Kel 3

PENGERTIAN ANALISA KUANTITATIF DAN JENIS

ANALISA JUMLAH SEL DALAM MAKAN

Aufa Mufiddah (192210693)

Aulya Okta Yunas (192210694)
Dina Yusela (192210696)
PENGERTIAN ANALISA KUANTITATIF

Analisa kuantitatif adalah pekerjaan yang dilakukan untuk

mengetahui kadar suatu senyawa dalam sampel,dapat berupa
satuan mol, ataupun persentase dalam gram.
Teknik ini membutuh kan ketelitian yang tinggi karena
kesalahan dalam pengukuran akan menghasilkan kesalahan
data dalam penelitian. Analisa kuantitatif pada umunya
dilakukan setelah analisa kualitatif .
Terdapat tiga cara untuk menghitung atau mengukur jasad renik
dalam suatu suspensi atau bahan dalam metode kuantitatif yaitu :
Perhitungan jumlah sel
a. Hitungan mikroskopik
• Metode breed
• Metode petrof-hausser
• Hitungan Cawan
• MPN (Most Probable Number)
b. Perhitungan Massa Sel Secara Langsung
• Volumetrik
• Gravimetrik
• Kekeruhan (Turbidimetri)
c. Perhitungan Massa Sel Secara Tidak Langsung
• Analisis komponen sel ( protein,ATP dan sebagainya )
• Analisis produk katabolisme ( metabolit primer atau
sekunder,panas)
• Analisis konsumsi nutrien (karbon,nitrogen,oksigen,asam
amino dan sebagainya)
a. Perhitungan jumlah sel
• Metode Breed
Digunakan untuk menganalisa susu yang mengandung bakteri dalam
jumlah tinggi. Cara ini merupakan suatu cara yang cepat yaitu
menghitung bakteri secara langsung menggunakan mikroskop.cara ini
mempunyai kelemahan yaitu tidak dapat dilakukan terhadap susu
yang telah di pasteurisasi karena secara mikroskopi tidak dapat
dibedakan antaras sel-sel bakteri yang masih hidup atau yang telah
mati karena perlakuan pasteurisasi. Dalam metode ini,luas areal
pandang (field) mikroskop yang akan digunakan harus dihitung
terlebih dahulu. Hal ini dapat dilakukan dengan cara
mengukurdiameter areal pandang menggunakan mikrometer yang
dilihat melalui lensa minyak imersi.
Luas areal pandang mikroskop = π r2 mm2
= π r2 cm2
100
Dimana r = jari jari (mm) areal pandang mikroskop.Karena
contoh susu yang disebarkan pada gelas obyek seluas 1 cm 2 adalah
0,01 ml
 maka
 
Jumlah susu per areal pandang mikroskop = π r2 x 0,01
ml
100
= π r2 ml
10.000
Dengan kata lain , untuk mendapatkan 1 ml contoh
susu dapat diperoleh dari 10.000/ r2 kali areal pandang
mikroskop.Angka 10.000/ r2 disebut juga faktor
mikroskopik (FM), dan digunakan untuk mengubah jumlah
bakteri per areal pandang mikroskop menjadi jumlah
bakteri per ml
Jumlah bakteri = 10.000 × Jumlah bakteri per
Per ml π r2 areal pandang
Jumlah bakteri per areal pandang dihitung dengan rata-rata
pengamatan areal pandang. Jumlah areal pandang yang harus diamati
tergantung dan jumlah rata-rata bakteri per areal pandang, dan
ditentukan sebagai berikut

Jumlah rata-rata Jumlah areal pandang

bakteri yang harus diamati

Areal
<0,5 pandang 50

0,5 – 1 25

1 – 10 10

10 – 30 5

> 30 Dilaporkan sebagai TBUD

(terlalu banyak untuk

• Metode Petroff-Hauser
Dalam metode Petroff-Hauser, hitungan mikroskopik dilakukan dengan
pertolongan kotak kotak skala (gambar 8.1),dimana dalam setiap ukuran
skala seluas 1 mm2 terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm2,
dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil. Tinggi contoh yang
terletak antara gelas obyek dengan gelas dengan gelas penutup adalah 0,02
mm. Jumlah sel dalam beberapa kotak besar dihitung,kemudian dihitung
jumlah sel rata-rata dalam satu kotak besar. Jumlah sel per ml contoh
dapat dihitung sebagai berikut :
Jumlah sel per ml contoh = Jumlah sel per x 25 x 50 x 10 3

Kotak besar
= Jumlah sel per x 1,2 x 106
Kotak besar
Hitungan mikroskopik merupakan metode yang cepat dan
murah,tetapi mempunyai beberapa kelemahan sebagai berikut :
1. Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan denan sel-sel
hidup,oleh karena itu keduannya akan terhitung.
2. Sel-sel yang berukuran sangat kecil sukar dilihat di bawah
mikroskop,sehingga kadang-kadang tidak terhitung.
3. Untuk mempertinggi ketelitian,jumlah sel di dalam suspensi harus
cukup tinggi,misalnya untuk bakteri minimal 10 6 sel/ml. Hal ini
disebabkan dalam setiap bidang pandang diamati harus terdapat
sejumlah sel yan dapat dihitung.
4. Tidak dapat diunakan untuk menhitun jasad renik di dalam
bahan panan yang banyak menandun debris atau ekstrak
makanan,karena hal ini akan mengganggu dalam perhitungan sel.
• Hitungan Cawan
Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jika sel jasad renik yang
masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel jasad renik
tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat
dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan
mikroskop.
Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sentitif untuk
menentukan jumlah jasad renik karena beberapa hal yaitu:
1. Hanya sel yang masih hidup dapat dihitung
2. Beberapa jenis jasad renik dapat dihitung sekaligus.
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi jasad renik karena
koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang
mempunyai penampakan pertumbuhan spesifik.
metode hitungan cawan juga mempunyai-mempunyai kelemahan
sebagai berikut :
1. Hasil perhitungan tidak menunujukkan jumlah sel yang
sebenarnya,karena beberapa sel yang berdekatan mungkin
membentuk satu koloni.
2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan
nilai yang berbeda.
3. Jasad renik yang akan ditumbuhakan harus dapat tumbuh pada
medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas,tidak
menyebar.
4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga
pertumbuhan koloni dapat dihitung.
 Dalam metode hitungan cawan, bahan pangan yang diperkirakan
mengandung lebih dari 300 sel jasad renik per ml atau per gr atau per
cm (jika pengambilan contoh dilakukan pada permukaan), memerlukan
perlakuan pengeceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar didala
cawan petri. Setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut
dalam jumlah yang dapat hitung, dimana jumlah yang terbaik adalah
diantara 30 sampai 300 koloni. Penegeceran biasanya dilakukan secara
desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dan seterusnya atau 1:100, 1:10.000,
1:1.000.000 dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk pengeceran
dapat berupa larutan larutan bufer fosfat, 0,085% NaCl, atau larutan
Ringer.
Cara pemupukan dalam metode hitung cawan dapat dibedakan atas dua
cara yaitu metode tuang (pour plate)dan metode permukaan
(surface/spread plate). Dalam metode tuang , sejumlah contoh (1 ml
atau 0,01 ml) dari pengeceran yang dikehendaki dimasukkan kedalam
cawan petri, kemudian ditambahkan agar cair steril yang didinginkan
(47-500 C) sebanyak 15-20 ml dan digoyangkan supaya contoh
menyebar rata. Pada pemupukan dengan metode permukaan,terlebih
dahulu dibuat agar cawan kemudian sebanyak 0,1 ml contoh yang telah
diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut, dan diratakan dengan
batang gelas melengkung yang steril.
 Jumlah koloni dalam contoh dapat dihitung sebagai berikut :
Koloni per ml = jumlah koloni x 1
Atau per gr per cawan faktor pengeceran

Untuk melaporkan hasil analisa mikrobiologi dengan cara hitungan

cawan digunakan suatu standar yang disebut “Standard Plate
Counts” (SPC) sebagai berikut :
1. Cawan yang dipilh dan dihitung adalah yang mengandung jumlah
koloni anatra 3 dan 300.
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan satu
kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan
dapat dihitung sebagai satu koloni.
3. Satu deratan rantai koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal
dihitung sebagai satu koloni.
Dalam SPC ditentukan cara pelaporan dan perhitungan koloni sebagai berikut :
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dau angka yaitu angka pertama
(satuan) dan angka kedua (desimal). Jika angka yang ketiga sama dengan atau
lebih dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua. Sebagai
contoh, 1.7 x 103 unit koloni/ml atau 2.0 x 106 unit koloni/gr.
2. Jika pada semua pengeceran dihasilkan kurang dari 30 koloni pada cawan petri,
berarti pengeceran yang dilakukan terlalu tinggi, oleh karena itu jumlah koloni
pada pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam
tanda kurung.
3. Jika pada semua pengeceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan
petri,berarti pengeceran yang dilakukan terlalu rendah,oleh karena itu jumlah
koloni pada pengeceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan
sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan faktor pengeceran,tetapi jumlah yang
sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
4. Jika pada cawan petri dari dua tingkat pengeceran dihasilkan koloni dengan
jumlah anatra 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan
terendah dari kedua pengeceran tersebut lebih kecil atau sama dengan
dua,dilaporkan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengn eperhtungkan faktor
penecerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar
dari 2, yang dilaporkan hanya hasil terkecil.
5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengeceran,data yang diambil harus
dari kedua cawan tersebut,tidak boleh diambil salah satu. Oleh karena itu harus
dipilih tingkat pengeceran yang menghasilkan kedua cawan duplo dengan koloni
di antara 30 dan 300.
 Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah jasad renik
di dalam contoh berbentuk cair,meskipun dapat pula digunakan untuk
contoh berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspensi 1:10
dari contoh tersebut. Grup jasad renik yang dapat dihitung dengan
metode MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan
untuk pertumbuhan.
Dalam metode MPN, dari setiap pengeceran dimasukkan 1 ml masing-
masing ke dalam tabung yang berisi medium, di mana untuk setiap
pengeceran digunakantiga seri tabung dan lima seri tabung. Setelah
inkubasi pada suhu dan waktu tertentu,dihitung jumlah tabung positif
yaitu tabung yang ditumbuhi jasad renik yang dapat ditandai dengan
timbulnya kekeruhan. Misalnya pada pengeceran pertama, ketiga tabung
menghasilkan pertumbuhan positif,pada pengeceran kedua,dua tabung
positif,pada pengeceran ketiga satu tabung positif, dan pada pengeceran
terakhir tidak ada tabung yang positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0
dan jika diambil tiga pengenceran yang pertama kombinasinya akan
menjadi 3,2,1. Angka kombinasi ini kemudian di cocokkan dengan tabel
MPN (lampiran 2 s/d 4), dan nilai MPN dapat dicontoh sebagai berikut :
MPN contoh = Nilai MPN dari tabel x 1
Pengeceran tabung tengah

Metode MPN dapat digunakan untuk menghotung jumlah jasad

renik tertentu yang terdapat di antara campuran jasad renik
lainnya. Sebagai contoh, jika digunakan Lactose Broth maka
adanya bakteri yang dapat menfermentasi laktosa ditunjukkan
dengan terbentuknya gas di dalam tabung durham. Cara ini
biasa digunakan untuk menentukan MPN koliform terhadap air
atau minuman karena bakteri koliform termasuk bakteri yang
dapat menfermentasi laktosa.
b.Perhitungan Massa Sel secara Langsung
• Volumetrik
Sampel harus ditutup kapas supaya tidak terkontaminasi bakteri lain.
Caranya adalah 10 cc biakan cair mikroba dipusingkan dengan
menggunakan centrifuge biasa dan digunakan untuk
dipertanggungjawabkan, maka kecepatan dan waktu centrifuge harus
diperhatikan. Setelah diketahui volume mikroba keseluruhannya , maka
dapat dipakai untuk menentukan jumlah sel-sel mikroba tiap cc, yaitu
dengan membagi volume mikroba keseluruhan dengan volume rata-rata
tiap sampel. Dengan kecepatan 3500-6000 rpm dan dengan waktu 5-
10 menit.
• Gravimetri
Didasarkan pada stoikiometri reaksi pengendapan. Umumnya senyawa
yang ditambahkan dalam reaksi ini berlebih untuk menghasilkan endapan
• Kekeruhan (turbiditas/turbidimetri)
Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung
jumlah bakteri dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer.
Bakteri menyerap cahaya sebanding dengan volume total sel (ditentukan
oleh ukuran dan jumlah). Ketika mikroba bertambah jumlahnya atau
semakin besar ukurannya dalam biakan cair, terjadi peningkatan
kekeruhan dalam biakan. Kekeruhan dapat disebut optical density
(absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang gelombang 520 nm –
700 nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan
jumlah organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan)
hingga pengukuran optical density (ditentukan dengan spektrofotometer).
c.Perhitungan massa sel secara tidak langsung.
• Analisis komponen sel (protein,DNA,ATP,dsb)
• Analisis produk katabolisme (metabolit primer atau
sekuder,panas)
• Analisis konsumsi nutrien (karbon,nitrogen,oksigen,asam
amino,mineral,dsb)
Salah satu cara untuk menghitung jumlah sel di dalam suatu bahan secara
tidak langsung adalah dengan uji metilen biru. Uji metilen biru biasanya
dilakukan terhadap susu. Dalam uji ini ditambahkan sejumlah biru metilen
ke dalam susu,kemudian diamati kemampuan bakteri di dalam susu untuk
tumbuh dan menggunakan oksigen yang terlarut,sehingga menyebabkan
penurunan kekuatan oksidasi-reduksi dari campuran tersebut. Akibatnya
biru metilen yang ditambahkan akan tereduksi menjadi putih
metilen.waktu reduksi, yaitu perubahan warna biru menjadi puti,dianggap
selesai jika kira-kira empat lima dari contoh susu yang terdapat didalam
tabung (sebanyak 10 ml) telah berwarna putih. Beberapa penelitian
melaporkan perkiraan jumlah koloni yang diperoleh dengan metode
hitungan cawan dengan waktu reduksi menggunakan metode biru metilen
seperti tabel dibawah berikut. Semakin tinggi jumlah bakteri di dalam
susu,semakin cepat terjadinya perubahan warna dari biru menjadi putih.
Waktu reduksi biru metilen Perkiraan jumlah koloni (x

(jam) 104)

0,5-3,5 80 atau lebih

4 40

4,5 25

5 15

5,5 10

6 6

6,5-8 2,5

8 1
Metode biru metilen merupakan cara paling cepat dibandingkan
dengan metode hitungan cawan, dan lebih teliti karena bakteri yang
terdapat dalam keadaan berkelompok dimana dalam metode hitungan
cawan dihitung sebagai satu koloni, dalam metode BM hal ini tidak
berpengaruh terhadap perhitungan jumlah bakteri.
Kelemahan metode BM adalah karena cara ini tidak praktis dilakukan
terhadap susu yang mengandung bakteri hidup dalam jumlah
sedikit,misalnya susu yang telah mengalami pasteurisasi,dimana
dibutuhkan waktu yang lama sekali untuk mereduksi biru metilen.
Kelemahan lainnnya adalah karena dalam dalam uji biru metilen
diperlukan waktu pengamatanyang terus menerus, yaitu paling sedikit
selama 6 jam. Dengan metode ini juga tidak dapat dibedakan jenis
bakteri yang terdapat di dalam susu,mialnya bakteri gram atau
negatif,pembentukan spora,khamir dan sebagainya.
Thank You