 1 = 1,5 X 10 1 uk/ml
 2.Jika pada semua pengenceran dihasilkan < 30
koloni berarti pengenceran yang dilakukan
terlalu tinggi karena jumlah koloni pada
pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya
dilaporkan sebagai < 30 koloni x besarnya
pengenceran, tetapi jumlah sebenarnya harus
dicantumkan dalam tanda kurung
Contoh:
Pengenceran jumlah bakteri
10-1 29
10-2 10
10-3 2
 – Jika pada semua pengenceran dihasilkan > 300
koloni berarti pengenceran yang dilakukan
terlalu rendah. Oleh karena itu yang dihitung
adalah jumlah koloni pada pengenceran tertinggi.
Hasilnya dilaporkan sebagai > 300 x faktor
pengenceran. Tetapi jumlah sebenarnya harus
dicantumkan dalam tanda kurung
• Contoh:

Pengenceran jumlah bakteri

10-1 450
10-2 350
10-3 309
 – Jika pada cawan dari 2 tingkat pengenceran
dihasilkan koloni dengan jumlah 30-300, maka
dibandingkan antara hasil pengenceran tertinggi
dengan pengenceran terendah dari kedua
pengenceran tersebut, jika ≤ 2 dilaporkan rata-
rata dari kedua nilai tersebut dengan
memperhitungkan faktor pengencerannya. Jika
perbandingannya > 2 yang dilaporkan adalah hasil
terkecil.
• Contoh: Pengenceran jumlah bakteri
10-1 350
10-2 209
10-3 39
 – Jika digunakan 2 cawan petri pada pengenceran
(diplo), data yang diambil harus dari kedua cawan
tersebut (tidak boleh hanya dari salah satunya).
Oleh karena itu harus dipilih tingkat pengenceran
yang menghasilkan kedua cawan diplo dengan
koloni antara 30-300.
• Contoh:

Pengenceran jumlah bakteri jumlah bakteri

cawan 1 cawan 2
10-1 290 200
10-2 100 108
10-3 2 3
 Penghitungan mikroorganisme dengan Metode
Angka Paling Mungkin
(Most Probable Number = MPN)

Pendekatan lain untuk perhitungan bakteri hidup

adalah dengan metode MPN.
MPN didasarkan pada metode statistik (teori
kemungkinan).
Metode MPN ini umumnya digunakan untuk
menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk
mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan
kontaminan utama sumber air minum.
Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah
bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri
koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum.
Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram negatif, batang pendek,
tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa menjadi asam
dan gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C.
Berdasar sifat coliform, maka bakteri ini dapat
memfermentasikan laktosa menjadi asam dan gas yang dideteksi
oleh berubahnya warna dan gas dalam tabung durham. Nilai
MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif (asam
dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi.
Dalam pemeriksaan bakteri coliform dalam suatu sampel
umumnya terdiri dari tiga tahap yaitu:
• uji penduga (presumptive test) untuk mengetahui
adanya bakteri yang mampu memfermentasi laktosa,
biasanya dilakukan inokulasi sampel pada media
Laktosa cair
• Uji penguat (Confirment test): untuk mengetahui
adanya bakteri coliform dengan cara menumbuhkan
pada media selektif yaitu media BGLB (Brilliant Green
Lactose Bile Broth) cair
• Uji pelengkap (Complete test): untuk menentukan jenis
bakteri coliform dengan cara identifikasi pada media uji
biokimia (IMVIC) atau ciri koloni pada media selektif
(endo agar) dan hasil pengecatan.
Cara kerja (tanpa pengenceran
sampel)
 1
MPN : Nilai MPN dari tabel X
pengenceran
 Ada 3 ragam yang biasanya dipakai pada pemeriksaan
MPN yaitu :

1. Ragam 511
•5 tabung yang berisi LB double x 10 ml
•1 tabung yang berisi LB single x 1 ml
•1 tabung yang berisi LB single x 0,1 ml
2. Ragam 555
• 5 tabung yang berisi LB double x 10 ml
• 5 tabung yang berisi LB single x 1 ml
• 5 tabung yang berisi LB single x 0,1 ml
3. Ragam 333
• 3 tabung yang berisi LB double x 10 ml
• 3 tabung yang berisi LB single x 1 ml
• 3 tabung yang berisi LB single x 0,1 ml
1. Ragam I : 5 x 10 ml, 1 x 1 ml, 1 x 0,1 ml.
Untuk spesimen yang sudah diolah atau angka
kumannya diperkirakan rendah.
2. Ragam II : 5 x 10 ml, 5 x 1ml, 5 x 0,1 ml.
Untuk spesimen yang belum diolah atau yang
angka kumannya diperkirakan tinggi. Kalau
perlu penanaman dapat dilanjutkan dengan 5 x
0,01 ml dan seterusnya.
3. Ragam III : 5 x 10 ml, 1 x 1 ml x 0,1 ml.
Adalah ragam alternatif untuk ragam II, apabila
jumlah tabung terbatas begitu pula persedian
media juga terbatas, cara pelaksanaannya
seperti ragam II (Soemarno, 2002).