l. Metoda hitungan mikroskopis (Metode BREED).

-Penentuan jumlah bakteri secara langsung dan

relatif cepat dilakukan. - Bakteri yang mati dan hidup akan terhitung semua, sehingga kemungkinan hasil akhirnya lebih besar daripada pemupukan bakteri menggunakan media (Total Plate Count). - Luas area pandang mikroskop yang akan digunakan harus dihitung terlebih dahulu dengan cara mengukur areal pandang menggunakan mikrometer. - Pada pewarnaan dengan metilen biru, sel - sel leukosit terlihat sebagai sel bulat atau berbentuk tidak teratur, berwarna biru dengan ukuran lebih besar dari pada bakteri.

 Cara :
- Ambil 0,01 ml. susu dengan pipet Breed. Ratakan di atas gelas obyek pada area seluas 1 cm2. Fiksasi di udara sampai kering. - Buang lemaknya dengan mencelupkannya pada alkohol 96% atau larutan xylol. - Warnai dengan metilen biru selama 10 menit. Buang sisa/kelebihan zat warna atau hisap dengan memakai tissue/kertas saring. - Bilas dengan air dan keringkan di udara. - Periksa di bawah mikroskop dengan pembesaran kuat. - Rata2 jumlah bakteri per areal lapangan pandang mikroskop ditentukan setelah mengamati areal pandang 10 - 60 kali (lihat tabel)

Jumlah rata2 bakteri per areal pandang < 0,5 0,5 1 1 -10 10 - 30 > 30

Jumlah areal pandang yg harus diamati 50 25 10 5 tbud (terlalu banyak untuk dihitung)

 Cara penghitungan :
Luas areal pandang mikroskop = r2 mm2 = r2/100 cm2. Contoh susu yang diratakan = 0,01 ml., maka jumlah susu per areal pandang mikroskop = r2/100 x 0,01 ml = r2/10.000 ml. Jumlah bakteri per ml. = 10.000/ r2 x jumlah rata2 bakteri per areal pandang.

ll. TOTAL PLATE COUNT ( TPC )

Prinsip : Apabila sel bakteri yang masih hidup
ditumbuhkan pada media agar, maka sel tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Keuntungan : - Hanya sel hidup yang dapat dihitung. - Beberapa jenis bakteri dapat dihitung sekaligus - Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi bakteri, karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel bakteri dengan pertumbuhan yang spesifik.

Kelemahan : Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel bakteri yang sesungguhnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni. Media dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda. Bakteri yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada media padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.

 Metode ini dilakukan setelah sampel susu

"diencerkan". Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000, dan seterusnya untuk memudahkan penghitungan jumlah koloni. Pengenceran dibuat tergantung pada mutu susu. Semakin tinggi jumlah bakteri yang terdapat di dalam susu, semakin tinggi pengenceran yang harus dilakukan. Pengambilan sampel dilakukan secara aseptis dan pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan sebanyak 25 kali untuk memisahkan sel - sel mikroba yang bergabung menjadi satu.

 Larutan yang digunakan sebagai pengencer

dapat berupa Phosphat Buffer, larutan garam fisiologis 0,85 - 0,9%, larutan Ringer, Peptone Water 1% atau aquadest steril. Untuk mengetahui jumlah bakteri pada permukaan luar bahan pangan, misalnya daging sapi, ayam atau ikan, pengambilan sampel dapat menggunakan metode usap (swab methode). Cara ini dilakukan dengan menggunakan lidi yang ujungnya dibalut kapas, kemudian diusapkan pada permukaan sampel dan lidi dimasukkan ke dalam larutan pengencer.

Menghitung jumlah bakteri dengan metode TPC

1. Metode Tuang (Pour Plate) Ke dalam cawan Petri yang steril di masukkan 1 ml. sampel susu
(dengan pipet steril). Tuangkan media steril yang telah didinginkan sampai suhu 450 500 C sebanyak 15 ml. Jangan membuka tutup cawan terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi. Media agar yang digunakan disesuaikan dengan jenis bakteri yang akan ditumbuhkan. Untuk sampel susu biasanya digunakan Nutrient agar atau Alkalis boullion agar. Gerakkan cawan Petri secara berputar - horisontal supaya media merata. Biarkan media memadat. Cawan Petri diinkubasikan dengan posisi terbalik di dalam inkubator, selama 24 jam pada suhu 370C. Suhu dan waktu inkubasi ditentukan sesuai dengan jenis bakteri yang akan dihitung. Sebaiknya dilakukan pemupukan secara duplo yaitu menggunakan 2 cawan petri untuk setiap pengenceran.

2. Metode Permukaan (Surface Plate)

Prosedur :

Tuangkan media agar steril ke dalam cawan Petri steril

dan biarkan memadat. 0,1 ml sampel susu yang telah diencerkan, di pipet pada permukaan media agar. Ratakan sampel di atas permukaan agar dengan menggunakan batang gelas bengkok (hockey stick) yang telah dicelup alkohol dan dibakar. Inkubasikan seperti pada metode tuang. Harus diingat karena sampel susu yang dihitung adalah 0,1 ml, maka harus dimasukkan ke dalam perhitungan pengenceran untuk mendapatkan "total count".

Cara menghitung jumlah bakteri :

Jumlah bakteri dihitung dengan mengalikan

jumlah koloni yang tumbuh pada media dengan pengencerannya. Jika dilakukan duplo, maka jumlah koloni dari cawan duplo dibagi 2.
Jumlah bakteri = jumlah koloni x 1/faktor pengenceran

 Skema Total Plate Count, metode tuang

A. Untuk sampel cair

Cara menghitung koloni pada cawan adalah :

1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang
mengandung jumlah koloni antara 30 - 300. 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni Yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni. 3. Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni 4. Cara penulisan : satu angka dimuka dan dibelakang koma kali pengenceran

Cara menghitung jumlah bakteri:

1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka yang.ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, berlaku pembulatan ke atas sebanyak satu angka.

Jumlah koloni per pengenceran 10-2 10-3 10-4

Standard Plate Count

2,3 x 104 1,3 x 105
2,0 x 106

Keterangan
28 dan 1 < 30 700>300 ; 10<30
tbud > 300

234 700
tbud

28 125
tbud

1 10
197

tbud = terlalu banyak untuk dihitung

2.

Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan angka kurang dari 30 koloni pada cawan Petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran terrendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.

Jumlah koloni per pengenceran 10-2 10-3 10-4

Standard Plate Count

Keterangan

16

< 3,0 x 103 (1,6 x 103)

Hitung pengenceran 10-2

3.

Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan Petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung, misalnya dengan cara menghitung jumlahnya pada 1/4 bagian cawan Petri, kemudian hasilnya dikalikan 4. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.

Jumlah koloni per pengenceran

10-2
tbud tbud

Standard Plate Count

Keterangan

10-3
tbud 325

10-4
355 20 > 3,0 x 106 (3,6 x 106) > 3,0 x 105 hitung pengenceran 10-4 hitung pengenceran 10-3

(3,3 x 105)

4.

Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah antara 30 - 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut 2, jumlah kuman adalah rata rata hasil dari dua pengenceran. Jika perbandingan hasil tertinggi dan terendah dari dua pengenceran > 2, yang dilaporkan hanya hasil terkecil.
Jumlah koloni per pengenceran 10-2 10-3 10-4 293 41 4 Standard Plate Count Keterangan

3,5 x 104

hitung rata2nya, karena41000/293 00 = 1,4 (<2) Hitung pengenceran 102, karena 32000/14000 = 2,3 (>2)

140

32

1,4 x 104

5. Jika digunakan 2 cawan Petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu, meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat di antara 30 300. Jumlah koloni per Standard Plate Count Keterangan pengenceran 10-2 10-3 10-4 175 208 138 168 16 17 42 43 1 0 2 4 1,5 x 104 1,9 x 104 rata2 dari pengenceran 10-2
rata2 dari pengenceran 10-2, karena perbandingan antara pengenceran 10-2 dan 10-3 = 2,8

290
280

36
32

4
1

3,1 x 104

rata2 dari pengenceran 10-2 dan 10-3, karena perbandingan antara kedua pengenceran adalah 1,2
Rata2 dari pengenceran 10-2 meskipun 305 > 300 (angka yg lain < 30)

291 305

25 27

3 0

3,0 x 104

lll. MOST PROBABLE NUMBER (MPN)

Koliform merupakan suatu grup bakteri yang digunakan
sebagai indikator adanya polusi kotoran dan .kondisi sanitasi yang tidak baik terhadap air, makanan, susu dan produk -produk susu. Adanya bakteri koliform di dalam makanan atau minuman menunjukkan kemungkinan adanya mikroorganisme yang bersifat enteropatogenik dan atau toksigenik yang berbahaya bagi kesehatan. Pemeriksaan bakteri koli pada susu mempunyai beberapa tujuan antara lain adalah : 1. Untuk mengetahui mutu susu 2. Memberikan gambaran tentang sanitasi pemerahan, pengangkutan dan proses2 lainnya. 3. Memberikan gambaran tentang kesehatan dan kebersihan ambing hewan. 4. Untuk mengetahui efisiensi pasteurisasi.

 PRINSIP.
Metode MPN menggunakan media cair dalam tabung reaksi dan perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung positif yaitu yang didapatkan pertumbuhan bakteri sete|ah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Bakteri koliform dapat dibedakan atas 2 grup yaitu : 1. Koliform fekal, misalnya Escherichia coli yang berasal dari kotoran hewan atau manusia.

 2. Koliform non-fekal, misalnya Enterobacter

aerogenes yang berasal/ditemukan pada hewan atau tanaman yang telah mati. Metode MPN digunakan untuk menghitung jumlah bakteri koliform dan E.coli dalam sampel. Metode ini cukup sensitif dan dapat mendeteksi koliform dalam jumlah yang sangat rendah. Ada beberapa cara yang dapat dilakukan pada metode MPN ini, misal seri 7 tabung, 9 tabung., 15 tabung dan lain2nya, Masing2 cara menggunakan tabel McCrady sendiri2. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi juga memerlukan peralatan yang lebih banyak.

Keterangan :
Pada prosedur tersebut dibuat pengenceran 10-1, 10-2,
10-3 (lihat metode TPC) kedlm BPW 0,1% Setiap pengenceran diinokulasikan per ml. kedalam 5 tabung reaksi berisi 10 ml BGBB atau Mc Conkey Broth (semuanya 15 tabung) Kedalam masing2 tabung reaksi dimasukkan tabung Durham dengan tujuan untuk menangkap gas yang diproduksi oleh bakteri. Ke 15 tabung tersebut diinkubasi pada 370 C selama 24 48 jam. Bila terdapat produksi gas dan asam pada BGBB atau Mc Conkey Broth diperkirakan positif koliform.

Pengujian terhadap koliform (I) :

Inokulasikan semua tabung positif pada media Mc Conkey Broth atau BGBB dengan cara streak pada media Eosin Methylen Blue Agar (EMBA, satu cawan Petri untuk satu pengenceran dan buat 5 area pada setiap cawan Petri untuk masing2 tabung). Inkubasikan pada 370 C selama 18 24 jam. Identifikasi koloni khas koliform, yang berwarna hitam atau bagian tengah berwarna gelap dengan bagian tepi transparan. Beberapa koliform membentuk koloni yang mukoid. Catat jumlah tabung dari setiap pengenceran yang menghasilkan koloni khas koliform pada media EMBA.

Pengujian terhadap Escherichia coli (II) : Dengan ose, inokulasikan semua tabung positif pada

media MC Conkey Broth atau BGBB kedalam 10 ml. BGBB dan inkubasikan pada suhu 44,5 450C selama 24 48 jam. Setiap tabung yang menunjukkan produksi gas, diduga positip E.coli. Inokulasikan semua tabung positip diatas dengan cara streak pada media EMBA (5 area pada setiap cawan Petri, lihat ad. 4). Inkubasikan pada 370C selama 18 24 jam. Identifikasi koloni khas tersebut pada Tryptone Water (setiap area pada 1 tabung) dan inkubasikan pada 44,5 450C selama 24 jam untuk meyakinkan bahwa koloni tersebut benar2 E. coli. Lakukan tes Indol pada setiap tabung dengan meneteskan reagen Kovach. Bila positip akan terlihat cincin merah muda.

 Cara perhitungan :
Koloni khas E. Coli yang tumbuh pada setiap area dihitung 1 atau dengan menghitung tabung Tryptone Water yang positip per pengenceran. Kemudian dicocokkan dengan tabel MC Crady.

SELAMAT BELAJAR