TRANSFORMASI GENETIK FAKTOR TRANSKRIPSI

OsMYB6 dan OsMYB7 PADA KULTIVAR PADI NIPPONBARE

UNTUK MANIPULASI KADAR LIGNIN

KELOMPOK C

ANA MULIANA 1711015220002

FACHRIDA RAHMAH Y 1711015120006
MONICA FAJARIAWATI 1711015120009
MUHAMMAD LUTHFI FIRDAUS 1711015320017
MUTHIA DETI MULYATI 1711015320019
RAUDATUL FITRIA HAVINA PUTRI 1711015320022
SHOPIA CHAIRINA 1811015320020
 Pengertian Bioteknologi

Bioteknologi merupakan suatu penerapan dari prinsip biologi,

biokimia dan rekayasa dalam pengolahan bahan dengan memanfaatkan
jasad hidup dan komponennya untuk menghasilkan barang dan jasa.
Bioteknologi akan selalu berkaitan denga berbagai reaksi biologis yang
dilakukan oleh jasad hidup baik berupa organel, sel, jaringan atau
molekul-molekul tertentu seperti DNA, RNA, protein ataupun enzim
(Yuwono, 2019).
 Teknik Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika adalah suatu teknologi yang

digunakan dalam memanipulasi sifat (DNA/gen) untuk tujuan
tertentu pada makhluk hidup (Nichol, 2008). Teknik rekayasa
genetik membuka peluang untuk mengisolasi gen ketahanan
dari organisme lain seperti cendawan, bakteri, virus atau dari
tanaman yang secara konvensional tidak dapat dilakukan.
Teknik rekayasa genetik telah diaplikasikan dalam
perbaikan sifat tanaman dan telah menghasilkan tanaman
produk rekayasa genetik (PRG) yang selama ini disebut dengan
tanaman transgenik, tanaman PRG siap dimanfaatkan bagi
kemajuan di berbagai bidang, khususnya pertanian (Herman,
2010).
 Lignin

Lignin, berasal dari bahasa Latin lignum yang berarti

kayu, adalah polimer organik kompleks yang memberi bentuk
struktur jaringan pada tanaman vaskular (Bajpai, 2017). Lignin
terbentuk dari gugus aromatik yang saling dihubungkan dengan
rantai alifatik yang terdiri dari 2-3 karbon. Lignin juga
merupakan bagian interal dari sekunder dinding sel dari
tanaman dan beberapa alga. Lignin adalah bagian terbesar dari
selulosa dan senyawa aromatik penyusun tanaman (Sari et al.,
2019).
JURNAL
CARA KERJA DAN BAHAN
BAHAN

• Benih padi kultivar Nipponbare • Media MS

• Aquadest • Media tanah : pupuk klandang (1:1)
• Banlate® SP 3% steril
• Alcohol 70% • Asetoastringen
• Bayclin® 70% • Cefotaxim 100 mg/L
• Tween • Higromisin 50 mg/L
• Plasmid pGWB2-OsMYB6 dan • TE RNAse
pGWB2-OsMYB7 • Dream Taq Green PCR Master Mix
• Plasmid kososng pC130 2X
• Agrobacterium tumefaciens strain • DNA genom padi
LBA4404 • Primer forward hpt-F 5’-
• Gene pulser XcellTM GATGCCTCCGCTCGAAGTAGC
• Kanamycin 50 mg/L G-3’
• Rifampisin 20 mg/L • Primer reverse hpt-R 5’-
• Media LB GCATCTCCCGCCGTGCAC-3’
• Media Asam Amino
• Media LS
Cara Kerja
Benih, Sterilisasi, dan Persiapan Kultur Kalus

Benih Kultivar
•Dikupas dan dicuci dengan air
•Disterilisasi dengan Banlate 3% selama 10 menit
•Disterilisasi dengan alcohol 70% selama 1 menit
•Disteriliasasi dengan bayclin 70% yang mengandung Tween
selama 30 m3nit
•Dicuci dengan aquadest steril sebanyak 5 kali (5 menit tiap
pencucian)
•Ditanam pada media induksi kalus selama 3 minggu dalam
keadaan gelap

Kalus

• Dipotong menjadi beberapa bagian

• Ditanamkan pada media induksi kalus pada suhu 28oC kondisi
gelap

Hasil
Plasmid dan Strain Agrobacterium
Plasmid pGWB2-OsMYB6 & pGWB2-OsMYB7
+
Plasmid kosong pC130
•Diintroduksi ke dalam Agrobacterium tumefasiens strain LBA4404
dengan gen pulser XcellTM

DNA plasmid

•Dipipet ke dalam 20 µl sel elektrokompeten Agrobacterrium

tumefasiens
Suspensi sel

•Dimasukkan ke dalam kuvet gen pulser dan 1 mL media YM cair

•Diinkubasi selama 3 jam (30oC, 250 rpm)
•Disebar di atas permukaan media agar YM yang mengandung
kanamycin 50 mg/L dan rifampisin 20 mg/L
•Dinkubasi selama 48 jam dengan suhu 30oC

Koloni bakteri
 • Diambil dan ditumbuhkan pada media LB padat mengandung
rifampisin 20 mg/L dan kanamisin 50 mg/L selama 3 hari dengan
suhu 30oC

Hasil kultur

•Disuspensikan dalam media asam amino cair + asetosiringon

•Dishaker hingga OD600 = 1

Larutan kokultivasi
Analisis Integrasi Gen

Daun padi

•Diekstraksi dengan metode CTAB

•Dilarutkan dalam TE RNAase

Total DNA
genom

•Didenaturasi awal dengan suhu 95oC selama 2 menit

•Diikuti siklus PCR (denaturasi (95oC, 30 detik), annealing (60oC, 30 detik), da
extension (72oC, 7 menit)).
•Dilanjutkan extension final dengan suhu 72oC selama 7 menit

Hasil
HASIL DAN PEMBAHASAN
 Efisiensi Transformasi

Kokultivasi semua konstruksi plasmid yang dilakukan secara bersamaan

menghasilkan pertumbuhan yang tidak persis sama, namun masih dalam rangkaian
waktu yang mirip. Kalus yang mampu berproliferasi pada media seleksi yang
mengandung higromisin diperkirakan merupakan kalus-kalus yang berhasil
ditransformasi. Pada Tabel 1, terlihat bahwa faktor transkripsi OsMYB6
menghasilkan 5 kalus yang dapat berproliferasi pada media seleksi, dimana semua
hasil proliferasi tersebut dapat beregenerasi menghasilkan plantlet untuk
selanjutnya diaklimatisasi, sehingga efisiensi transformasi dari faktor transkripsi
OsMYB6 adalah sebesar 5%. Faktor transkripsi OsMYB7 menghasilkan 16 kalus
yang mempu berproliferasi pada media seleksi, namun hanya 14 kalus yang
mampu beregenerasi dan diaklimatisasi, sehingga efisiensi transformasi dari faktor
transkripsi OsMYB7 adalah sebesar 10%. Efisiensi transformasi yang dihasilkan
dari faktor transkripsi OsMYB7 lebih besar dibandingkan dengan efisiensi
transfomasi dari faktor transkripsi OsMYB6 dan kontrol pC1305 (Windiastri et
al., 2018).
Gambar 1. Proses transformasi padi kultivar Nipponbare. a. Hasil induksi
kalus yang siap ditransformasi, b. Proses seleksi kalus hasil kokultivasi pada
media seleksi, c. Kalus proliferasi yang sedang beregenerasi, d. Plantlet yang
siap diaklimatisasi

Tabel 1. Rangkuman data hasil transformasi dan regenerasi padi kultivar

Nipponbare dengan masing-masing faktor transkripsi
 Hiei et al. (2008) dan Toki (2006) melaporkan kesuksesan melakukan
transformasi genetik pada padi kultivar Nipponbare dengan efisiensi transformasi yang
lebih tinggi (12-85%) dari pada yang dihasilkan pada penelitian ini. Namun pada
penelitian Rahmawati et al. (2010) dan Enggarini et al. (2017) dilaporkan bahwa
efisiensi transformasi pada padi kultivar Nipponbare juga berkisar pada 11%.
Transformasi padi Nipponbare dengan perantara Agrobacterium rhizobium
mempunyai efisiensi transformasi sebesar 11,4% (Rahmawati et al. 2010) sedangkan
transformasi padi dengan perantara Agrobacterium tumefaciens mempunyai efiseensi
sebesar 11.9% (Enggarini et al. 2017). Sahoo et al. (2011), menyebutkan bahwa
pemilihan benih dan lama penyimpanan media dengan hormon akan mempengaruhi
efisiensi transformasi. Makin tua benih yang digunakan sebagai bahan induksi kalus,
efisiensi transformasi akan semakin berkurang. Makin lama penyimpanan media dengan
hormon, maka aktivitas hormon akan semakin menurun dan dapat mengakibatkan
penurunan efisiensi.
Pada penelitian ini, diperkirakan penggunaan benih yang sudah berumur lebih
dari tiga tahun menyebabkan kualitas performa transformasi tidak dapat sebaik
transformasi padi pada umumnya.
 Analisis Integrasi Gen dengan Ampifikasi Gen

Gambar 2. Elektroforegram hasil amplifikasi gen hptII pada total

genom masing-masing tanaman transforman. Setiap sampel tanaman
menunjukkan keberadaan pita gen hptII sebesar 300 bp. Keterangan: M:
Marker 200 bp, P1: pGWB2-OsMYB6, P2: pGWB2-OsMYB7, W: air

Tabel 2. Hasil analisis integrasi gen

 Amplifikasi gen penanda seleksi dilakukan untuk mengetahui
apakah faktor transkripsi yang ditransformasi telah terintegrasi ke dalam
genom tanaman transforman. Amplifikasi gen penanda seleksi yang
digunakan yakni hptII, dari DNA total genom seluruh tanaman transforman
yang telah dihasilkan. Pada gambar 2, dapat dilihat bahwa sampel tanaman
transforman dapat mengamplifikasi gen hptII dengan panjang pita yang
sama dengan hasil amplifikasi dari DNA plasmid pGWB2OsMYB6 dan
pGWB2-OsMYB7. Sehingga dapat diartikan bahwa gen-gen yang
ditransformasikan telah terintegrasikan pada genom tanaman transforman.
Pada penelitian ini, walaupun efisiensi transformasi sangat kecil,
namun tingkat regenerasi cukup tinggi. Dari hasil regenerasi tersebut,
berdasarkan data dari Tabel 2 dapat dinyatakan bahwa tanaman yang
beregenerasi adalah tanaman yang mengintegrasikan gen-gen yang
ditransformasikan atau tanaman transforman. Dalam kegiatan transformasi
sering ditemukan tanaman non transforman yang lolos seleksi. Hal tersebut
biasanya dikarenakan kurangnya kadar zat antibiotik pada media yang
dikarenakan berkurangnya efektivitas zat antibiotik karena usia media atau
memang kadar antibiotik yang ditambahkan pada media sangat sedikit.
 Terintegrasinya gen-gen yang ditransformasikan pada semua
sampel tanaman transforman dapat diartikan bahwa transformasi
genetik faktor transkripsi OsMYB6 dan OsMYB7 serta pC1305 telah
berhasil dilakukan. Selanjutnya, untuk mempelajari tentang tanaman
transforman yang membawa konstruksi faktor transkripsi OsMYB6
dan OsMYB7, perlu dilakukan analisis molekular, agronomi serta
ekstraksi kandungan lignin pada tanaman transforman tersebut.
KESIMPULAN
 Transformasi faktor faktor transkripsi OsMYB6 dan
OsMYB7 serta pC1305 pada padi kultivar Nipponbare dengan
perantara Agrobacterium telah berhasil dilakukan dengan efisiensi
transformasi sebesar 5%, 11% dan 4% untuk faktor transkripsi
OsMYB6 dan OsMYB7 serta pC1305. Keberhasilan transformasi ini
dapat dilihat dengan dibuktikan dengan teramplifikasinya gen hptII
pada setiap sampel tanaman tranforman, yang berarti bahwa gen-gen
yang ditransformasikan telah terintegrasi pada tanamantanaman
transforman. Penelitian ini adalah penelitian awal untuk mempelajari
manipulasi kadar lignin pada tanaman padi. Pada saat ini telah
didapatkan tanaman T0 yang selanjutnya akan dianalisis pada
tingkat molekular, agronomi dan kadar lignin secara lebih lanjut
sebagai upaya untuk menganalisa strategi manipulasi kandungan
lignin pada tanaman padi.
thank you.