ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI

Klebsiella peunomoniae PADA SAMPEL FESES DAN SPUTUM

Di susun oleh:
Devi Yulyanti
411116057

PROGRAM STUDI D-3 ANALIS KESEHATAN

STIKES JENDRAL AHMAD YANI
CIMAHI
2018
 ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI

Klebsiella peunomoniae PADA SAMPEL FESES DAN SPUTUM

A. Hari dan Tanggal Praktikum :

Selasa – Kamis, 20 – 22 Maret 2018

B. Tujuan Praktikum
Untuk Isolasi dan Identifikasi bakteri Klebsiella sp pada sampel urin dan
feses
C. Teori Dasar
Klebsiella sp Bakteri ini berasal dari family Enterobacteriaceae Klebsiella
pertama kali diteliti dan diberi nama oleh bacteriologist Jerman yang bernama
Edwin Klebs (1834-1913). Penyakit yang ditimbulkan oleh bakteri ini antara
lain adalah bronkopneumoniae dan pneumonia Hampir semua pneumonia
disebabkan oleh bakteri ini. Klebsiella pneumonia terdapat dalam saluran
nafas dan feses sekitar 5 % orang normal dan dapat menyebabkan pneumonia
bacterial (Patrick, 2005;Elmer, 2006)

1. Aspek Biologi Klasifikasi secara ilmiah :

Kingdom : Bacteria
Phylum : Proteobacteria
Class : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Family : Enterobacteriaceae
Genus : Klebsiella
Species : K.pneumoniae
Klebsiella pneumoniae merupakan suatu bakteri gram negatif yang tidak
bergerak (non motil), tidak berselubung, melakukan fermentasi laktosa,
fakultatif anaerob, ditemukan sebagai flora normal di mulut, kulit dan usus.
Spesies Klebsiella sp menunjukkan pertumbuhan mukoid, simpai polisakarida
yang besar, tidak ada pergerakan dan biasanya memberikan hasil positif untuk
tes dekarboksilase lisin dan sitrat. Morfologi khas dari Klebsiella dapat dilihat
dalam pertumbuhan padat in vitro tetapi morfologinya sangat bervariasi dalam
bahan klinik (Podscun, 1998).
2. Tes identifikasi Klebsiella sp
Prinsip identifikasi Klebsiella sp dengan melihat gambaran mikroskop,
isolasi primer pada media, melihat penampakan koloni pada medium dan
melakukan tes-tes biokimiawi antara lain :

a. Mac Conkey
Medium Mac Conkey Agar termasuk salah satu media isolasi primer. Mac
Conkey merupakan medium selektif differensial yang mengandung zat warna
khusus dan karbohidrat untuk membedakan koloni yang memfermentasikan
laktosa (bewarna merah muda) dengan yang tidak memfermentasikan laktosa
(tidak bewarna), ukuran dan bentuk koloni bervariasi tergantung spesies
Kelompok lactosa fermenter seperti Klebsiella sp. menghasilkan koloni
berwarna merah muda pada media isolasi primer (Gunarson, 1998). Koloni
Klebsiella sp. membentuk koloni yang mukoid.Medium Mac Conkey
memungkinkan identifikasi persumtif secara cepat pada bakteri interik (Gupte
, 7 1990).

b. Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

TSIA merupakan media yang dapat mengidentifikasi bakteri sesuai dengan
karakter spesifik yang di tunjukkan oleh bakteri. Media TSIA mengandung
0,1% glukosa, 1% sukrosa, 1% laktosa, ferosulfat (untuk mendeteksi produksi
H2S), ekstrak jaringan (substrat pertumbuhan protein), dan indikator pH
(fenol merah). Zat tersebut dimasukkan ke dalam tabung reaksi sehingga
menghasilkan agar miring dengan bagian pangkal yang dalam dan diinokulasi
dengan menusukkan pertumbuhan bakteri ke dalam bagian pangkal. Jika
memfermentasikan glukosa bagian miring dan pangkal akan berubah warna
kuning akibat sejumlah kecil asam yang dihasilkan. Apabila produk
fermentasi kemudian dioksidasi menjadi CO2 dan H2O dan dilepaskan dari
agar miring serta dekarbosilasi oksidatif protein masih berlanjut dengan
pembentukan amino, bagian miring berubah menjadi alkalin (merah).Reaksi
oleh Klebsiella sp. pada TSIA yaitu asam/asam berwarna kuning pada bagian
pangkal dan miring, dapat terdeteksi gas, tidak dihasilkan H2S (Brooks et al.,
2008 ; Lehman, 2013).

c. Test motilitas pada agar semisolid

Uji motilitas digunakan untuk melihat pergerakan dari bakteri yang
ditandai adanya kekeruhan seperti kabut pada media (Bibiana, 1994). Uji
Bakteri di inokulasikan dengan menggunakan suatu kawat lurus melalui
pusat medium. Organisme-organisme non-motil seperti Klebsiella sp.
hanya tumbuh pada garis inokulum. Sedangkan organisme yang motil
tumbuh keluar dari medium, dan tampak keruh (Brooks et al., 2008; Hart,
1997).

d. Tes Indol
Uji indol untuk menilai pembentukan indol oleh bakteri dari triptopan
sebagai sumber karbon. Bila positif menghasilkan warna merah sedangkan
apabila negatif menghasilkan warna kuning. Klebsiella sp. merupakan bakteri
dengan indol negati (Hart, 1997) . Pembentukan indol dalam media dapat
diketahui dengan penambahan reagen Kovacs yang mengandung
dimetilaminob enzaldehid dan akan menghasilkan cincin merah pada
permukaan media karena indol akan bereaksi dengan dimetil
aminobenzaldehid sehingga membentuk rosindol yang berwarna merah
(Bibiana, 1994).

e. Tes metil merah dan Voges –Prokauer (VP)

Tes metil merah di gunakan untuk mendeteksi produksi asam selama
proses fermentasi glukosa. Pembentukan asam pada fermentasi glukosa
memberikan warna merah dengan indikator metil merah.Voges –Prokauer
merupakan uji untuk menentukan organisme yang memproduksi dan
mengelola asam dan fermentasi glukosa, memperlihatkan kemampuan sistem
buffer dan menentukan 9 bakteri yang menghasilkan produk netral (asetil
metal karbinol atau aseton) dari hasil fermentasi glukosa. Klebsiella sp.
menghasilkan warna merah yang memberikan hasil positif terhadap reaksi VP
(Hart,1997) .
 f. Tes sitrat
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme
menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Enzim sitrat yang
dihasilkan bakteri memecah sitrat yang berasal dari natrium sitrat dalam media
menjadi piruvat yang selanjutnya akan direduksi pada proses fermentasi.Uji
sitrat menggunakan indikator bromthymol blue. Hasil positif ditunjukkan
dengan adanya pertumbuhan bakteri dan terjadinya perubahan warna media
dari hijau menjadi biru yang disebabkan oleh peningkatan pH medium di atas
7,6 karena adanya
ammonia yang dihasilkan yang berasal dari monoammonium phosphate yang
terdapat pada medium. Biakan diinokulasi pada media simmon sitrat agar
dengan inokolum yang tipis kemudian diinkubasi pada suhu 3 7ºCselama 24
jam. Jika hasil positif terjadi perubahan warna indikator dari hijau menjadi
biru yang bermakna pertumbuhan bakteri pada medium sitrat menghasilkan
keadaan alkalis dan bakteri telah menggunakan sitrat. Klebsiella sp.
memberikan reaksi positif terhadap penggunaan sitrat (Elmer, 2006).

g. Test urea
Uji hidrolisis urea menunjukan bakteri menghasilkan enzim urease.
Beberapa mikroorganisme mampu menghasilkan enzim urease yang
menguraikan mikromolekul urea ((NH2) 2CO) menjadi karbon dioksida
(CO2) dan ammonia (NH3). Dilakukan dengan cara menggoreskan pembiakan
1 ose pada permukaan agar miring. Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37°C.
Tes dinilai positif 10 apabila menghasilkan warna merah muda dan negatif apa
bila warna tidak berubah. Bakteri Klebsiella sp. menghasilkan nilai positif
pada pemeriksaan ini (MacFaddin, 2000).

D. Alat dan Bahan

Tabel 1. Alat yang digunakan pada praktikum

 NO Nama Alat Spesifikasi
1 Autoclave Portable 26.4 L
2 Batang pengaduk P=15 cm
3 Cawan petri Ø 15 cm
4 Erlemeyer 250, 500 dan 1000 mL
5 Gelas kimia 250 mL
6 Gelas ukur 100 mL
7 Inkubator Mikrobiologi memer
8 Objek glass 25,4 x 76,2 mm
9 Oven T 100-2800C
10 Ose tusuk dan bulat Kawat NICr
11 Lampu spirtus Volume 200 mL
12 Mikroskop Fase kontras
13 Neraca analitik Kapasitas 0,01-600,00 gr
14 Pipet tetes -
15 Rak tabung Ø 1 cm, 12 lubang
16 Tabung reaksi Kecil dan Besar

Tabel 2. Bahan yang digunakan pada praktikum

No Bahan Spesifikasi
1 Mac Concey Agar PA (Pro Analisa)
2 Akuades -
Alkohol -
3 Derat uji gula-gula

 Glukosa
1%
 Laktosa
1%
 Mnaitol
  Sukrosa 1%
1%

4 Pewarnaan Gram Lar. Krystal Violet

Lar. Lugol
Alkohol 95%
Lar. safranin

E. Prosedur / Cara Kerja Praktikum

 Hari ke 1
Penanaman pada media Mac Concey Agar dengan di lakukan
penyetrikan kemudian di inkubasi pada suhu 37 0c selama 24 jam
 Hari ke 2
1. Amati koloni pada lempeng MCA
2. Amati pewrnaan Gram pada koloni tersangka, lalau amati di bawah
mikroskop
3. Ambil 1 koloni yg terpisah pada lempeng MCA, lalu tanam pada
media gula-gula ( Sukrosa, Manitol, Glukosa,Laktosa), inkubasi
pada suhu 370c selama 24 jam.
4. Ambil 1 koloni pada lempeng MCA lalu lakukan penyetrikan pada
media TSIA, Urease, Simon Citrat dan VP, inkubasi pada suhu 370c
selama 24 jam.
5. Ambil 1 koloni terpisah pada lempeng MCA, lalu tanam pada media
MR dan SIM, inkubasi pada suhu 370c selama 24 jam.
 Hari ke 3
1. Amati uji gula-gula ( Sukrosa, Manitol, Glukosa, Laktosa) yg sudah
di inkubasi pada suhu 370c selama 24 jam. Amati apakah ada
perubhan warna seperti :
Sukrosa dari warna ungu mnjdi ungu, Manitol dari warna ungu
menjadi kuning, Glukosa dari warna ungu menjadi kuning dan
Laktosa dari warana ungu menjadi kuning.
 2. Amati pada media media TSIA, Urease, Simon Citrat dan VP, yang
sudah di inkubasi pada suhu 370c selama 24 jam,apakah ada gas dan
perubahan warna .
3. Amati pada media MR dan SIM yang sudah di inkubasi pada suhu
37oc selama 24 jam, pada media SIM teteskan reagen kovaks
sebanyak 3 tetes hasil positif ditandai dengan cincin berwana merah
muda, pada media MR teteskan reagen metyl red sebanyak 3 tetes
dan teteskan reagen Asam amino triptofan sebanyak 3 tetes hasil
positif terbentuk cincin berwarna hitam.

F. Hasil Praktikum
No Uji Biokimia Hasil
Urin Sputum
1 Glukosa + , Gas + + , Gas +
2 Sukrosa + , Gas + + , Gas +
3 Manitol + , Gas + + , Gas +
4 Laktosa + , Gas + + , Gas +
5 SIM - /-/- - /-/-
6 MR + +
7 VP - -
8 TSIA K/K, Gas H2S - K/K, Gas H2S -
9 Urease + +
10 Simon Citrat + +

12
Drajat Kesamaan Sampel Urin = 14 ∗ 100 % = 85,7 %

12
Sampel Sputum = 14 ∗ 100 % = 85,7 %
G. Pembahasan
Hasil Identifikasi Klebsiella spIdentifikasi isolat Klebsiella sp yang
berasal dari feses yang, dibiakkan pada media MCA, didapatkan hasil berupa
koloni yang berwarna kemerahan menyebar keruh. Bakteri Klebsiella sp
tumbuh baik pada MCA dengan koloni berbentuk bulat dan cembung. Hasil
pewarnaan Gram, bakteri Klebsiella sp terlihat berbentuk batang pendek dan
berwarna kemerahan. Uji Gram yang digunakan menunjukkan bahwa bakteri
yang didapatkan merupakan bakteri Gram negatif karena hasil pengecatan
berwarna merah. bakteri Klebsiella sp tidak dapat mempertahankan zat warna
kristal violet sewaktu proses pewarnaan Gram dan bentuk selnya adalah
batang.
Hasil uji biokimia menunjukkan bahwa hasil dari uji Simmon’s citrat
positif. Hal ini ditunjukkan oleh perubahan warna biakan dari hijau menjadi
biru karena terbentuknya natrium karbonat hasil reaksi enzimatis.
Uji indol positif ditandai dengan terbentuknya cincin yang berwarna
merah cerry di permukaan biakan apabila ditambahkan dengan beberapa tetes
Kovac’s yang terdiri atas p-dimetilaminobenzaldehid, butanol, dan asam. Uji
ini menggunakan media tryptone broth yang mengandung substrat triptofan.
Reaksi positif terjadi karena triptofan dikonversi menjadi indol.
Pada uji TSIA menunjukkan hasil positif. Hal ini ditandai dengan tidak
terjadi perubahan warna media. Uji TSIA bertujuan membedakan jenis
bakteri berdasarkan kemampuan memecah glukosa, laktosa, sukrosa, dan
pembebasan sulfida. Selain itu, uji TSIA berfungsi mengetahui bakteri
tersebut menghasilkan gas H2S atau tidak .
Pada uji MR-VP menunjukkan hasil positif pada MR dan hasil negatif
pada VP.. Uji MR digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam
campuran. Uji VP digunakan untuk menentukan kemampuan bakteri tersebut
menghasilkan produk akhir yang netral dari fermentasi glukosa.
Pada uji SIM menunjukkan hasil positif. Hal ini ditandai dengan
tumbuhnya kecambah pada media. Media ini biasanya digunakan dalam
identifikasi yang cepat. Dari uji indol didapatkan hasil yang negatif, karena
tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan
biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari triptofan sebagai
sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan larutan Kovacs.
Asam amino triptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat
pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh
mikroorganisme akibat penguraian protein. Hasil positif ditunjukkan
terbentuk warna hitam yang berarti bekteri menghasilkan gas hidrogen sulfit
(H2S) dan cincin indol berwarna merah muda setelah penambahan reagen
Kovacs. Hasil uji gula-gula menunjukkan hasil yang positif dengan ditandai
dengan perubahan warna menjadi warna kuning. Uji gula-gula (sukrosa,
manitol, glukosa, laktosa) bertujuan melihat adanya kemampuan
mikroorganisme dalam fermentasi gula-gula tersebut.
Pada praktikum Isolasi dan Identifikasi Bakteri Klebsiella sp di dapatkan
hasil sebagai berikut :
No Uji Biokimia Hasil
Urin Sputum
1 Glukosa + , Gas + + , Gas +
2 Sukrosa + , Gas + + , Gas +
3 Manitol + , Gas + + , Gas +
4 Laktosa + , Gas + + , Gas +
5 SIM - /-/- - /-/-
6 MR + +
7 VP - -
8 TSIA K/K, Gas H2S - K/K, Gas H2S -
9 Urease + +
10 Simon Citrat + +

12
Drajat Kesamaan Sampel Urin = 14 ∗ 100 % = 85,7 %
12
Sampel Sputum = 14 ∗ 100 % = 85,7 %
 Hal ini menujukan bahawa pada sampel urin dan sputum terduga
bakteri Klebsiella peunomoniae dengan derajat pesamaan di dapatkan
hasil 85,7% Pada sampel urin dan sputum
H. Kesimpulan
Pada praktikum isolasi dan Identifikasi bakteri Klebsiella sp pada sampel
urin dan sputum sebagai berikut :
No Uji Biokimia Hasil
Urin Sputum
1 Glukosa + , Gas + + , Gas +
2 Sukrosa + , Gas + + , Gas +
3 Manitol + , Gas + + , Gas +
4 Laktosa + , Gas + + , Gas +
5 SIM - /-/- - /-/-
6 MR + +
7 VP - -
8 TSIA K/K, Gas H2S - K/K, Gas H2S -
9 Urease + +
10 Simon Citrat + +

12
Drajat Kesamaan Sampel Urin = 14 ∗ 100 % = 85,7 %
12
Sampel Sputum = 14 ∗ 100 % = 85,7 %

Hal ini menujukan bahawa pada sampel Urin dan Sputum terduga bakteri
Klebsiella peunomoniae dengan derajat pesamaan di dapatkan hasil 85,7%
pada sampel Urin dan Sputum.

I. Daftar Pustaka
Patrick, 2005;Elmer, 2006 Klebsiella sp
Podscun, 1998. Aspek biologi klasifikasi bakteri Klebsilla sp. Jakarta.
Brooks et al., 2008; Hart, 1997. Media yang di gunakan pada isolasi bakteri
Klebsiella peunomonia.
MacFaddin, 2000. Test urea pada bakteri Klebsiella peunomoniae.
J. LAMPIRAN
A. SAMPEL URIN

Keterangan : Keterangan : Keterangan :

-Hasil penanaman sampel - Hasil pewarnaan Gram - Hasil uji SIM
Urin Pada media MCA di lihat secara - Hasil uji MR
Mikroroskpis - Hasil uji VP

Keterangan : Keterangan :
-Hasil uji TSIA - Hasil uji laktosa
-Hasil uji Urease - Hasil uji glukosa
-Hasil uji SC - Hasil uji sukrosa
- Hasil uji manitol
 B. SAMPEL SPUTUM

Keterangan : Keterangan : Keterangan :

-Hasil penanaman sampel - Hasil pewarnaan Gram - Hasil uji SIM
Urin Pada media MCA di lihat secara - Hasil uji MR
Mikroroskpis - Hasil uji VP

Keterangan : Keterangan :
-Hasil uji TSIA - Hasil uji laktosa
-Hasil uji Urease - Hasil uji glukosa
-Hasil uji SC - Hasil uji sukrosa
- Hasil uji manitol