ACARA III

PERHITUNGAN MIKROBIA
A. Tujuan
Tujuan dari praktikum acara III Perhitungan Mikroba ini adalah untuk:
a. Mahasiswa dapat melakukan perhitungan mikroba secara langsung
dengan menggunakan Haemocytometer.
b. Maasiswa dapat melakukan perhitungan mikroba secara tidak langsung
dengan metode cawan.
B. Tinjauan Pustaka
Pertumbuhan artinya pertambahan substansi hidup yang tidak reversibel
biasanya disertai pertambahan ukuran dan pembelahan sel. Pada organisme
bersel banyak, ukurannya bertambah sedangkan pada organisme bersel satu
jumlah selnya yang bertambah. Meskipun demikian pada organism yang
bersel satu harus dibedakan pertambahan jumlah atau bertambahnya massa
sel (Schlegel, 1994).
Semua mikroorganisme memerlukan kondisi lingkungan tertentu untuk
pertumbuhan

dan

perbanyakannya.

Terdapat

beberapa

faktor

yang

mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme, diantaranya adalah :

a. Waktu menunjukkan laju perbanyakan bakteri bervariasi menurut spesises
dan kondisi pertumbuhannya. Pada kondisi optimal, hamper semua bakteri
memperbanyak diri dengan pembelahan biner sekali setiap 20 menit.
Untuk beberapa bakteri, memiliki waktu generasi, yaitu selang waktu
antara pembelahan, dapat mencapai waktu 12 menit. Jika waktu
generasinya 20 menit, pada kondisi yang cocok sebuah sel dapat
menghasilkan beberapa juta sel selama 7 jam. Selama fase lag, sel
melakukan metabolism dengan

cepat

tetapi aktivitas

ini hanya

menyebabkan sedikit kenaikan ukuran sel, bukan untuk peningkatan

jumlah sel. Selanjutnya sel memperbanyak diri secara cepat untuk
beberapa jam atau beberapa hari tergantung pada organisme dan kondisi
lingkungannya. Periode terjadinya perbanyakkan yang cepat ini disebut
fase log, karena nilai logaritmik jumlah organism berbanding langsung
dengan waktu. Koloni tersebut kemudian memasuki fase pertumbuhan

stasioner, jumlah sel yang dihasilkan seimbang dengan jumlah sel yang
mati. Akhirnya laju pertumbuhan menurun atau bisa juga disebut sebagai
fase penurunan.
b. Makanan mengandung

beberapa

nutrient

yang

diperlukan

oleh

mikroorganisme, yang menyediakan energi yang diperoleh dari substansi

yang mengandung karbon, nitrogen untuk sintesis protein, vitamin dan
yang berkaitan dengan faktor pertumbuhan, dan mineral.
c. Kelembaban
Seperti halnya semua organisme, bakteri juga memerlukan air untuk
mempertahankan hidupnya. Banyaknya air dalam pangan yang tersedia
dapat digunakan untuk pertumbuhan.
d. Suhu
Setiap mikroorganisme memiliki suhu pertumbuhan maksimal, suhu
pertumbuhan minimal dan suhu pertumbuhan optimal. Dimana suhu
pertumbuhan optimal adalah suhu yang memberikan pertumbuhan terbaik
dan perbanyakan diri tercepat. Suhu optimal biasanya lebih dekat ke suhu
maksimal dari pada suhu minimal. Mikroorganisme dapat diklasifikasikan
menjadi

tiga

kelompok

berdasarkan

suhu

pertumbuhan

yang

diperlukannya, yaitu Psikrofil (organism yang suka dingin) dapat tumbuh

baik pada suhu dibawah 200C dengan kisaran suhu optimalnya adalah 100C
sampai 200C. Mesofil (organisme yang suka pada suhu sedang) memiliki
suhu pertumbuhan optimal antara 200C-450C. Suhu termofil (organisme
yang suka pada suhu tinggi) dapat tumbuh baik pada suhu diatas 45 0C
dengan kisaran pertumbuhannya optimalnya adalah 500C sampai 600C.
e. Oksigen
Tersedianya oksigen dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme.
Bakteri dikelompokkan menjadi empat kelompok berdasarkan keperluan
oksigen. Aerob obligat hanya dapat tumbuh jika terdapat persediaan
oksigen yang banyak. Aerob fakultatif tumbuh dengan baik jika oksigen
cukup tetapi juga dapat tumbuh secara anaerob. Anaerob obligat hanya
dapat tumbuh jika tidak ada oksigen. Dan anaerob fakultatif tummbuh
sangat baik jika tidak ada oksigen tetapi mereka juga dapat tumbuh secara
aerob.
f. pH

Hampir semua mikroorganisme tumbuh baik jika pH pangan antara 6.6

dan 7.5 (netral). Bakteri, terutama pathogen toleransinya terhadap asam
lebih kecil bila dibandingkan dengan jamur dan khamir. Tidak ada bakteri
yang dapat tumbuh jika pH diibawah 3.5
(Gaman, 1992).
Ada berbagai macam cara untuk mengukur jumlah sel, antara lain
dengan hitungan cawan (plate count), hitungan mikroskopis langsung (direct
microscopic count), atau secara elektronis dengan bantuan alat yang disebut
penghitung coulter (coulter counter). Cara lain untuk menentukan jumlah sel
ialah dengan menyaring sampel dengan suatu saringan membran, saringan
tersebut lalu diinkubasi pada permukaan medium yang sesuai. Pada metode
hitungan mikroskopis langsung, sampel ditaruh di suatu ruang hitung (seperti
hemasitometer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan
bantuan mikroskop. Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan
tidak memerlukan banyak peralatan. Namun kelemahannya ialah tidak
membedakan sel-sel yang hidup dari yang mati. Kelemahan lainnya ialah
sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena
ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif
celup minyak (Hadioetomo, 1990).
Prosedur perhitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan metode
jumlah sel total. Jumlah seluruh sel dalam larutan contoh dapat dihitung
secara cepat dan langsung dengan menghitung jumlah sel yang terlihat di
bawah mikroskop. Prosedur yang paling sederhana ialah menghitung secara
mokroskopis masing-masing sel di dalam suspensi contoh dengan volume
yang sangan sedikit dan telah diukur dengan teliti. Perhitungan ini dilakukan
dengan menggunakan kaca slide khusus yang dikenal sebagai kotak
penghitung (counting chamber). Kaca slide ini terdiri dari kotak-kotak kecil
dengan ukuran tertentu dan luas tertentu dan dibentuk sedemikian rupa
sehingga suatu larutan tipis yang diketahui tebalnya dapat diletakkan di antara
kaca slide ini dengan gelas penutupnya. Dengan demikian volume cairan
yang berada di tiap-tiap kotak dapat diketahui secara pasti. Oleh karena

volume ini diketahui dan jumlah sel dalam tiap-tiap kotak dapat terlihat dan
dihitung,

maka

jumlah

sel/ml

larutan

asal

dapat

diketahui

(Buckle et al., 1987).

Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di
dalam bahan pangan terdiri dari metode hitungan cawan, Most Propable
Number (MPN), dan metode hitungan mikroskopik langsung. Dari metodemetode tersebut yang paling banyak digunakan adalah metode hitungan
cawan. Prinsip dari metode hitungan cawan yaitu jika sel mikroba yang masih
hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan
berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan
mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan
cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba. Metode hitungan
cawan sendiri dibedakan atas dua cara, yaitu metode tuang (pour plate) dan
metode permukaan (surface/ spread plate) (Fardiaz, 1993).
Pada metode tuang (pour plate) cara kerjanya adalah dari pengenceran
yang dikehendaki, sebanyak 1 ml atau 0.1 ml larutan tersebut dipipet kedalam
cawan petri menggunakan pipet 1 ml atau 1.1 ml. sebaiknya waktu antara
dimulainya pengenceran sampai menuangkan kedalam cawan petri tidak
boleh lebih lama dari 30 menit. Kemudian ke dalam cawan tersebut
dimasukkan agar cair steril yang telah didinginkan sampai 50 0C sebanyak
kira-kira 15 ml. Selama penuangan medium, tutup cawan tidak boleh dibuka
terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar. Segera setelah
penuangan, cawan petri digerakkan diatas meja secara hati-hati untuk
menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan melingkar
atau gerakan seperti angka delapan. Setelah agar memadat, cawan-cawan
tersebut diinkubasikan di dalam inkubator dengan posisi terbalik. Inkubasi
dilakukan pada suhu dan waktu tertentu sesuai dengan jenis mikroba yang
akan dihitung. Medium agar yang digunakan juga disesuaikan dengan jenis
mikroba yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi, sel-sel yang masih hidup
akan tumbuh dan membentuk koloni yang dapat terlihat langsung oleh mata
(Fardiaz, 1993).

Untuk melaporkan suatu hasil analisis mikrobiologi digunakan suatu

standar yang disebut Standar Plate Count (SPC), yang menjelaskan
mengenai cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang
ada untuk menghitung jumlah koloni didalam suatu contoh. Cara menghitung
koloni pada cawan adalah sebagai berikut :
1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni
antara 30 dan 300.
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan
koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung
sebagai satu koloni.
3. Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal
dihitung sebagai satu koloni.
Data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti beberapa peraturanperaturan, yaitu :
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama
di depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka yang
ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka
lebih tinggi pada angka yang kedua.
2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan
angka yang kurang dari 30 koloni pada cawan pertri, hanya jumlah koloni
pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebaga
kurang dari 30 koloni dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi
jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan
lebih dari 300 koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada
pengenceran yang tertinggi yang dihitung.
4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan
jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan
terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2,
tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan
pengencerannya. jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah
lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil.

5. Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang
diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu
meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat
diantara 30 dan 300.
(Fardiaz, 1993).
Prosedur penumbuhan dalam agar untuk perhitungan sel-sel hidup
adalah prosedur yang paling sederhana. Dimana suatu contoh suspensi sel
atau bahan pangan homogenate diinokulasi ke dalam atau ke atas media
nutrient agar dan setelah diinkubasi, jumlah koloni yang terbentuk dihitung.
Karena satu koloni terbentuk dari satu sel maka jumlah koloni menunjukkan
jumlah sel dalam larutan asalnya. Prosedur ini hanya menghitung sel-sel yang
hidup dan sangat peka. Suspensi contoh yang mengandung sejumlah kecil sel
hingga 20 sel/ml masih dapat dihitung. Keuntungan lain adalah kemungkinan
untuk mengetahui berbagai jenis organisme yang berada dalam contoh dari
perbedaan bentuk koloni yang tumbuh dan kemungkinan mengisolasi tipe
koloni yang paling dominan untuk identifikasi taksonomi. Beberapa kerugian
dari perhitungan sel yang hidup adalah :
1. Kemungkinan terjadinya suatu koloni dari lebih satu sel seperti pada
organisme yang berbentuk pasangan, rantai atau kelompok-kelompok sel.
Hal tersebut dapat memperkecil perhitungan jumlah sel sebenarnya.
2. Kemungkinan adanya berbagai tipe sel dalam contoh yang tidak mau
tumbuh dalam media agar yang digunakan atau yang berada di
dalam suhu, pH, tekanan oksigen dari inkubasi yang dilakukan.
3. Koloni dari beberapa mikroorganisme terutama dari contoh bahan
pangan, kedang-kadang menyebar dipermukaan media agar,
sehingga

menutupi

pertumbuhan

dan

perhitungan

jenis

mikroorganisme lainnya.
4. Suspensi sel, termasuk bahan pangan homogenate perlu pengenceran
secara aseptik, sehingga sejumlah koloni yang terbentuk dalam satu
cawan petri adalah ai antara 30 dan 300. Jumlah koloni kurang dari
30 menghasilkan hitungan yang kurang teliti secara statistik, sedang

jumlah koloni lebih dari 300 akan memenuhi cawan dengan

menekan pertumbuhan koloni karena sifat bersaing dan merintangi.
5. Hasil yang diperoleh harus menunggu selesainya inkubasi yang
biasanya membutuhkan waktu 24 jam atau lebih.
(Buckle et al., 1987).
Metode perhitungan bakteri pour plate dan spread plate memiliki
perbedaan dalam proses kerjanya. Pada pour plate proses kerjanya yaitu
dengan lup inokulasi, pindahkan satu penuh suspensi asal ke tabung A
(medium agar cair steril yang agak dingin). Tabung A digelindingkan di
antara kedua tangan agar inokulumnya tercampur secara merata. Pemindahan
serupa dibuat dari A ke B dan dari B ke C. lalu isi setiap tabung dituangkan
kedalam cawan petri terpisah. Setelah inkubasi cawan-cawan diperiksa kalaukalau ada koloni-koloni yang terisolasi. Dari cawan yang terisikan kolonikoloni terisolasi, dapat diisolasi biakan murni mikroorganisme dengan
memindahkan sebagian dari satu koloni kedalam tabung berisi medium steril.
Sedangkan untuk metode

spread plate yaitu inokulum digoreskan

dipermukaan medium agar nutrien, dalam cawan petri dengan jarum pindah
(lup inokulasi). Diantara garis-garis gores akan terdapat sel-sel yang cukup
terpisah-pisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni-koloni terpisah
(Pelczar, 1986).
Perhitungan total bakteri hidup merupakan cara standar yang dapat
dilakukan. Metode ini disebut baik karena mereka memfasilitasi analisis atau
memungkinkan pembacaan cepat hasil. Metode ini meningkatkan efisiensi di
laboratorium, meskipun dalam beberapa mereka waktu inkubasi mirip dengan
yang ada pada metode konvensional (Beloti et al., 2002).
Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk
menghitung jumlah mikroba karena beberapa alasan yang menguntungkan,
yaitu :
1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung.
2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus.

3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni

yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel mikroba dengan
penampakkan pertumbuhan spesifik.
(Fardiaz, 1993).
Metode pour plate memungkinkan pertumbuhan dalam agar nutrien
(anaerob

fakultatif),

serta

pada

permukaan.

Namun,

beberapa

mikroorganisme yang relatif peka panas dapat rusak oleh agar meleleh.
Metode spread plate menghindari masalah ini dan memungkinkan
pengamatan berbagai jenis koloni lebih mudah karena memungkinkan juga
pemilihan isolat (Alatossava et al., 2007).
Mikroorganisme dibiakkan di laboratorium pada bahan nutrien yang
disebut medium. Banyak sekali medium yang tersedia, macam-macamnya
bergantung

kepada

banyak

factor,

salah

satu

diantaranya

ialah

mikroorgnaisme yang akan ditumbuhkan. Bahan yang diinokulasikan pada

bahan disebut inokulum. Dengan menginokulasi medium agar nutrien
(nutrient agar) dengan metode cawan gores atau metode cawan tuang, sel-sel
akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikroba individu itu
memperbanyak diri sedemikian cepatnya sehingga di dalam waktu 18 sampai
24 jam terbentuklah massa yang dapat dilihat dan dinamakan koloni dan
koloni ini dapat dilihat meskipun tidak menggunakan alat. Setiap koloni yang
berlainan dapat mewakili macam organisme yang berbeda-beda, setiap koloni
agaknya merupakan biakan mikroorganisme. Jika dua sel mikroba pada
inokulum asal terlalu berdekatan letaknya pada medium agar, maka koloni
yang terbentuk dari masing-masing sel dapat bercampur dengan sesamanya
atau paling tidak bersentuhan, jadi massa sel yang diamati itu bukanlah suatu
biakan murni (Pelczar, 1986).
Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat
makanan (nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang
biakan bakteri. Untuk menaikan tekanan osmosis dan menjaga keseimbangan
fisikokhemis sel-sel bakteri yang tumbuh, kedalam media harus ditambahkan
NaCl. Wadah yang digunakan pada pembuatan media dipakai alat-alat gelas

dan stainless, sedangkan pH (derajat keasaman) media bisa diukur dengan

kertas penunjuk, pH meter dan zat penunjuk . Untuk sterilisasi media dapat
dilakukan dengan uap air panas bertekanan (autoclave), uap air panas yang
mengalir (steam) atau dengan saringan Seitz EK, sedangkan alat-alat gelas
disterilisasi dengan udara panas kering (oven). Setiap batch media yang sudah
dikontrol sterilitas dan mutunya harus disimpan pada suhu 5C-8C, selama
belum/tidak dipakai. Media dapat berbentuk padat, cair dan semi padat (semi
solid) (Hidayat, 1999).
Nutrien agar adalah kultur media yang digunakan untuk petumbuhan
mikroorganisme. Mikroorganisme membutuhkan nutrisi untuk sumber energi
dan kondisi lingkungan yang baik untuk tumbuh dan bereproduksi. Kultur
media digunakan di laboratorium untuk menyediakan kebutuhan nutrisi yang
berguna untuk pertumbuhan dan perkembangan (Arulanantham, 2012).
Agar merupakan campuran agarosa dan agaropektin. Polisakarida
utamanya

terdiri

dari

D-galaktosa

dan

3,6-anhidrogalaktosa

yang

disambungkan secara liniar dan silih berganti oleh ikatan -1,4 dan ikatan 1,3.
Agar diperoleh dari jenis Gelidium. Agar tidak dipengaruhi oleh kebanyakan
mikroorganisme. Hanya saja dapat diisolasi beberapa bakteri dari laut dan
ganggang laut yang menghidrolisis agar. Kerusakan agar dapat diketahui dari
berkurangnya jumlah koloni bakteri dalam lapisan agar (Schlegel, 1994).
Khamir (ragi) adalah mikroorganisme bersel tunggal dengan ukuran
antara 5 dan 20 mikron. Biasanya berukuran 5 sampai 10 kali lebih besar dari
bakteri. Terdapat berbagai macam bentuk ragi, dan bentuk ini seringkali
tergantung pada cara pembelahan selnya. Sel-sel khamir sering dijumpai
secara tunggal tetapi apabila anak-anak sel tidak dilepaskan dari induknya
setelah pembelahan maka akan terjadi bentuk yang disebut pseudomiselium.
Khamir tidak bergerak karena itu tidak mempunyai struktur tambahan di
bagian luarnya seperti flagella. Beberapa jenis khamir membentuk kapsul di
sebelah luar. Seperti bakteri, sel-sel khamir mempunyai lapisan dinding luar
yang terdiri dari polisakarida kompleks dan di bawahnya terletak membran
sel. Khamir dapat tumbuh dalam media cair dan padat dengan cara yang sama

seperti bakteri. Khamir merupakan bagian dari kelompok kapang dan

dibedakan dari hampir semua jamur yang lain oleh sifatnya yaitu bersel
tunggal dan membelah diri secara bertunas. Khamir terutama merupakan
organisme yang bersifat saprofitik terdapat pada daun-daun, bunga-bunga dan
eksudat dari tanaman (Buckle et al., 1987).
Pertumbuhannya, yeast memerlukan energi dari karbon. Gula adalah
substrat yang lebih disukai, oleh karenanya konsentrasi gula sangat
mempengaruhi kualitas alkohol yang dihasilkan. Untuk yeast, pH optimal
untuk pertumbuhannya ialah berkisar antara 4-4,5. Pada pH 3 atau lebih
rendah lagi, maka fermentasi alkohol akan berjalan dengan lambat.
Kandungan gas karbondioksida sebesar 15 gram/l (kira-kira 7,2 atm) akan
menyebabkan terhentinya pertumbuhan yeast (Widiastuti, 1984).
Pada metode hitungan mikroskopis langsung, sampel ditaruh di suatu
ruang hitung (seperti hemasitometer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara
langsung dengan bantuan mikroskop. Keuntungan metode ini ialah
pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak peralatan. Namun
kelemahannya ialah tidak membedakan selsel yang hidup dari yang mati,
dengan perkataan lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di
dalam polulasi. Kelemahan lain metode hitungan mikroskopis langsung ialah
sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena
ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif
celup minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga
menjadi lebih mudah dilihat. Kelemahan lain lagi ialah kadangkadang sel
cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan selsel individu. Cara
mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan
menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilenadiamina-tetraasetat
dan Tween 80 sebanyak 0,1 % (Hadioetomo, 1990).
Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel
mikroba per ml, per g, atau per cm permukaan, memerlukan perlakuan
pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar didalam cawan petri,
sehinggga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam

jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah antara 30
sampai 300. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1:10 ,
1:100, 1:1000, dan seterusnya. Pengenceran secara desimal memudahkan
dalam perhitungan jumlah koloni. Faktor pengenceran dapat dihitung dengan
rumus tingkat pengenceran dikalikan dengan jumlah yang ditumbuhkan.
Sedangakan jumlah koloni dapat dihitung dengan rumus jumlah koloni
dikalikan dengan 1/faktor pengenceran (Fardiaz, 1993).
Hemositometer adalah ruang kaca atau gelas yang dirancang
sedemikian rupa dengan sisi-sisi yang ditinggikan yang memiliki penutup
kecil tembus cahaya yang tepat 0,1 mm diatas lantai ruang. Untuk
menghitung ruang yang disketsa yaitu pada jumlah area permukaan yang
berukuran 9 mm2. Menghitung konsentrasi didasarkan pada volume dibawah
penutup kecil. Panjang persegi mempunyai volume sebesar 0,0001 ml (lebar
x panjang x tinggi : 0,1 cm x 0,1 cm x 0,1 cm) (Hansen, 2013).

C. Metodologi
1. Alat
a. Bunsen
b. Erlenmeyer
c. Gelas penutup
d. Haemocytometer
e. Kertas pembungkus
f. Mikroskop
g. Cawan Petri
h. Pipet ukur 1 ml
i. Tabung reaksi
j. Vortex
2. Bahan
a. Aquades steril 9 ml
b. Es teh
c. Medium Nutrien Agar

d. Suspensi Saccharomyces cerevisiae

3. Cara Kerja
a. Perhitungan Jumlah Bakteri secara Langsung
Larutan detergen

Pembersihan Haemocytometer dan

gelas penutupnya

Aquades, alkohol

Pembilasan
Pengeringan angin

Suspensi yeast

Penggojokkan hingga merata dengan

vortex
Pengambilan suspensi sampel dengan
pipet
Penetesan pada petak
Penutupan dengan gelas penutup
Peletakkan pada meja mikroskop
Pengamatan dengan perbesaran lemah
Penentuan petak yang akan dihitung
Pengamatan dengan perbesaran sedang
Pengaturan fokus dan Perhitungan
jumlah sel dalam setiap petak kecil

Pengenceran sampai jumlah sel setiap

petak 50
Pencatatan faktor pengenceran
Gambar 3.1 Diagram Alir Perhitungan Jumlah Bakteri secara Langsung
b. Perhitungan Jumlah Bakteri secara Tidak Langsung
Pemberian tanda pada belakang
petridish dengan pensil gelas sesuai
pengenceran

c.10-3, 10-4, 10-5

1 ml sampel

Pengambilan sampel dengan pipet

9 ml aquades steril
(pengenceran I : 10-1 )

Pemasukkan secara aseptik

Pembilasan
Penggojokkan

1 ml pengenceran 10-1 + 9 ml
aquades (pengenceran 10-2 )

Pemasukkan seacra aseptik

Penggojogkan

-2

1 ml suspensi pengenceran 10
+ 9 ml aquades (pengenceran
10-3 )

Pemasukkan secara aseptik

Penggojogkan

1 ml suspense pengenceran 103

+ 9 ml aquades steril 104

Penginokulasian secara aseptik ke

petridish (duplo)
Penggojogkan

Pengambilan 1 ml
Aquades 9 ml 10-5

Pemasukkan dan pengojokan

Penginokulasi dalam petridish

Penginokulasian secara aseptik dalam

petridish
Penuangan secara aseptic masingmasing medium NA dalam petridish
Penggoyangan bahan agar tercampur
Peletakkan petridish terbalik dan
penginkubasian selama 2 hari pada
300C
Perhitungan koloni pada masingmasing petridish
Pemasukkan data dalam tabel
Gambar 3.2 Diagram Alir Pehitungan Jumlah Bakteri secara Tidak
Langsung

D. Hasil dan Pembahasan

Tabel 3.1 Perhitungan Mikroba Secara Langsung
Kelompok
Jumlah Mikroba
1 dan 2
79
3 dan 4
78
5
106
6 dan 7
68
8 dan 9
60
10
45
11 dan 12
44
13 dan 14
45
15
89
Sumber : Laporan Sementara

Rata-rata
15.8
15.6
21.2
13.6
12
9
8.8
9
17.8

Jumlah Mikroba/ml
3.95 x 109
3.9 x 109
5.3 x 109
3.4 x 109
3 x 109
2.25 x 109
2.2 x 109
2.25 x 109
4.45 x 109

Ada berbagai macam cara untuk mengukur jumlah sel, antara lain
dengan hitungan cawan (plate count), hitungan mikroskopis langsung (direct
microscopic count), atau secara elektronis dengan bantuan alat yang disebut

penghitung coulter (coulter counter). Cara lain untuk menentukan jumlah sel
ialah dengan menyaring sampel dengan suatu saringan membran, saringan
tersebut lalu diinkubasi pada permukaan medium yang sesuai. Pada metode
hitungan mikroskopis langsung, sampel ditaruh di suatu ruang hitung (seperti
hemasitometer) dan jumlah sel dapat ditentukan secara langsung dengan
bantuan mikroskop. Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan
tidak memerlukan banyak peralatan. Namun kelemahannya ialah tidak
membedakan sel-sel yang hidup dari yang mati. Kelemahan lainnya ialah
sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena
ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif
celup minyak (Hadioetomo, 1990).
Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di
dalam bahan pangan terdiri dari metode hitungan cawan, Most Propable
Number (MPN), dan metode hitungan mikroskopik langsung. Dari metodemetode tersebut yang paling banyak digunakan adalah metode hitungan
cawan. Prinsip dari metode hitungan cawan yaitu jika sel mikroba yang masih
hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan
berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan
mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan merupakan
cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba. Metode hitungan
cawan sendiri dibedakan atas dua cara, yaitu metode tuang (pour plate) dan
metode permukaan (surface/ spread plate) (Fardiaz, 1993).
Pada percobaan perhitungan mikroba, hemasitometer adalah alat yang
digunakan untuk menghitung mikroba secara langsung dengan bantuan
mikroskop cahaya. Mikroskop cahaya digunakan untuk membantu melihat
yeast yang ada pada kotak perhitungan. Terdapat lima kotak perhitungan yang
ada pada hemasitometer yaitu pada sisi kanan atas, kiri atas, kanan bawah,
kiri bawah dan tengah.
Kaca slide (hemasitometer) yang terdiri dari kotak-kotak kecil dengan
ukuran tertentu dan luas tertentu dan dibentuk sedemikian rupa sehingga
suatu larutan tipis yang diketahui tebalnya dapat diletakkan di antara kaca

slide ini dengan gelas penutupnya. Dengan demikian volume cairan yang
berada di tiap-tiap kotak dapat diketahui secara pasti. Oleh karena volume ini
diketahui dan jumlah sel dalam tiap-tiap kotak dapat terlihat dan dihitung,
maka jumlah sel/ml larutan asal dapat diketahui (Buckle etal., 1987).

Gambar 3.1 Ukuran Hemasitometer

Menggunakan hemasitometer terdapat kelemahan dan kelebihannya.
Menurut Hadioetomo (1990), pada metode hitungan mikroskpis langsung,
sampel ditaruh di suatu ruang hitung (seperti hemasitometer) dan jumlah sel
dapat ditentukan secara langsung dengan bantuan mikroskop. Keuntungan
metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak
peralatan. Namun kelemahannya ialah tidak membedakan selsel yang hidup
dan yang mati, dengan perkataan lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total
sel yang ada di dalam polulasi.
Kelemahan lain metode hitungan mikroskopis langsung ialah sulitnya
menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena ketebalan
hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup
minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi
lebih mudah dilihat. Kelemahan lain lagi ialah kadangkadang sel cenderung
bergerombol

sehingga

sukar

membedakan

selsel

individu.

Cara

mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan

menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilenadiaminatetraasetat dan Tween 80 sebanyak 0,1% (Hadioetomo, 1990).
Pada praktikum kali ini dimaksudkan untuk mengetahui jumlah bakteri
yang hidup dengan menggunakan alat haemacytometer. Dimana dengan alat
tersebut lebih memudahkan kita dalam menghitung jumlah sel yang terdapat
dalam sampel dan tidak memerlukan banyak waktu untuk pelaksanaannya.
Pada hasil praktikum didapatkan data jumlah mikrobia per ml, yaitu 3.95x109,
3.9 x109, 5.3 x109, 3.4 x109, 3 x109, 2.25 x109, 2.2 x109, 2.25 x109, dan 4.45
x109. Data tersebut didapatkan dari hasil pembagian antara rata-rata sel yang
dibagi dengan 4 dan dikalikan dengan 106 dan fp. Data yang didapatkan
berbeda-beda pada masing-masing kelompok dan hal tersebut dapat
dipengaruhi oleh beberapa faktor.

Adapun faktor-faktor tersebut yaitu

kesalahan saat menghitung jumlah bakteri, kurang ketelitian dalam

mengamati jumlah bakteri, dan kesalahan dalam menentukan sel yang hidup
atau yang mati.
Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel
mikroba per ml, per g, atau per cm permukaan, memerlukan perlakuan
pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar didalam cawan petri,
sehinggga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam
jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah antara 30
sampai 300. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1:10 ,
1:100, 1:1000, dan seterusnya. Pengenceran secara desimal memudahkan
dalam perhitungan jumlah koloni. Faktor pengenceran dapat dihitung dengan
rumus tingkat pengenceran dikalikan dengan jumlah yang ditumbuhkan.
Sedangakan jumlah koloni dapat dihitung dengan rumus jumlah koloni
dikalikan dengan 1/faktor pengenceran (Fardiaz, 1993).
Yeast merupakan salah satu fungibersel tunggal (uniseluler), dengan
bentuk spheroid sampai ovoid dan kadang membentuk miselium semu
(pseudomicellium). Sebagian besar yeast melakukan reproduksi secara
aseksual melalui pembentukkan tunas (budding). Sebagai sel tunggal yeast
dapat tumbuh lebih cepat dibandingkan dengan kapang (mould) yang

tumbuh dengan pembentukan filamen. Disamping itu yeast lebih efektif

dalam memecah komponen bahan kimia dengan volume hasil yang lebih
banyak (Satife et al., 2009).
Menurut Buckle (1987) khamir (ragi) adalah mikroorganisme bersel
tunggal dengan ukuran antara 5 dan 20 mikron. Biasnya berukuran 5 sampai
10 kali lebih besar dari bakteri. Kapang berlawanan dengan bakteri dan
khamir, seringkali dapat dilihat dengan mata. Berbeda dengan bakteri dan
khamir, kapang adalah multiseluler, terdiri dari banyak sel yang bergabung
menjadi satu. Kapang tumbuh dengan cara memperpanjang hifa pada
ujungnya, dikenal sebagai pertumbuhan apikal. Berbeda dengan kapang,
khamir (yeast) mengalami bertumbuhan dengan cara bertunas (budding).
Pembelahan sel khamir terjadi secara aseksual dengan pembentukan tunas
(budding) suatu proses yang merupakan sifat khas dari khamir. Mula-mula
timbul suatu gelembung kecil dari permukaan sel induk. Gelembung ini
secara bertahap membesar dan setelah mencapai ukuran yang sama dengan
induknya terjadi pengerutan yang melepaskan tunas dari induknya. Sel yang
baru terbentuk selanjutnya akan memasuki tahap pertunasan kembali. Bagi
kebanyakan

khamir

seperti

Saccharomyces

cerivisae,

tunas

dapat

berkembang dari setiap bagian permukaan sel induk (pertunasan multipolar),

tetapi bagi beberapa spesies hanya pada bagian tertentu saja (Buckle, 1987).
Pertumbuhan yeast dipengaruhi oleh beberapa faktor, faktor yang
mempengaruhi pertumbuhan yeast adalah nutrisi, oksigen, kadar air,
temperatur, dan pH. Semua mikroorganisme memerlukan nutrien yang akan
menyediakan energi, nitrogen untuk sintesis protein, vitamin dan mineral.
Semua jamur dan khamir serta beberapa bakteri, termasuk hampir semua
patogen adalah bersifat heterotrofik atau tidak dapat membuat makanan
sendiri (Gaman, 1992).
Menurut

Widiastuti

(1984)

Untuk

pertumbuhannya,

yeast

memerlukan energi dari karbon. Gula adalah substrat yang lebih disukai,
oleh karenanya konsentrasi gula sangat mempengaruhi kualitas alkohol yang
dihasilkan. Untuk yeast, pH optimal untuk pertumbuhannya ialah berkisar

antara 4-4,5. Pada pH 3 atau lebih rendah lagi, maka fermentasi alkohol akan
berjalan dengan lambat. Kandungan gas karbondioksida sebesar 15 gram/l
(kira-kira 7,2 atm) akan menyebabkan terhentinya pertumbuhan yeast.
Tabel 3.2 Hasil Pengamatan dan Perhitungan Mikroba Beberapa Sampel
Jumlah
Sampe
Tingkat
Jumlah
Kel
Rata-Rata
Mikroba
l
Pengenceran
Koloni
(cfu/ml)
-3
1
10
135
1.8 x 105
15
10-3
226
Jus
2
10-4
256
4.5 x 106
6.7 x 106
-4
3
10
652
Jambu
4
10-5
80
6.7 x 106
-5
5
10
55
13
10-3
631
3.6 x 105
-3
6
10
92
7
10-4
155
5.5 x 106
Es Teh
4.2 x 106
-4
8
10
960
9&
10-5
42
4.2 x 106
10
Sumber : Laporan sementara

Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di

dalam bahan pangan terdiri dari metode hitungan cawan, Most Propable
Number (MPN), dan metode hitungan mikroskopik langsung. Dari metodemetode tersebut yang paling banyak digunakan adalah metode hitungan
cawan. Prinsip dari metode hitungan cawan yaitu jika sel mikroba yang
masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut
akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung
dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan
merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba.
Metode hitungan cawan sendiri dibedakan atas dua cara, yaitu metode tuang
(pour plate) dan metode permukaan (surface/ spread plate) (Fardiaz, 1993).
Pada metode tuang (pour plate) cara kerjanya adalah dari pengenceran
yang dikehendaki, sebanyak 1 ml atau 0.1 ml larutan tersebut dipipet
kedalam cawan petri menggunakan pipet 1 ml atau 1.1 ml. sebaiknya waktu
antara dimulainya pengenceran sampai menuangkan kedalam cawan petri
tidak boleh lebih lama dari 30 menit. Kemudian ke dalam cawan tersebut

dimasukkan agar cair steril yang telah didinginkan sampai 500C sebanyak
kira-kira 15 ml. Selama penuangan medium, tutup cawan tidak boleh dibuka
terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar. Segera setelah
penuangan, cawan petri digerakkan diatas meja secara hati-hati untuk
menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan
melingkar atau gerakan seperti angka delapan. Setelah agar memadat,
cawan-cawan tersebut diinkubasikan di dalam inkubator dengan posisi
terbalik. Inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu tertentu sesuai dengan
jenis mikroba yang akan dihitung. Medium agar yang digunakan juga
disesuaikan dengan jenis mikroba yang akan ditumbuhkan. Selama
inkubasi, sel-sel yang masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni
yang dapat terlihat langsung oleh mata (Fardiaz, 1993).
Berdasarkan tabel 3.2 diatas dapat diketahui jumlah mikroba pada
masing-masing sampel, yaitu jus jambu dan es teh. Pada praktikum kali ini
digunakan pengenceran 10-3, 10-4,

dan 10-5 pada setiap sampel dan

digunakan teknik duplo dalam menentukan jumlah mikroba yang terdapat

dalam cawan petri. Pada sampel jus jambu dengan tingkat pengenceran 10 -3,
10-4, dan 10-5 didapatkan nilai rata-rata secara berturut-turut adalah 1.8 x
105, 4.5 x 106 dan 6.7 x 106. Sedangkan pada sampel es the secara berturutturut didapatkan nilai rata-rata sebesar 3.6 x 105, 5.5 x 106, dan 4.2 x 106.
Dari nilai rata-rata tersebut dapat digunakan sebagai penentu dalam
menentukan jumlah mikroba. Dimana ada salah satu data hasil pengenceran
yang mengalami TBUD maka digunakan 2 pengenceran yang lain dan
dipilih dengan cara membagi pengeceran sesudah atau pengenceran
sebelum. Dan pada penentuan jumlah mikroba sampel jus jambu digunakan
nilai rata-rata yang memenuhi syarat perhitungan yaitu 6.7 x 10 6 sehingga
nilai jumlah mikrobanya 6.7x106 cfu/ml. Dan untuk sampel es teh
digunakan nilai yang memenuhi syarat perhitungan yaitu 4.2 x 106 sehingga
hasil tadi dirata-rata dan didapatkan nilai jumlah mikroba sebesar 4.2 x 10 6
cfu/ml.

Dalam praktikum ini terdapat kesalahan yang menyebabkan data tidak

sempurna, misalnya adanya spreader, jumlah koloni bakteri kurang dari 30
dan TBUD (tidak bisa untuk dihitung). Antara lain, kurang telitinya
praktikan dalam bekerja, kurang sterilnya alat, adanya faktor lingkungan
yang mempengaruhi kinerja praktikan, dan keterbatasan waktu dalam
melakukan praktikum. Pada hasil yang didapatkan memiliki perbedaan
antara sampel jus jambu dengan sampel es teh. perbedaan hasil tersebut
dapat disebabkan oleh beberapa faktor. Faktor-faktor yang mempengaruhi
perhitungan bakteri dengan metode TPC (Total Plate Count) menurut
Rahayu (2005) adalah jenis sampel yang digunakan, pengenceran yang
dilakukan, ada atau tidaknya spreader dan jumlah koloni antara 30-300,
kebersihan selama perhitungan dilakukan, kebersihan alat-alat yang
digunakan, medium penumbuhan bakteri yang dipakai, dan ketelitian saat
perhitungan.
Menurut Atlas (1946), metode perhitungan cawan adalah metode yang
umum digunakan untuk menghitung mikroorganisme yang layak (masih
hidup) khususnya bakteri. Untuk melakukan perhitungan pada jumlah
mikroba diatas maka menggunakan langkah-langkah yaitu yang pertama,
cawan yang dihitung dan dipilih adalah yang mengandung jumlah koloni
antara 30 sampai 300. Kedua, beberapa koloni yang bergabung menjadi satu
merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah kolonimya
diragukan dapat dihitung sebagai satu koloni. Ketiga, suatu rantai koloni
yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni
(Fardiaz, 1993).
Metode perhitungan bakteri pour plate dan spread plate memiliki
perbedaan dalam proses kerjanya. Pada pour plate proses kerjanya yaitu
dengan lup inokulasi, pindahkan satu penuh suspensi asal ke tabung A
(medium agar cair steril yang agak dingin). Tabung A digelindingkan di
antara kedua tangan agar inokulumnya tercampur secara merata.
Pemindahan serupa dibuat dari A ke B dan dari B ke C. lalu isi setiap tabung
dituangkan kedalam cawan petri terpisah. Setelah inkubasi cawan-cawan

diperiksa kalau-kalau ada koloni-koloni yang terisolasi. Dari cawan yang

terisikan

koloni-koloni

terisolasi,

dapat

diisolasi

biakan

murni

mikroorganisme dengan memindahkan sebagian dari satu koloni kedalam

tabung berisi medium steril. Sedangkan untuk metode spread plate yaitu
inokulum digoreskan dipermukaan medium agar nutrien, dalam cawan petri
dengan jarum pindah (lup inokulasi). Diantara garis-garis gores akan
terdapat sel-sel yang cukup terpisah-pisah sehingga dapat tumbuh menjadi
koloni-koloni terpisah (Pelczar, 1986).
Untuk membantu menghitung jumlah koloni dalam petridish dapat
digunakan colony counter yang biasanya dilengkapi electronic register.
Pada perhitungan dengan cara ini diperlukan beberapa syarat yang harus
dipenuhi yaitu :
1. Jumlah bakteri tiap petridish antara 30-300 koloni, jika memang tidak
ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300.
2. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas petridish,
koloni tersebut dikenal sebagai spreader.
3. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama
didepan koma dan angka kedua dibelakang koma.
4. Jika semua pengenceran yang dibuat menghasilkan angka kurang 30
koloni pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah
yang dihitung. Hasil dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan
besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan
dalam tanda kurung.
5. Jika semua pengenceran yang dibuat menghasilkan lebih dari 300 koloni
pada cawan petri, hanya koloni pada pengenceran tertinggi yang
dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih besar dari 300 dikalikan
dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus
dicantumkan dalam tanda kurung.
6. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan
jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan
terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2
maka

tentukan

rata-rata

dari

kedua

nilai

tersebut

dengan

memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil

tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil
yang terkecil.
(Nugraheni, 2010).
Pada hasil praktikum nilai jumlah mikroba tiap sampel berbeda,
dimana pada sampel jus jambu sebsesar 5650000 cfu/ml dan pada sampel es
the sebesar 4890000 cfu/ml. Perbedaan hasil tersebut dipengaruhi oleh
perbedaan kandungan gizi dari sampel yang mempengaruhi nilai jumlah
mikroba (Atlas, 1946).
Nutrien agar adalah kultur media yang digunakan untuk petumbuhan
mikroorganisme. Mikroorganisme membutuhkan nutrisi untuk sumber
energi dan kondisi lingkungan yang baik untuk tumbuh dan bereproduksi.
Kultur media digunakan di laboratorium untuk menyediakan kebutuhan
nutrisi

yang

berguna

untuk

pertumbuhan

dan

perkembangan

(Arulanantham, 2012).
Agar merupakan campuran agarosa dan agaropektin. Polisakarida
utamanya

terdiri

dari

D-galaktosa

dan

3,6-anhidrogalaktosa

yang

disambungkan secara liniar dan silih berganti oleh ikatan -1,4 dan ikatan
1,3. Agar diperoleh dari jenis Gelidium. Agar tidak dipengaruhi oleh
kebanyakan mikroorganisme. Hanya saja dapat diisolasi beberapa bakteri
dari laut dan ganggang laut yang menghidrolisis agar. Kerusakan agar dapat
diketahui dari berkurangnya jumlah koloni bakteri dalam lapisan agar
(Schlegel, 1994).
Prinsip hitungan cawan dapat digunakan untuk menghitung jumlah
mikroba di dalam contoh, yaitu dengan menggunakan Plate Count Agar
(PCA) sebagai medium pemupukan. PCA (Plate Count Agar) adalah suatu
medium yang mengandung 0,5% tripton, 0,25% ekstrak khamir, dan 0,1 %
glukosa sehingga semua mikroba termasuk bakteri, kapang, dan khamir
dapat tumbuh dengan baik pada medium tersebut. Komposisi medium
Nutrient Agar (NA) adalah ekstrak sapi 3 g, pepton 5 g, agar 15 g, air
destilata 1000 ml, pH 6.8. Komposisi Plate Count Agar (PCA) adalah

tripton 5 g, ekstrak khamir 1.5 g, destrosa 1 g, agar 15 g, air destilata 1000

ml, dan pH 7 (Fardiaz, 1993).
Perhitungan

dengan

menggunakan

metode

cawan

memiliki

kekurangan. Salah satunya adalah bakteri yang dapat dihitung merupakan

bakteri yang memiliki kemampuan untuk membelah sel pada tingkat yang
cukup untuk membentuk koloni. Metode perhitungan cawan bergantung
pada suhu, media dan lama inkubasi (Boulos, 1999).
Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk
menghitung jumlah mikroba karena beberapa alasan yang menguntungkan,
yaitu :
4. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung.
5. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus.
6. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni
yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel mikroba dengan
penampakkan pertumbuhan spesifik.
(Fardiaz, 1993).
Minuman teh seduhan dapat mengalami kerusakan secara
mikrobiologi seperti layaknya pada makanan dan minuman lainnya melalui
berbagai faktor. Faktor-faktor tersebut antara lain kontaminasi bahan-bahan
dasar pembuatan minuman teh seduhan oleh bakteri, alat-alat pembuatan,
dan faktor lingkungan penjualan. Kontaminasi bakteri patogen pada bahan
dasar pembuatan minuman dapat menjadi salah satu faktor terjadinya
keracunan minuman. Hal ini disebabkan tersedianya nutrisi dalam bahan
pembuatan minuman diperlukan oleh mikroba untuk pertumbuhan dan
aktivitas hidup.

Indikator adanya pencemaran air oleh bakteri patogen

penyebab penyakit saluran pencemaran makanan ialah adanya bakteri

coliform fekal. Bakteri coliform fekal ialah kelompok bakteri gram negatif
yang bersifat aerob dan anaerob fakultatif, berbentuk batang, tidak berspora,
merupakan flora normal saluran pencernaan manusia, contohnya E. Coli.
Minuman teh yang terkontaminasi oleh bakteri golongan coliform dan
coliform fekal dapat menimbulkan berbagai penyakit bagi manusia,
misalnya diare oleh bakteri E.coli, tifus yang disebabkan oleh Salmonella

typhosa, disentri basiler yang disebabkan oleh bakteri Shigella dysenteriae

dan penyakit kolera yang disebabkan oleh bakteri Vibrio cholerae
(Nisa, 2011).
Semua mikroorganisme memerlukan kondisi lingkungan tertentu
untuk pertumbuhan dan perbanyakannya. Terdapat beberapa faktor yang
mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme, diantaranya adalah :
1. Waktu menunjukkan laju perbanyakan bakteri bervariasi menurut
spesises dan kondisi pertumbuhannya. Pada kondisi optimal, hamper
semua bakteri memperbanyak diri dengan pembelahan biner sekali setiap
20 menit. Untuk beberapa bakteri, memiliki waktu generasi, yaitu selang
waktu antara pembelahan, dapat mencapai waktu 12 menit. Jika waktu
generasinya 20 menit, pada kondisi yang cocok sebuah sel dapat
menghasilkan beberapa juta sel selama 7 jam. Selama fase lag, sel
melakukan metabolism dengan cepat tetapi aktivitas ini hanya
menyebabkan sedikit kenaikan ukuran sel, bukan untuk peningkatan
jumlah sel. Selanjutnya sel memperbanyak diri secara cepat untuk
beberapa jam atau beberapa hari tergantung pada organisme dan kondisi
lingkungannya. Periode terjadinya perbanyakkan yang cepat ini disebut
fase log, karena nilai logaritmik jumlah organism berbanding langsung
dengan waktu. Koloni tersebut kemudian memasuki fase pertumbuhan
stasioner, jumlah sel yang dihasilkan seimbang dengan jumlah sel yang
mati. Akhirnya laju pertumbuhan menurun atau bisa juga disebut sebagai
fase penurunan.
2. Makanan mengandung beberapa nutrient yang diperlukan oleh
mikroorganisme, yang menyediakan energi yang diperoleh dari substansi
yang mengandung karbon, nitrogen untuk sintesis protein, vitamin dan
yang berkaitan dengan faktor pertumbuhan, dan mineral.
3. Kelembaban
Seperti halnya semua organisme, bakteri juga memerlukan air untuk
mempertahankan hidupnya. Banyaknya air dalam pangan yang tersedia
dapat digunakan untuk pertumbuhan.
4. Suhu

Setiap mikroorganisme memiliki suhu pertumbuhan maksimal, suhu

pertumbuhan minimal dan suhu pertumbuhan optimal. Dimana suhu
pertumbuhan optimal adalah suhu yang memberikan pertumbuhan
terbaik dan perbanyakan diri tercepat. Suhu optimal biasanya lebih dekat
ke suhu maksimal dari pada suhu minimal. Mikroorganisme dapat
diklasifikasikan menjadi tiga kelompok berdasarkan suhu pertumbuhan
yang diperlukannya, yaitu Psikrofil (organism yang suka dingin) dapat
tumbuh baik pada suhu dibawah 200C dengan kisaran suhu optimalnya
adalah 100C sampai 200C. Mesofil (organisme yang suka pada suhu
sedang) memiliki suhu pertumbuhan optimal antara 200C-450C. Suhu
termofil (organisme yang suka pada suhu tinggi) dapat tumbuh baik pada
suhu diatas 450C dengan kisaran pertumbuhannya optimalnya adalah
500C sampai 600C.
5. Oksigen
Tersedianya oksigen dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme.
Bakteri dikelompokkan menjadi empat kelompok berdasarkan keperluan
oksigen. Aerob obligat hanya dapat tumbuh jika terdapat persediaan
oksigen yang banyak. Aerob fakultatif tumbuh dengan baik jika oksigen
cukup tetapi juga dapat tumbuh secara anaerob. Anaerob obligat hanya
dapat tumbuh jika tidak ada oksigen. Dan anaerob fakultatif tummbuh
sangat baik jika tidak ada oksigen tetapi mereka juga dapat tumbuh
secara aerob.
6. pH
Hampir semua mikroorganisme tumbuh baik jika pH pangan antara 6.6
dan 7.5 (netral). Bakteri, terutama pathogen toleransinya terhadap asam
lebih kecil bila dibandingkan dengan jamur dan khamir. Tidak ada bakteri
yang dapat tumbuh jika pH diibawah 3.5
(Gaman, 1992).

E. Kesimpulan
Kesimpulan pada praktikum acara III Perhitungan Mikroba antara lain :
1. Adapun yang mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme adalah waktu,
suhu, pH, Oksigen, kelembaban.
2. Metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam
bahan pangan terdiri dari metode hitungan cawan, Most Propable
Number (MPN), dan metode hitungan mikroskopik langsung.
3. Untuk mendapatkan hasil analisis mikrobiologi digunakan suatu standar
yang disebut Standar Plate Count (SPC), yang menjelaskan mengenai
cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang ada
untuk menghitung jumlah koloni didalam suatu contoh.
4. Pada perhitungan langsung didapatkan data yang memiliki jumlah mikroba
paling banyak adalah kelompok 5 dengan hasil 106 dan jumlah dalam per
ml adalah 5.3 x 109 .
5. Hemasitometer adalah alat yang digunakan untuk menghitung mikroba
secara langsung dengan bantuan mikroskop cahaya.
6. Pada perhitungan tak langsung didapatkan 1 angka rata-rata mikroba yang
tidak memenuhi syarat perhitungan dan hal tersebut berlaku pada sampel
jus jambu maupun es teh.

7. Pada perhitungan tidak langsung didapatkan jumlah mikroba per ml adalah

6.7 x 106 cfu/ml pada sampel jus jambu dan 4.2 x 106 cfu/ml pada sampel
es teh.

DAFTAR PUSTAKA
Alatossava, P-Munsch, et al. 2007. A Faster and More Economical Alternative to
the Standard Plate Count (SPC) Method for Microbiological Analyses of
Raw Milks. Journal of Communicating Current Research and Educational
Topics in Applied Microbiology, 2007. Finland.
Atlas, Ronald M., Richard Bartha. 1946. Microbial Ecology Fundamentals and
Application. Addison-Wesley Publishing Company. Philipines.
Arulanantham, Ravathie., et al. 2012. Alternative Culture Media for Backterial
Growth Using Different Formulation of Protein Sources. Scholar Research
Library Vol. 2 No. 6 Hal : 697-700.
Beloti, Vanerli, et al. 2002. Quality of Pasteirized Milk Influences the
Performance of Ready-To-Use Systems for Enumeration of Aerobic
Microorganisms. Journal of International Diary No.12, 2002. Brazil.
Boulos, Lina., et al. 1999. Application of a New Rapid Staining Method for Direct
Enumeration of Viable and Total Bacteria In Drinking Water. Journal of
Microbiology Methods Vol 37 Hal : 77-86.
Buckle, K.A., et al. 1987. Ilmu Pangan. Jakarta: Universitas Indonesia (UI-Press).
Fardiaz, Srikandi. 1993. Analisis Mikrobiologi Pangan. Raja Grafinda Persada:
Jakarta.

Gaman, P.M., K.B Sherrington. 1992. Ilmu Pangan : Pengantar Ilmu Pangan,
Nutrisi dan Mikrobiologi. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
Hadioetomo, Ratna Siri. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta:
Gramedia.
Nisa, Ana Syarifatun., Utami Sri Hastuti., Agung Witjoro. 2011. Analisis
Mikrobiologi Minuman The Seduhan Berbeda Merk Berdasarkan Nilai
MPN Coliform Di Kota Malang. Biologi, Sains, Lingkungan, dan
Pembelajaran dalam Upaya Peningkatan Daya Saing Bangsa, Seminar
Nasional IX Pendidikan Biologi FKIP UNS.
Nugraheni, Ratna. 2010. Analisis Mikrobiologis Abon Ikan Tuna dan Kecap.
Universitas Sebelas Maret. Surakarta
Pelczar, Michael J., E.C.S Chan. 1986. Mikrobiologi. Universitas Indonesia (UIPress). Jakarta.
Rahayu, Asih. 2005. Deteksi Adanya Bakteri pada Air Minum dalam Kemasan
Galon. Surabaya.
Satife, et al. 2009. Potensi Yeast pada Pengurangan Konsentrasi Uranium dalam
Limbah Organik Tbp-Kerosin yang Mengandung Uranium. Prosiding
Seminar Nasional Teknologi Pengelolaan Limbah IX, 2009.
Schelegel, Hans G. 1994. Microbiologi Umum : edisi 6. Gadjah Mada University
Press. Yogyakarta.
Widiastuti, Dian dan Eska Pramesti. 1984. Proses Pembuatan Anggur dari Buah
Rambutan. Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik, Universitas
Diponegoro.

LAMPIRAN
A. Perhitungan Mikroba secara Langsung
Luas kotak sedang = P x l
= 0.2 mm x 0.2 mm
= 0.04 mm2
Volume
=Lxt
= 0.04 mm2 x 0.1 mm
= 0.004 mm3
1 ml
= 1 cm3
0.004 mm3 = 4 x 10-6 cm3
= 4 x 10-6 ml
Rumus umum :
Jumlah mikroba/ml =

Kelompok 1 dan 2
Jumlah mikroba/ml

15.8
x 106 x 103
4

= 3.95 x 109 cfu/ml

Kelompok 3 dan 4
Jumlah mikroba/ml

15.6
x 106 x 103
4

= 3.9 x 109 cfu/ml

Kelompok 5
Jumlah mikroba/ml

21.2
6
3
x 10 x 10
4

= 5.3 x 109 cfu/ml

Kelompok 6 dan 7
Jumlah mikroba/ml

13.6
6
3
x 10 x 10
4

= 3.4 x 109 cfu/ml

Kelompok 8 dan 9
Jumlah mikroba/ml

12
x 106 x 103
4

= 3 x 109 cfu/ml
Kelompok 10
Jumlah mikroba/ml

9
x 106 x 103
4

= 2.25 x 109 cfu/ml

Kelompok 11 dan 12
Jumlah mikroba/ml

8.8
x 106 x 10 3
4

= 2.2 x 109 cfu/ml

Kelompok 13 dan 14
Jumlah mikroba/ml

9
x 106 x 103
4

= 2.25 x 109 cfu/ml

Kelompok 15
Jumlah mikroba/ml

17.8
x 106 x 103
4

= 4.45 x 109 cfu/ml

B. Perhitungan Mikroba secara Tidak Langsung
Rata-rata
a. Kelompok 1 dan 15
135+ 226
x
=
2
= 180.5 x 103
= 1.8 x 105

b. Kelompok 2 dan 3
x

256 +652
2

= 454 x 104
= 4.5 x 106
c. Kelompok 4 dan 5
x

80+55
2

= 6.7 x 106
d. Kelompok 13 dan 16
631+ 92
x
=
2
= 361.5 x 103
= 3.6 x 105
e. Kelompok 7 dan 8
155+ 960
x
=
2
= 557.5 x 104
= 5.5 x 106
f. Kelompok 9 dan 10
x
= 4.2 x 106

Gambar 3.3 Perhitungan Tidak Langsung

Gambar 3.4 Perhitungan Tidak Langsung Jus Jambu