Comparison of Methods to Identify

P a t h o g e n s a n d A s s o c i a t e d Vi r u l e n c e
F u n c t i o n a l G e n e s i n B i o s o l i d s f r o m Tw o D i f f e r e n t
Wa s t e w a t e r Tr e a t m e n t F a c i l i t i e s i n C a n a d a
Etienne Yergeau, Luke Masson , Miria Elias , Shurong Xian , Ewa Madey , Hongsheng
Huang , Brian Brooks , Lee A. Beaudette
 Kelompok 3
Bioteknologi Lingkungan

1. Ali Fachrudin
2. Dhiya Lathifah
3. Pela Deskarina Reko
4. Rizky Muhammad Alfi

Program Studi Biologi

Fakultas Sains & Teknologi
UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta
LIMBAH CAIR
Penggunaan limbah cair kota
yang diolah (biosolids) sebagai
pupuk merupakan pilihan yang
menarik dan murah bagi petani.

3
BIOSOLID
Produk berbasis organik yang padat, semi padat atau cair dan
diproduksi dari pengolahan lumpur kota yang telah dirawat untuk
memenuhi standar, persyaratan, atau pedoman yurisdiksi termasuk
pengurangan patogen.
4
Canadian Council of Ministers of Environment (CCME)
 Canada

Maps USA

Diperkirakan 0,4
sampai 8 juta ton
biosolids kota
diproduksi setiap
tahun di Kanada,
Amerika Serikat dan
Eropa.
(Champagne P, Ademe E)

6
 Biosolids
Penekanan penyakit tanaman, Mengembalikan aliran
nutrisi ke tanah, dan perbaikan sifat fisik dari tanah
(misalnya absorbansi kelembaban) dengan meningkatkan
kandungan bahan organik secara keseluruhan.

Patogen
Menjadi sumber potensial patogen, endotoksin dan
bahan kimia dari sumber industri dan rumah tangga
yang dapat menyebabkan dampak lingkungan dan
kesehatan manusia yang merugikan
 Patogen Yang Menjadi Perhatian

Bakteri (misalnya Salmonella spp,

Escherichia coli , Campylobacter jejuni),
virus (misalnya Adenovirus, Rotavirus,
Hepatitis A), protozoa (misalnya
Cryptosporidium sp., Entamoeba histolytica
, Giardia lamblia) , dan cacing (misalnya
Ascaris lumbricoides , Ascaris suum ,
Trichuris trichiura).
 TUJUAN
Mengamati keefektifan berbagai proses pengolahan air limbah
yang berbeda melalui perubahan komposisi komunitas
taksonomi dan fungsional mikroba pada produk akhir dengan
pendekatan genomik dan Membandingkan metode deteksi
patogen tradisional dengan modern yaitu metode pendeteksian
molekuler.
 METODOLOGI
Lokasi
Penelitian dilakukan di dua fasilitas pengolahan biosolid Kanada berkode (Plant A dan Plant
C) yang diambil pada tiga interval waktu dalam satu tahun

Perlakuan Sampel
Plant A : limbah ditambah lumpur
aktif dengan proses pencernaan dan
pengeringan anaerobik, hasil
produk akhir pelet basah
Plant C : limbah ditambah lumpur aktif dalam
proses pengeringan/peletisasi melibatkan belt-
filter press dan proses akhir peletisasi dengan
pengering panas (250-450°C pada saat masuk, dan
80-130°C pada saat keluar)

Sampel biosolid diberi label dengan Sampel disimpan pada suhu 4°C
menggunakan kode (A atau C), (metode kultur) atau suhu -20°C
perawatan, dan sampling (ekstraksi DNA)
 METODOLOGI
Perlakuan Sampel

Tabel 1 . Kandungan air (kelembaban%) sampel ditentukan dengan menggunakan penganalisis

kelembaban elektronik (IR-35 Moisture Analyzer, Denver Instrument Co, Bohemia, NY, USA).
 METODE BERBASIS KULTUR
Fecal koliform dan E. coli pada
masing-masing sampel dievaluasi
menggunakan uji (MPN) sesuai
metode MFHPB-19
Produksi gas di media LST menunjukkan
dugaan positif koliform
Lalu kultur diinokulasi ke media BGLB
dengan inkubasi 48+4 jam suhu 35°C,
produksi gas di media BGLB
mengkonfirmasi positif koliform
90 ml air pepton ditambahkan ke 10g
sampel (pelet kering dilumatkan
sebelumnya) dilanjutkan dengan
homogenisasi.
Dibuat seri pengenceran 10x air pepton,
dan setiap 1 ml alikuot diinokulasikan ke
dalam 5 tabung media Lauryl Sulfate
Tryptose (LST)
Broth
Kultur LST positif diinokulasi ke media
EC Broth dan diinkubasi selama 48
jam suhu 45°C, produksi gas sebagai
deteksi penentuan koliform
 METODE BERBASIS KULTUR
Deteksi keberadaan E. coli dilakukan
Koloni dengan tipe morfologi E.
subkultur dari kultur EC Broth ke
coli disubkultur ke agar MacConkey
Levine’s EMBA, diinkubasi selama
18-24 jam suhu 35°C

Dihitung secara statistik dari tabel Isolat diidentifikasi sebagai E. coli

MPN menggunakan tes biokimia awal,
tingkat kemungkinan hadir organisme dikonfirmasi kembali menggunakan
target berdasarkan berat kering alat uji biokimia komersial
 METODE BERBASIS KULTUR
Deteksi secara 50 ml NB ditambah ke 25 g sampel dan
kuantitatif Salmonella menggunakan diinkubasi selama 1 jam suhu 35°C diikuti
metode MFLP-75 penambahan 175 ml NB

Kultur lalu diinokulasi ke media agar

Dibuat seri pengenceran 10x NB
Modifikasi Semi-padat Rappaport
homogenat dibagi menjadi tiap 5 tabung
Vassiliadis (MSRV), diinkubasi selama 72
dan diinkubasi selama 18-24 jam suhu
jam suhu 42°C
35°C
Isolat positif dipurifikasi dengan xylose
Kultur MSRV diduga positif Salmonella
lysine tergitol-4 (XLT-4) agar,
disubkultur ke agar MacConkey, lalu koloni
dikonfirmasi dengan uji biokimia (API
diuji pada media Triple Sugar Iron (TSI),
20E) dan uji serologis, serta uji ELISA
Lysin Iron Agar (LIA), dan Urea

Nilai MPN dari Salmonella per gram sampel

kering dihitung berdasar berat kering
EKSTRAKSI DNA

DNA akhir yang dimurnikan

DNA diekstraksi menggunakan Kit
digunakan untuk amplifikasi PCR
Isolasi DNA PowerMax® Soil
atau disimpan pada suhu -20 ° C
 SEKUENS GEN 16SrRNA
“Plant A August 2009 before-
Sekuens Bakteri
after” dan “Plant C
Universal
May 2009 before-after”

V3-5: Forward 5’
V1–V3: Forward 5’
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGAGA
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAG
CGCACTCGCCTACGGGAGG
TGCGTAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’
CAGCAG 3’

V3-V5: Reverse 5’
V1–V3: Reverse 5’
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGAGC
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGCT
ACTGTAGCCGT
CGACACATTACCGCGGCTGCTGG 3’
CAATTCMTTTRAGT 3’
 SEKUENS GEN cpn60
“Plant A August 2009 before” “Plant A August 2009 after” dan
dan “Plant C “Plant C
May 2009 before” May 2009 after”

Primer Forward: 5’
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGATCAG
ACACGGCIGGIGAYGGNACNACNAC 3’
Primer Reverse:
5’
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGATATC
GCGAGTCICCRAANCCNGGNGCYTT
‘3
Primer Forward: 5’
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGATCA
GACACGGCIGGIGAYGGNACNACNA
C 3’
Primer Reverse:
5’
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGATAT
CGCGAGTCICCRAANCCNGGNGCYT
T ‘3
MASTER MIX DAN PROFIL AMPLIFIKASI
PCR Mastermix: campuran volume akhir 50µl mengandung DNA 50ng, 25pmol
masing-masing primer dari 16S atau cpn60, 1X final Taq polimerase buffer, 2,5 unit
Taq polimerase (New England BioLabs Ltd, Pickering, ON, Kanada) dan 1 μl 10 mM
deoksinukleosida trifosfat.

Siklus PCR :
- Denaturasi awal = 94°C selama 5 menit Denaturasi Siklus 1 Siklus 2 Siklus 35
- Denaturasi = 94°C selama 30 detik 5M
Awal
dst
30 S 30 S
- Annealing = 56 ° C selama 30 detik untuk 94˚C (D)
Ekstensi
45 S 45 S 7M Akhir
16S V3-1, 72˚C (E)
4M
50°C untuk 16S V5-3 56˚C (A) 30 S 30 S 30 S Hold
55°C untuk cpn60 50˚C (A)
55˚C (A)
- Ekstensi = 72°C selama 45 detik
- Ekstensi akhir = 72°C selama 7 menit (35
siklus).
 REAL TIME PCR
uidA1-F: CAGCAATTGCCCGGCTTTCTTGTA dan
Kelimpahan E. coli diukur dengan
menggunakan dua set primer gen
beta-D-glukuronidase (uidA) yang
berbeda
Untuk identifikasi Salmonella ,
digunakan dua set primer yang
menargetkan gen invasi A ( invA dan
sal )
uidA1-R: GGCATTCAGTCTGGATCGCGAAA
(menghasilkan fragmen 83bp)
uidA2-F: GTATCGGTGTGAGCGTCGCAG dan
uidA2-R: GCGTGGTGATGTGGAGTATTGCC
(menghasilkan fragmen 154 bp)
invA-F:
GATTCTGGTACTAATGGTGATGATC dan
invA-R: GCCAGGCTATCGCCAATAAC
(menghasilkan fragmen 287 bp)
sal-F: GCGTTCTGAACCTTTGGTAATAA
dan sal- R: CGTTCGGGCAATTCGTTA
(menghasilkan fragmen 102bp)
MASTER MIX DAN PROFIL AMPLIFIKASI
Amplifikasi kuantitatif real-time PCR (qPCR) :
- Menggunakan instrumen Rotor Gene 3000 (Corbett Research, Mortlake, NSW,
Australia)
- Menggunakan QuantiTect SYBR Green PCR master mix (Qiagen) volume 20 μl
(mengandung 10 pmol masing-masing primer dan konsentrasi MgCl2 akhir dari
2,5mM untuk uidA1, dan 3,5mM untuk uidA2 , invA dan sal
Siklus PCR :
- Denaturasi awal 95°C selama 15 menit,
- Denaturasi 95°C selama 10 detik,
- Annealing 55°C selama 15 detik
- Ekstensi 72°C selama 15 detik diikuti sampai 40 siklus
- Fluoresensi diukur pada akhir setiap siklus di suhu 72°C
- Analisis kurva leleh (65-95°C) dilakukan pada akhir prosedur amplifikasi.

Kurva standar dihasilkan dari fragmen PCR menggunakan set primer dan DNA genom
dari E. coli K12 dan Salmonella enterica serovar Typhimurium
 AMPLIKON DAN SEKUENSING SENAPAN METAGENOMIK

Roche 454 GS FLX Titanium Sequencing (454 Life Sciences, Branford, CT, AS)
dilakukan di McGill University dan Genome Quebec Innovation Centre, Montreal,
QC, Kanada

Amplikon 16S dari "Plant A August 2009 before", "Plant A August 2009 after",
"Plant C May 2009 before", "Plant C May 2009 after" menggunakan satu jalur
masing-masing (dua set primer yang berbeda V3-1 dan V5 -3 dari sampel yang
sama digandakan di jalur yang sama)

Amplikon cpn60 dari "Plant A August

Sampel metagenomik senapan (“Plant A
2009" dan "Plant C May 2009"
August 2009 before" dan “Plant A
menggunakan dua jalur individual
Agustus 2009 after") menggunakan satu
(sebelum dan sesudah sampel
jalur masing-masing.
digandakan di jalur yang sama).
ANALISIS DATA SEKUENS
Data sekuens 16S utamanya dianalisis melalui
RDP pyrosequencing pipeline (http://
pyro.cme.msu.edu/)

Sekuens cpn60 dianalisis melalui RDP pyrosequencing

pipeline, kemudian dibandingkan dengan cpnDB
( http://cpndb.cbr.nrc.ca/ ) dengan menggunakan blastn

Untuk dataset metagenomik senapan, urutan ulangan yang dihasilkan

selama emulsi PCR dan tidak diturunkan secara terpisah dari data
lingkungan dikeluarkan dari dataset dengan menggunakan metode
Gomez-Alvarez (Gomez, et al., 2009)
 ANALISIS STATISTIKA
Dilakukan dua proporsi z-tes (Wang,
et al., 2007)

Analisis Prinsip Koordinat (PCoA)

berdasarkan jarak Bray-Curtis yang
dihitung dari kelimpahan genus
relatif di R menggunakan vegan
package

Korelasi rank-order Spearman

dilakukan di R
 Hasil
&
Pembahasan
Gambar 1. Komposisi komunitas tingkat filum bakteri (a) dan koordinat koordinat utama genus (PCoA) ordinasi
(b) untuk sekuens gen 16S rRNA dari daerah V1-V3 dan V3-V5 untuk sampel biosolid pra dan pasca perlakuan
di Plant A pada tanggal 4 Agustus 2009 dan Plant C pada tanggal 12 Mei 2009.

Yergeau E, Masson L, Elias M, Xiang S, Madey E, et al. (2016) Comparison of Methods to Identify Pathogens and Associated Virulence
Functional Genes in Biosolids from Two Different Wastewater Treatment Facilities in Canada. PLOS ONE 11(4): e0153554.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153554
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0153554
• Gambar 2. Komposisi tingkat komunitas filum bakteri (a) dan analisis koordinat utama tingkat genus (PCoA)
ordinasi (b) untuk sekuens gen 16S rRNA dari daerah V1-V3 dan V3-V5, sekuens gen cpn60 dan sekuens
metagenomik senapan untuk sampel biosolid pra dan pasca perlakuan pada Plant A pada tanggal 4 Agustus
2009.

Yergeau E, Masson L, Elias M, Xiang S, Madey E, et al. (2016) Comparison of Methods to Identify Pathogens and Associated Virulence
Functional Genes in Biosolids from Two Different Wastewater Treatment Facilities in Canada. PLOS ONE 11(4): e0153554.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153554
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0153554
• Tabel 2. Perbandingan dari 20 genera paling banyak yang ditentukan oleh metode sekuensing yang berbeda
pada biosolids Plant A, pra-perawatan (4 Agustus 2009).

Yergeau E, Masson L, Elias M, Xiang S, Madey E, et al. (2016) Comparison of Methods to Identify Pathogens and Associated Virulence
Functional Genes in Biosolids from Two Different Wastewater Treatment Facilities in Canada. PLOS ONE 11(4): e0153554.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153554
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0153554
Tabel 3. Perbandingan 20 genera paling banyak yang ditentukan oleh metode sekuensing yang berbeda pada
biosolids plant A, pasca perawatan (4 Agustus 2009).

Yergeau E, Masson L, Elias M, Xiang S, Madey E, et al. (2016) Comparison of Methods to Identify Pathogens and Associated Virulence
Functional Genes in Biosolids from Two Different Wastewater Treatment Facilities in Canada. PLOS ONE 11(4): e0153554.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153554
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0153554
 Tabel 4. Perbandingan 20 genera paling banyak yang ditentukan oleh sekuens amplikon 16S pada biosolids
plant C (12 Mei 2009).

Yergeau E, Masson L, Elias M, Xiang S, Madey E, et al. (2016) Comparison of Methods to Identify Pathogens and Associated Virulence
Functional Genes in Biosolids from Two Different Wastewater Treatment Facilities in Canada. PLOS ONE 11(4): e0153554.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153554
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0153554
 Tabel 5. Jumlah hit dalam dataset metagenom yang mencocokkan spesies / genera terpilih yang
mengandung strain patogen dalam sampel biosolids dari Plant A pada 4 Agustus 2009.

Yergeau E, Masson L, Elias M, Xiang S, Madey E, et al. (2016) Comparison of Methods to Identify Pathogens and Associated Virulence Functional Genes in Biosolids from Two Different
Wastewater Treatment Facilities in Canada. PLOS ONE 11(4): e0153554. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153554
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0153554
Tabel 6. Rata-rata kelimpahan E. coli, koliform dan Salmonella berdasarkan jumlah qPCR (per g) dan MPN (per
10 g).

Yergeau E, Masson L, Elias M, Xiang S, Madey E, et al. (2016) Comparison of Methods to Identify Pathogens and Associated Virulence
Functional Genes in Biosolids from Two Different Wastewater Treatment Facilities in Canada. PLOS ONE 11(4): e0153554.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153554
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0153554
 Tabel 7. Jumlah hit yang berhubungan dengan gen virulensi pada sampel Tanaman Contoh biosolids pada
tanggal 4 Agustus 2009.

Yergeau E, Masson L, Elias M, Xiang S, Madey E, et al. (2016) Comparison of Methods to Identify Pathogens and Associated Virulence
Functional Genes in Biosolids from Two Different Wastewater Treatment Facilities in Canada. PLOS ONE 11(4): e0153554.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153554
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0153554
Tabel 8. Deteksi spesies / genera terpilih yang dipilih yang mengandung strain patogen dalam biosolid dari Plant
A pada tanggal 4 Agustus 2009.

Yergeau E, Masson L, Elias M, Xiang S, Madey E, et al. (2016) Comparison of Methods to Identify Pathogens and Associated Virulence
Functional Genes in Biosolids from Two Different Wastewater Treatment Facilities in Canada. PLOS ONE 11(4): e0153554.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0153554
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0153554
 35

PEMBAHASAN

Pengolahan dewatering / pelletization menghasilkan penurunan DNA yang lebih besar dan
lebih konsisten daripada perlakuan pencernaan anaerobik. Namun, metode molekuler
menyoroti pergeseran kuat dalam komposisi masyarakat setelah pencernaan anaerobik
dibandingkan dengan pengeringan / peletisasi.

Komposisi komunitas mikroba yang lebih besar ini bergeser pada Plant A dibandingkan
dengan Plant C mungkin disebabkan oleh perbedaan komunitas awal di antara kedua
tanaman tersebut, namun secara alternatif, ini mungkin merupakan penyebab langsung
lingkungan anaerobik itu sendiri, karena banyak kelompok dominan bakteri setelah
pencernaan anaerobik berasal dari mikroorganisme anaerobik yang diketahui di dalam
filum Firmicutes dan Bacteroidetes .
 36
Non Molekuler
Walaupun cara termudah dan paling murah untuk mendeteksi patogen hidup, tidak
dapat mendeteksi bakteri yang layak tetapi tidak dapat dikultur (VBNC) yang
berpotensi dapat dihidupkan kembali dalam biosolids yang dicerna secara anaerob.
Deteksi patogen di
Biosolid Molekuler
Pada tingkat molekuler, qPCR dapat mendeteksi bakteri yang tidak dapat dikultur
dan dapat digunakan untuk mendeteksi adanya gen patogen spesifik pada
biosolids. Namun, berbagai kemungkinan target patogenik lagi membuat metode
semacam itu agak rumit. Dalam penelitian ini, qPCR tidak dapat mendeteksi
Salmonella dalam banyak sampel, sementara dideteksi dengan metode non
molekuler, cpn60 pyrosequencing dan sekuens metagenomik. kehadiran bakteri
VBNC, sel-sel mati dan DNA seharusnya membuat metode qPCR mendeteksi
lebih banyak patogen ini Penelitian sebelumnya telah melaporkan sensitivitas yang
lebih rendah untuk qPCR daripada metode kultur, terutama terkait dengan ukuran
sampel awal.
 37
Metagenomik
Keuntungan utama metagenomik , selain menghindari kemungkinan bias amplifikasi, adalah
pendeteksiannya tidak terbatas pada organisme target. Metode kultur dan qPCR hanya bisa
mendeteksi DNA organisme yang ditargetkan

Sedangkan sekuens metagenomik dan amplikon dapat mendeteksi DNA dari semua organisme
yang ada dalam sampel (termasuk eukariota dan virus). Misalnya virus, yang dapat menjadi
indikator efisiensi treatment biosolid, dapat mewakili hingga 10-14% dari total urutan dalam
kumpulan data metagenomik , tidak terdeteksi dengan metode lain.

Keuntungan utama lainnya dari sekuens metagenomik adalah kemampuan untuk mendeteksi
keseluruhan pelengkap gen fungsional dalam sampel lingkungan; Namun, terkait erat dengan
kualitas database yang digunakan. Seiring bertambahnya jumlah spesies yang beranotasi dan
disimpan ke dalam database yang relevan, pencarian kesamaan terhadap gen beranotasi akan
lebih berhasil
 “
38

Data penelitian ini menunjukkan bahwa sekuens metagenomik, bisa

menjadi metode pelengkap yang sangat baik untuk metode non
mulokuler untuk mendeteksi patogen, yang merupakan metode utama
yang digunakan oleh Canadian Food Inspection Agency (CFIA) untuk
mendeteksi patogen .Metagenomik tidak hanya mendeteksi semua
DNA spesifik organisme yang terdeteksi oleh metode lain, namun juga
mendeteksi sejumlah gen patogen potensial dan gen yang terkait
dengan virulensi sehingga metode lain tidak dapat dideteksi
Terima Kasih
Semoga Bermanfaat,