ANGKA LEMPENG TOTAL

Angka lempeng total adalah angka yang menunjukkan jumlah bakteri mesofil dalam tiap-
tiap 1 ml atau 1 gram sampel makanan yang diperiksa.
Prinsip dari ALT adalah menghitung pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah
sampel makanan ditanam pada lempeng media yang sesuai dengan cara tuang kemudian
dieramkan selama 24-48 jam pada suhu 35-37°C (Joko Wibowo Ristanto, 1989).
Prinsip metode ALT ini adalah apabila ada satu sel mikroorganisme yang masih hidup
ditumbuhkan pada medium yang sesuai, maka sel tersebut akan berkembang biak dan
membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata pada media yang
digunakan dan setelah dilakukan inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
Metode penentuan angka lempeng total ini digunakan untuk menentukan jumlah total
mikroorganisma aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan termofilik).
a. Psikofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu kurang dari 20°C,
b. Mesofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu 20 °C-40°C
c. Termofilik adalah kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu lebih besar dari
40°C.
Angka lempeng total aerob adalah jumlah mikroorganisma hidup yang membutuhkan
oksigen yang terdapat dalam suatu produk yang diuji.
Pertumbuhan mikroorganisme aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan termofilik)
setelah contoh diinkubasikan dalam media agar pada suhu 35°C ± 1°C selama 24 jam 48 jam
± 1 jam mikroorganisme ditumbuhkan pada suatu media agar, maka mikroorganisma
tersebut akan tumbuh dan berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat
langsung dihitung.
Populasi bakteri dihitung dengan cara mengencerkan sampel atau bahan uji, dilanjutkan
dengan melakukan inokulasi semua hasil pengenceran didalam media pelat. Jumlah koloni
yang dapat tumbuh pada pelat dihitung secara manual dengan bantuan “Colony Counter”.
Jumlah koloni yang memenuhi ketentuan perhitungan adalah 25-30 sampai 250-300 koloni
pada media pelat.
Artinya: Bila percobaan menunjukan data terdapat populasi 20 koloni pada pelat hasil
pengenceran ke-4 dan 200 koloni pada pengenceran ke-3, maka kesimpulannya adalah
bahan uji mengandung = 200 x 10³ = 200.000 koloni bakter / mL atau perhitungan
berdasarkan pada koloni yang tumbuh pada hasil pengenceran ke-3.
Metode ini dapat dianggap yang paling sensitive karena sel hidup yang dapat terhitung,
beberapa jenis mikroorganisme dapat dihitung sekaligus dan dapat digunakan utuk isolasi
dan identifikasi karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel induk.

Uji angka lempeng total dapat dilakukan dengan dua teknik, yaitu teknik cawan tuang
(pour plate) dan teknik sebaran (spread plate). Pada prinsipnya dilakukan pengenceran
terhadap sediaan yang diperiksa kemudian dilakukan penanaman pada media lempeng
agar. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada lempeng agar dihitung setelah inkubasi pada
suhu dan waktu yang sesuai. Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni
bakteri antara 30-300. Angka lempeng total dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil
perhitungan dikalikan faktor pengenceran.
Jika sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel jasad renik
tersebut akan berkembang biak membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dapat
dihitung dengan menggunakan mata tanpa mikroskop. Metoda hitungan cawan merupakan
cara yang paling sensitive untuk menentukan jumlah jasad renik karena beberapa hal yaitu:
1. Hanya sel yang masih hidup yang dapat dihitung.
2. Beberapa jenis jasad renik dapat dihitung satu kali.
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identitas jasad renik karena koloni yang terbentuk
mungkin berasal dari jasad renik yang menetap menampakkan pertumbuhan yang spesifik.

· Perhitungan Angka Kuman

Menghitung atau menentukan banyaknya mikroba dalam suatu bahan (makanan, minuman,
dan lain-lain) dilakukan untuk mengetahui sampai seberapa jauh bahan itu tercemar oleh
mikroba. Dengan mengetahui jumlah mikroba, maka dapat diketahui kualitas mikrobiologi
dari bahan tersebut. Bahan yang dapat dikatakan baik jika jumlah mikroba yang terkandung
dalam bahan tersebut masih di bawah jumlah standar yang ditentukan oleh suatu lambaga.
Kandungan mikroba pada suatu bahan juga sangat menentukan tingkat kerusakannya, serta
dapat ditentukan oleh tingkat kelayakan untuk dikonsumsi.

Persyaratan Perhitungan Angka Lempeng Total

Adanya jumlah angka lempeng total yang ditemukan pada suatu sampel dapat dijadikan
acuan bahwa sampel tersebut masih layak untuk dikonsumsi atau tidak. Adapun untuk batas
persyaratan perhitungan dari angka lempeng total adalah :
1. Mikroba yang dapat dihitung 30-300 koloni
2. <30 koloni, dianggap cemaran
3. >300 koloni, spreader atau tak terhingga sehingga tak dapat dihitung
4. Jumlah bakteri adalah jumlah koloni x factor pengenceran
5. Perbandingan jumlah bakteri dari pengenceran berturut-turut antara pengenceran yang
akhir dengan pengenceran yang sebelumnya
6. Jika sama atau kurang dari 2 maka hasilnya dirata-rata
7. Jika lebih dari 2 digunakan pengenceran sebelumnya.

Cara Perhitungan Angka Lempeng Total

Dari semua cawan petri yang telah diinkubasi, dipilih cawan petri dari satu pengenceran
yang menunjukkan jumlah koloni antara 30-300. Apabila terdapat lebih dari satu cawan petri
yang menunjukkan pertumbuhan koloni antara 30-300 maka digunakan 2 pengenceran.
Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan tersebut dihitung lalu dikalikan dengan factor
pengencerannya.
Hasil menyatakan sebagai angka lempeng total dalam tiap gram contoh. Untuk beberapa
kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan diatas, maka petunjuk sebagai berikut :
1. Bila satu diantara petri dari pengenceran yang sama menunjukkan jumlah 30-300 koloni,
dihitung rata-rata kedua cawan dikalikan factor pengenceran.
2. Bila pada cawan petri pada kedua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan
jumlah antara 30-300 koloni, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan factor pengenceran
kemudian diambil rata-rata. Jika pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni lebih
besar dari 2kali jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat
pengenceran terendah (missal pada pengenceran 10-2 diperoleh 140 koloni dan pada
pengenceran 10-3 diperoleh 32 koloni, maka yang dipilih jumlah koloni pada tingkat
pengenceran 10-2 yaitu 140 koloni)
3. Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang menunjukkan jumlah antara 30-300
koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung
sebagai angka lempeng total perkiraan.
4. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan karena factor
inhibitor, maka angka lempeng total dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan factor
pengenceran terendah
5. Bila jumlah koloni percawan lebih dari 300, maka cawan dengan tingkat pengenceran
tertinggi dibagi dalam beberapa sector (2,4, dan 8) jumlah koloni dikalikan dengan factor
pengencerannya. Hasil dilaporkan sebagai angka lempeng total perkiraan.
6. Bila jumlah koloni lebih besar dari 200 dari bagian cawan, maka jumlah koloni adalah
200x8xfaktor pengenceran. Angka lempeng total perkiraan dihitung sebagai lebih besar
dari jumlah koloni diperoleh. (Srikandi Fardiaz, 1989)

· Total account
Total account yaitu jika perhitungan jumlah tidak berdasarkan pada jenis bakteri, tetapi
secara kasar terhadap golongan atau kelompok besar mikroorganisme umum seperti
bakteri, fungi mikroalge ataupun terhadap kelompok bakteri tertentu. Total count bacteria
misalnya ditentukan berdasarkan penamaan bahan dalam jumlah dan pengenceran tertentu
kedalam media umum untuk bacteria. Setelah melalui masa inkubasi pada temperature
kamar selama waktu maksimal 4 × 24 jam, perhitungan koloni dilakukan. Dianggap bahwa
tiap koloni berasal dari sebuah sel, maka jumlah koloni dapat diperhitungkan sebaga
jumlah sel mewakili dan terdapat didalam bahan yang dianalisis. Juga terdapat total count
fungi dilakukan metoda yang sama, kecuali temperature inkubasi 281˚C. Didalam pelaksaan
agar selama pertumbuhan tidak diganggu oleh koloni bakteri maka kepada permukaan
media sebelumya diberi bahan yang akan dianalisis, ditambah terlebih dahulu larutan asam
laktat 3%.
· Pengenceran
Bahan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel mikroba per mil per gram atau per
cm, memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di
dalam cawan petri, sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut
dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah diantara 30 dan 300.
Pengambilan contoh dilakukan secara aseptis dan pada setiap pengenceran dilakukann
pengocokan kira-kira sebanyak 25 kali untuk memisahkan sel-sel mikroba yang bergabung
menjadi satu. Pengenceran secara desimal memudahkan dalam perhitungan jumlah koloni,
sedangkan pengenceran yang bukan secara decimal, misalnya 1 : 5, 1 : 25, dan seterusnya
jarang dilakukan karena tidak praktis dalam perhitungannya. Untuk mengetahui jumlah
mikroba pada permukaan luar bahan, contohnya dapat dilakukan dengan metode sebar.
Sebagai salah satu metode perhitungan metode hitungan cawan ini memiliki kelebihan
dan kekurangan (Fardiaz,1992).
Ø Kelebihan dari metode hitungan cawan:
1. Masih hidup yang hidup yang dihitung
2. Beberapa jenis jasad renik dapat dihitung sekaligus
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi jasad renik karena koloni yang terbentuk
mungkin berasal sari suatu jasad renik yang memiliki penamapakan pertumbuhan spesifik.
Ø Kekurangannya, yaitu:
1. Hasil hitungannya tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel
yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni.
2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda.
3. Jasad renik yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk
koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.
Sediaan yang telah dihomogenkan dan diencerkan dengan pengenceran yang sesuai
ditanam pada media agar (PCA= plate count agar), setelah inkubasi pada suhu 370c selama
24-48 jam dihitung jumlah koloni yang tumbuh. Satuan perhitungan jumlah mikroba dikenal
dengan istilah Colony Forming Units (CFUs) untuk perhitungan bakteri dan kapang/khamir.
Factor pengenceran = pengenceran x jumlah yang ditumbuhkan
Jumlah koloni = jumlah x 1/ factor pengenceran
Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut:
1. Satu koloni dihitung 1 koloni.
2. Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.
3. Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.
4. Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.
5. Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidak dihitung.
6. KOLONI YANG BESARNYA KURANG DARI SETENGAH LUAS CAWAN DIHITUNG 1
KOLONI.

ANGKA KAPANG KHAMIR

Prinsip uji angka kapang/khamir pada makanan dan minuman sesuai metode analisis
mikrobiologi yaitu pertumbuhan kapang/khamir setelah cuplikan diinokulasikan pada
media Potato Dextrose Agar (PDA) yang ditambahkan kloramfenikol (100 mg/l) (0,01%)
sebagai media pertumbuhannya dan diinkubasi pada suhu 20°-25°C. Dan NaCl sebagai
pengencer sampelnya. (BPOM, 2006).
Angka Lempeng Total (ALT ) pada jamur merupakan jumlah koloni kapang atau khamir atau
kapang khamir per gram atau per mililiter sampel yang ditentukan melalui metode standar.
( BSNI, 2006)
Kapang adalah mikroba multiseluler, terdiri dari berbagai sel yang bergabung jadi satu. Di
bawah mikroskop dapat dilihat bahwa kapang terdiri dari benang yang disebut hifa,
kumpulan hifa ini dikenal sebagai miselium. Kapang tumbuh dengan cara memperpanjang
hifa pada ujungnya, dikenal sebagai pertumbuhan apical atau pada bagian tengah hifa yang
disebut pertumbuhan iterkalar. Hifa pada beberapa kapang mempunyai penyekat
melintang atau septa dan adanya septa ini dipergunakan untuk identifikasi. Hifa tersebut
memanjang di atas atau tembus melalui medium di mana kapang itu tumbuh (Soekarto,
2008). Khamir / ragi merupakan mikroba bersel tunggal bulat-lonjong dan memperbanyak
diri melalui pembentukan tunas atau askospora, tapi tidak membentuk miselium.

Prosedur pengujian angka Kapang pada makanan dan minuman sesuai metode analisis
mikrobiologi (MA PPOM 62/MIK/06) yaitu dengan cara aseptik ditimbang 25 g atau dipipet
25 ml sampel ke dalam kantong plastic stomacher steril. Ditambahkan 225 ml PDF,
dihomogenkan dengan stomacher selama 30 detik sehingga diperoleh suspense dengan
pengenceran 10-1 sesuai Disiapkan 3 buah tabung yang masing-masing telah diisi 9 ml ASA.
Dari hasil homogenisasi pada penyiapan sampel yang merupakan pengenceran 10-1,
dipipet 1 ml ke dalam tabung ASA pertama, dikocok homogen hingga diperoleh
pengenceran 10-2.
Dibuat pengenceran selanjutnya hingga 10-3. Dari masing-masing pengenceran dipipet 0,5
ml, dituangkan pada permukaan PDA yang sudah ditambahkan kloramfenikol segera
digoyang sambil diputar hingga suspense tersebar merata dan dibuat duplo. Untuk
mengetahui sterilitas media dan pengencer, dilakukan uji blangko. Pada satu lempeng PDA
yang sudah ditambahkan kloramfenikol diteteskan 0,5 ml pengencer dan disebaratakan dan
untuk uji media digunakan satu lempeng PDA + kloramfenikol. Seluruh cawan petri
diinkubasi pada suhu 20-25° C dan diamati pada hari ke tiga sampai ke lima.
Koloni kapang seperti kapas atau bulat dengan berbagai warna, permukaan kasar dan
koloni khamir memiliki bentuk bulat kecil putih, hampir menyerupai bakteri. Jumlah koloni
yang tumbuh diamati dan dihitung. Hasil pengamatan dan perhitungan yang diperoleh
dinyatakan sesuai persyaratan berikut, dipilih cawan petri dari salah satu pengenceran
yang menunjukkan jumlah koloni antara 50-150. Jumlah koloni dari kedua cawan dihitung
lalu dikalikan dengan faktor pengencerannya. Bila pada cawan petri dari dua tingkat
pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah antara 50 - 150, maka dihitung jumlah
koloni dan dikalikan faktor pengencerannya, kemudian diambil rata-rata.
Hasil dinyatakan sebagai angka kapang dalam tiap gram atau tiap ml sampel. Untuk
beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan diatas, maka diikuti petunjuk
sebagai berikut :
a) Bila hanya salah satu diantara kedua cawan petri dari pengenceran yang sama
menunjukkan jumlah antara 10-150 koloni dihitung dari jumlah koloni dari kedua cawan dan
dikalikan dengan faktor pengencerannya.
b) Bila dari dua tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni lebih besar
dari dua kali jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat
pengenceran terendah . Bila pada pengenceran yang lebih tinggi didapat jumlah koloni
kurang dari dua kali jumlah koloni pengenceran dibawahnya, maka diambi langka rata-rata
dari jumlah koloni dari kedua pengenceran tersebut. Hasil dinyatakan sebagai angka
kapang dalam tiap gram sampel
c) Bila dari seluruh cawan petri tidak ada satupun yang menunjukkan jumlah antara 10-150
koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung
sebagai angka kapang perkiraan.
d) Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan dan bukan disebabkan karena faktor
inhibitor, maka angka kapang dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan dengan faktor
pengenceran terendah ( < 1 x factor pengenceran terendah) (BBPOM RI,2006).

Dalam laboratorium, sterilisasi media menggunakan otoklaf yang menggunakan tekanan

yang disebabkan uap air, sehngga suhunya mencapai 1210C. Sterilisasi terlaksana bila
mencapai tekanan 15 lbs dan suhu 1210C selama 15 menit.

Secara kimiawi, media biakan dipilah menjadi media sintetik dan media non sintetik. Pada
media sintetik, kandungan dan isi bahan yang ditambahkan diketahui secara terperinci.
Media sintetik sering digunakan untuk mempelajari sifat faali dan genetika mikroba. Media
nonsintetik menggunakan bahan yang terdapat dari alam; bahan-bahan ini biasanya tidak
diketahui kandungan kimiawinya secara rinci. Media nonsintetik sering digunakan dalam
laboratorium mikrobiologi karena mudah disiapkan dan harganya lebih murah dibanding
media sintetik. Selain itu media ini dapat digunakan untuk membiakan berbagai macam
mikroba.

PENYIAPAN SAMPEL
a. STERILISASI ALAT
1. Cawan petri dan tabung reaksi dibersihkan, dengan menggunakan air. Kemudian
dikeringkan. Setelah itu dibungkus.
2. Sebelum tabung reaksi dibungkus, tabung disumbat dengan menggunakan kasa.
3. Setelah tabung reaksi dan cawan petri dibungkus, kemudian masukkan kedalam oven
dengan suhu 1800C selama 1 jam untuk disterilisasikan
4. Setelah 1 jam, tabung reaksi dan cawan petri yang dibungkus tersebut dikeluarkan dari
oven.
b. PEMBUATAN MEDIA
1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
2. Ditimbang PDA sebanyak 9,375 gram pada pada gelas kimia. Kemudian masukkan
kedalam Erlenmeyer 250 ml.
3. Dipipet aquades sebanyak 250 ml masukkan dalam Erlenmeyer kemudian tutup dengan
kapas dan kocok homogeny (duplo).
4. Kemudian PDA dipanaskan sampai mendidih hingga media larut dan homogeny
5. Setelah dipanaskan, disterilisasi dengan autoklof dengan suhu 1210C selama 15 menit.
Kemudian didinginkan, masukkan kedalam kulkas.
6. Media yang sudah padat dipanaskan kembali hingga mencair, dinginkan.
7. Media siap digunakan.