ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI GRAM NEGATIF BATANG

PENYEBAB INFEKSI KULIT

Pseudomonas sp

A. Hari dan Tanggal Praktikum : 24-26 April 2018

B. Tujuan Praktikum :

Untuk isolasi & identifikasi Bakteri Gram negatif (-) penyebab infeksi kulit

C. Teori Dasar :

Pseudomonas aeruginosa mempunyai ciri khas bergerak dan berbentuk

batang, berukuran sekitar 0.6 x 2 μm. Umumnya mempunyai flagel polar, tetapi
kadang kadang 2-3 flagel. Bakteri Gram-negatif dan terlihat sebagai bakteri
tunggal, berpasangan, dan kadang-kadang membentuk rantai yang pendek.
Struktur dinding sel sama dengan famili Enterobactericeae. Strain yang diisolasi
dari bahan klinik sering mempunyai pili untuk perlekatan pada permukaan sel dan
memegang peranan penting dalam resistensi terhadap fagositosis. P. aeruginosa
mempunyai pili. Pili (fimbriae) menjulur dari permukaan sel dan membantu
perlekatan pada sel epitel inang. Lipopolisakarida yang terdapat dalam banyak
imunotip merupakan salah satu faktor virulensi dan juga melindungi sel dari
pertahanan tubuh inang P. aeruginosa dapat digolongkan berdasarkan imunotipe
polisakarida dan kepekaannya terhadap piosin (bakteriosin). Produk ekstraseluler
yang dihasilkan berupa enzim-enzim, yaitu elastase, protease dan dua hemolisin,
fosfolipase C yang tidak tahan panas dan rhamnolipid.

P. aeruginosa adalah aerob obligat yang tumbuh dengan mudah pada

banyak jenis perbenihan biakan. P. aeruginosa membentuk koloni halus bulat
dengan flouresensi kehijauan. Bakteri ini sering menghasilkan piosianin, pigmen
kebirubiruan yang tak berfluorosensi, yang tidak berdifusi ke dalam agar dan
mengandung chloroform. Banyak strain P. aeruginosa juga menghasilkan pigmen

1
pioverdin yang berfluoresensi, yang memberi warna kehijauan pada agar.
Beberapa strain menghasilkan piorubin yang berwarna merah gelap atau pigmen
piomelanin yang hitam. Faktor ekstrinsik dan intrinsik dapat mempengaruhi
pertumbuhan bakteri P. aeruginosa. Faktor ekstriksik yang mempengaruhi
pertumbuhannnya adalah suhu dan kandungan oksigen. P. aeruginosa tumbuh
baik pada suhu 37-42oC pertumbuhannya pada suhu 42oC membantu
membedakan spesies ini dari spesies P. aeruginosa lain.

P. aeruginosa merupakan bakteri aerob obligat, yaitu bakteri yang

membutuhkan oksigen untuk tumbuh. Faktor intrisnsik yang mempengaruhi
pertumbuhan bakteri ini antara lain adalah pH. Tingkat keasaman (pH) optimum
untuk pertumbuhan bakteri P. aeruginosa adalah pada 6,6-7,0. Bakteri ini
oksidase positif dan tidak meragikan karbohidrat. Namun banyak strain yang
mengoksidasi glukosa. Pengenalan biasanya berdasarkan morfologi koloni, sifat
oksidasi-posistif, adanya pigmen yang khas, pertumbuhan pada suhu 42oC. Untuk
membedakan P. aeruginosa dari Pseudomonas lain berdasarkan aktivitas
biokimiawi, dibutuhkan pengujian dengan berbagai macam substrat

P. aeruginosa menimbulkan infeksi pada luka bakar, meningitis, infeksi

saluran nafas, otitis eksterna ringan hingga invasif, infeksi mata, bahkan sepsis
pada bayi. P. aeruginosa yang menimbulkan infeksi pada luka dan luka bakar
menimbulkan nanah hijau kebiruan dan bila bakteri tersebut masuk saat punksi
lumbal akan mengakibatkan meningitis pada penderita. Infeksi P. aeruginosa juga
dapat terjadi lewat pemasangan kateter yang akan menyebabkan infeksi saluran
kemih dan melalui respirator yang terkontaminasi sehingga mengakibatkan
pneumonia yang disertai nekrosis. Pada penyakit pneumonia akibat P. aeruginosa
biasanya terjadi sianosis yang makin lama makin bertambah, biasanya dengan
empyema. Dengan foto polos dapat dilihat adanya infiltrasi di dalam lobus bagian
bawah yang bersifat nodular nekrosis dengan pembentukan abses. Pada
pneumonia, mortalitias penderita tinggi. Pada perenang, bakteri ini dapat
menyebabkan otitis eksterna ringan, sedangkan pada penderita diabetes dapat
menyebabkan otitis eksterna invasif (maligna). Infeksi mata juga dapat terjadi
dengan etiologi P. aeruginosa. Sedangkan pada bayi atau orang yang lemah, P.

2
aeruginosa dapat menyerang aliran darah dan mengakibatkan sepsis fatal. Hal ini
biasanya terjadi pada penderita leukemia atau limfoma yang mendapat obat anti
antinoplastik atau terapi radiasi. Pada penderita leukemia mortalitas lebih tinggi
bila menderita leukopeni yang berat. Pada penderita dengan fibrosis kistik,
organisme ini sering berkapsul untuk mencegah fagosistosis. Pada sebagian besar
penderita infeksi P. aeruginosa, gejala dan tandatandanya bersifat nonspesifik dan
berkaitan dengan organ yang terlibat. Kadangkadang, veroglobin (suatu produk
pemecahan hemoglobin) atau pigmen yang berfluorosen dapat dideteksi pada
luka, luka bakar atau urin dengan penyinaran fluoresen ultraviolet. Nekrosis
hemoragik pada kulit sering terjadi pada sepsis akibat P. aeruginosa, lesi yang
disebut ektima gangrenosum yang dikelilingi oleh eritmea dan sering tidak berisi
nanah. Pada anak-anak dengan folikulitis karena penggunaan kolam renang dapat
dijumpai pruritus folikular, makulopapular, vesikular atau lesi pustular di setiap
bagian tubuh yang terendam dalam air. Lesi nodular jarang dijumpai. Pada anak
yang terinfeksi setelah menggunakan kolam renang umum yang terkontaminasi,
10 hingga 40 jam kemudian dapat dijumpai nyeri hebat di telapak kaki diikuti
bengkak, kemerahan dan rasa panas. Gejala paling berat berupa demam 12 (37,7-
38,8oC), malaise dan rasa mual. Kumpulan gejala akut ini disebut “pseudomonas
hot-foot syndrome”.

Tes Diagnostik Laboratorium

1) Spesimen: Spesimen didapat dari lesi kulit, nanah, urin, darah, cairan spinal,
dahak, dan bahan lain harus diambil seperti yang ditunjukkan oleh jenis infeksi.

2) Mikroskopis: Batang Gram-negatif sering terlihat dalam sediaan apus. Tidak

ada ciri-ciri morfologi khusus yang membedakan Pseudomonas dari batang
enterik atau batang Gram-negatif yang lain.

3) Kultur: Spesimen ditanam pada lempeng agar darah dan media diferensial yang
biasa digunakan untuk menumbuhkan batang Gram-negatif enterik. Pseudomonas
tumbuh dengan mudah pada kebanyakan media ini, tetapi mungkin tumbuh lebih
lambat dibanding bakteri enterik lain. P. aeruginosa tidak memfermentasi laktosa
dan dengan mudah dibedakam dengan bakteri lactose-fermenter.

3
4) Koloni: Koloni besar dan halus dengan permukaan rata dan meninggi (fried egg
apperance) dan koloni halus dan mukoid yang biasanya didapat dari sekresi
saluran pernafasan dan saluran kemih.

4
D. Alat dan Bahan :

Tabel 1. Alat yang digunakan pada praktikum

No Nama Alat Spesifikasi

1. Autoclave Portable 26.4 L

2. Batang pengaduk P=15 cm

3. Cawan petri Ø 15 cm

4. Erlemeyer 250, 500 dan 1000 mL

5. Gelas kimia 250 mL

6. Gelas ukur 100 mL

7. Inkubator Mikrobiologi memert

8. Objek glass 25,4x76,2 mm

9. Oven T100-280o C

10. Ose tusuk dan bulat Kawat NICr

11. Lampu spirtus Volume 200 mL

12. Mikroskop Fase kontras

13. Neraca analitik Kapasitas 0,01-600,00 gr

14. Pipet tetes -

15. Rak tabung Ø 1 cm, 12 lubang

16. Tabung reaksi Kecil dan besar

17. Tabung durham Kecil

5
Tabel 2. Bahan yang digunakan pada praktikum

No Bahan Spesifikasi

1. Sampel Apus luka (Pus/Nanah)

2. Akuades -

Alkohol 96 %

3. Media Agar MCA , AD , AN

4. Deret uji gula-gula :

 Glukosa 1%

 Laktosa 1%

 Manitol 1%

 Sukrosa 1%

5. MR Methyl Red

6. VP Alfa Naftol dan KOH 40%

7. TSIA -

8. Simon Citrate -

9. -

10. Urease -
SIM

11. Pewarnaan Gram Lar. Krystal violet

Lar. Lugol

Alkohol 95 %

Lar. Safranin

6
E. Prosedur/Cara Kerja Praktikum :

Pada hari pertama praktikum, disiapkan sampel swab luka yang terdapat
pus atau nanah yang telah diambil sesuai prosedur. Sebelum melakukan
praktikum terlebih dahulu meja dibersihkan menggunakan alkohol 70%. Setelah
itu, disiapkan Mac Conkey Agar (MCA) 1, Agar Darah (AD) 1, dan Agar Nutrient
(AN) 1,sebelum penanaman sampels pasien pada media agar , terlebih dahulu ose
bulat di panaskan hingga pijar lalu swab sampel diapus pada media agar tersebut
lalu dengan menggunakan ose dibuat goresan (metode streak) sebanyak 4 kuadran
pada ketiga media agar tersebut. Kemudian, cawan yang sudah di tanami sample
dibungkus menggunakan kertas, lalu di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 OC.

Pada hari kedua dilakukan pengamatan bakteri pada media MCA, AD dan
AN yang sudah di inkubasi. Setelah itu, diambil koloni yang terpisah dari media
tersebut untuk dilakukan pewarnaan Gram. Untuk pewarnaan Gram, diambil
koloni bakteri yang terpisah, lalu di oleskan ose tersebut ke objek glass yang
sudah tersedia, kemudian dikeringkan & difiksasi objek glass yang berisi bakteri
tersebut dengan melewatinya diatas api sebanyak 3x, lalu dilakukan pewarnaan
Gram dengan tahap pertama diberi zat pewarna Crystal Violet selama 1 menit lalu
dibersihkan menggunakan air mengalir , selanjutnya diberi larutan Lugol selama 1
menit, kemudian di cuci air mengalir, selanjutnya diberi Alkohol 96% selama 20-
30 detik selanjutnya diberi zat pewarna safranin selama 20-30 detik, setelah itu di
cuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Preparat yang sudah kering dapat
diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000x dengan menggunakan
minyak imersi. Tahap selanjutnya, di inokulasikan koloni bakteri menggunakan
ose ke berbagai macam media gula-gula dan biokimia. Media gula – gula
diantaranya laktosa,manitol,sukrosa,dan glukosa. Media uji biokimia diantaranya
MR, VP, Urease, TSIA, Simon Citrate dan SIM. Semua media gula-gula dan
biokimia tersebut yang sudah ditanami bakteri di bungkus menggunakan kertas
lalu di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37OC.

7
 Pada hari ketiga,dilakukan pengamatan yang terjadi pada media gula-gula
dan media uji biokimia. Pada media VP dilakukan penambahan alfa naftol 5 tetes
dan KOH 10% 5 tetes lalu diamati apakah ada perubahannya. Pada media SIM
ditambahkan larutan/reagen kovaks 1-2tetes lalu dibiarkan 1-2 menit , dilihat
apakah ada perubahan atau tidak. Selanjutnya, pada media MR dilakukan
penambahan Methyl Red sebanyak 5 tetes dan amati perubahan yang terjadi.

8
F. Hasil Praktikum :

Tabel 1. Penanaman pada MCA

NO Ciri Koloni MCA AD AN

1 Bentuk Bulat Bulat Bulat
2 Ukuran 0.6 x 2 μm 0.6 x 2 μm 0.6 x 2 μm
3 Warna Krem Abu Putih ber-
pigmen biru
4 Elevasi Convex Convex Convex
5 Pinggiran Rata Rata Rata
6 Ciri khas lainnya Non Lactose Non lactose Non lactose
fermenter fermenter fermenter

Hasil Pewarnaan Gram :

Bentuk : Bacillus

Susunan : monobasil,diplobasil

Sifat : Gram Negatif

Perbesaran : 1000x

9
Tabel 2. Hasil Uji biokimia
Sampel Urine
No Nama Uji Sebelum Sesudah Hasil
1. Glukosa&Gas Ungu Kuning F(+)/G(-)
2. Sukrosa&Gas Ungu Kuning F(+)/G(-)
3. Manitol&Gas Ungu Kuning F(+)/G(-)
4, Laktosa&Gas Ungu Ungu F(-)/G(-)
5. SIM
 Sulfur Kuning jernih Kuning Negatif (-)
 Indol Kuning jernih Pink muda Negatif (-)
 Motilitas Kuning jernih Kuning Negatif (-)
6. TSIA
 Lereng Merah Merah Alkali
 Dasar Merah Merah Alkali
 Sulfur Merah - Negatif (-)
 Gas Tidak ada Ter-angkat G (+)
7. VP Jernih Terbentuk cincin Negatif (-)
coklat
8. MR Jernih Ada cincin merah Positif (+)
setelah penambahan
Methyl Red 
Positif
9. Urease Kuning Pink Positif
10. Simon Citrate Hijau Biru Positif

11 Oksidase Positif

10
G. Pembahasan

Pada praktikum ini didapatkan sampel berupa swab apus luka penderita
diabetes , sampel tersebut ditanam pada media MCA,AD dan AN. Penanaman
dilakukan pada suhu 37OC selama 24 jam, didapatkan hasil koloni berwarna krem
pada media MCA, warna koloni abu-abu pada media Agar darah dan warna
koloni putih ber-pigmen biru pada media Agar Nutrient. Bentuk koloni bulat,
elevasi convex, dengan pinggiran rata dan ciri khas nya non lactose fermenter.
Selanjutnya, dilakukan pewarnaan Gram yang bertujuan untuk melihat struktur
dari bakteri tersebut. Dari hasil pewarnaan Gram didapatkan hasil bakteri dengan
bentuk batang (basil) dengan susunan monobasil & diplobasil berwarna merah
yang mengartikan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri kelompok Gram
negatif karena bakteri tersebut tidak mempertahankan zat warna kristal violet
sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga berwarna merah saat diamati dengan
mikroskop ( Madigan MT,2006 ).

Pada uji biokimia gula-gula, pada uji glukosa terjadi perubahan dari warna
ungu menjadi kuning yang berarti bahwa bakteri tersebut dapat memfermentasi
glukosa. Selain itu, pada tabung durham tidak terlihat adanya gelembung gas.
Pada uji manitol dan sukrosa terjadi juga perubahan warna namun seharusnya
pada bakteri ini uji manitol dan sukrosa seharusnya negatif, hal ini dapat terjadi
mungkin dikarenakan adanya kontaminasi dari bakteri lain sehingga manitol nya
positif dan tidak pula terdapat gas pada tabung durham. Pada uji
laktosa,didapatkan hasil negatif yaitu tidak terjadinya perubahan warna pada
media dan tidak terdapat gas pada tabung durham.

Identifikasi berikutnya berdasarkan uji biokima (IMVIC). Pada media SIM

ada 3 hasil yaitu sulfur, indol,dan motilitas. Setelah inkubasi terlihat adanya
kekeruhan di media SIM tetapi tidak ada pertumbuhan bakteri diatas tusukan
namun terdapat bakteri di sekitar daerah tusukan, artinya didapatkan hasil bakteri
pada kedua sampel feses dan urine tersebut non motil. Sulfur negatif pada SIM
karena tidak adanya warna hitam karena pembentukan H2S dan hasil indol pun

11
negatif karena pada saat penambahan reagen kovaks,tidak terjadi perubahan
apapun.

Uji IMVIC selanjutnya yaitu uji MR, pada uji MR ketika penambahan
Methyl Red 3 tetes pada sampel tersebut terbentuk adanya cincin bewarna merah,
yang ber-arti hasil nya positif karena glukosa dapat menghasilkan asam yang
dapat mengubah pH media tersebut, seharusnya pada bakteri ini hasil uji MR
negatif, hal ini dapat terjadi karena ada nya kontaminasi bakteri lain yang dapat
menghasilkan asam dan merunah pH media tersebut. Tujuan pengujian MR
adalah untuk melihat asam yang di fermentasi. Perubahan indikator Methyl red
yaitu semakin asam pH nya maka warna nya akan semakin merah. Pada Uji VP
yang bertujuan untuk melihat jalur metabolisme glukosa, dengan penambahan
alfa-naftol dan KOH 40% terlihat adanya perubahan yaitu terbentuk cincin
kecoklatan pada sampel tersebut yang berarti hasilnya negatif. Pada uji biokimia
lainnya yaitu TSIA pada sampel, terjadi perubahan pada bagian dasar menjadi
warna kuning (asam), sedangkan pada bagian lereng terjadi perubahan warna
menjadi warna merah (alkali) yang ber-arti terjadi proses fermentasi karbohidrat
(glukosa,sukrosa,laktosa) sehingga menghasilkan asam yang dapat mengubah
warna media menjadi kuning, seharusnya pada bakteri ini hasil nya yaitu
merah/kuning, hal ini dapat terjadi karena adanya kontaminasi bakteri lain. Dalam
media ini juga tidak terlihat adanya pembentukan sulfur, namun media agar
tersebut terlihat terangkat karena bakteri tersebut menghasilkan gas. Sedangkan
Pada uji Urease terlihat adanya perubahan pada sampel dari warna kuning menjadi
warna pink,artinya bakteri tersebut memiliki enzim urease yang dapat
menghidrolisis urea menjadi CO2 dan amonia. Pada media simon citrate, terjadi
perubahan warna dari hijau ke warna biru ,artinya bakteri tersebut menggunakan
citrate sebagai sumber karbonnya. Sebagaimana hasil yang didapat, bakteri
tersangka hasilnya tidak merujuk pada bakteri Pseudomonas aeruginosa , hal
tersebut dapat terjadi mungkin karena satu dan lain hal termasuk adanya
kontaminasi bakteri lain pada sampel yang digunakan. Pada uji oksidase
didapatkan hasil positif, tujuan uji oksidase adalah untuk membedakan golongan
bakteri Enterobactericeae dan Non Enterobactericea. Bila hasil positif, maka
bakteri tersebut bukan bakteri dari golongan Enterobactericeae.

12
H. Kesimpulan

a) Diagnosa bakteriologi, didapatkan bakteri Gram negatif dari sampel urine

dan didapatkan hasil :
 Glukosa&Gas (+)/(-)
 Sukrosa&Gas (+)//(-)
 Manitol&Gas (+)/(-)
 Laktosa&Gas (-)/(-)
 SIM
Sulfur (-) Negatif
Indol (-) Positif
Motilitas (-) Negatif
 TSIA
Lereng (Alkali)
Dasar (Alkali)
Sulfur (-) Negatif
Gas (+) Positif
 VP (-) Negatif
 MR (+) Positif
 Urease (+) Positif
 Simon Citrate (+) Positif
Maka dapat disimpulkan bakteri tersebut adalah Pseudomonas sp ,
dengan derajat kemiripan :
14/20 x 100% = 70

13
I. Daftar Pustaka

Alderberg's M, J. (2001). Mikrobiologi kedokteran . Jakarta : Salemba Medika.

E., M. (2006). Psedomonas aeruginosa; Karakteristik, Infeksi dan.

Fiorillo L, Z. M. (2001). The pseudomonas hot-foot syndrome.

Japoni A, F. S. (2009). Pseudomonas aeruginosa: Burn infection,. Iran Red

Crescent Med J.

Jawetz, E., Melnick, J., & E., A. (2013). Mikrobiologi Kedokteran. . EGC, Jakarta
.

Koneman, E. W. (1992). Microbiology color atlas and textbook of. Philadelpia.

S., G. (1990). Mikrobiologi dasar . Jakarta : Binarupa Aksara.

14
J. Lampiran

 Koloni pada MCA , AD & AN

 Glukosa

\\

 Sukrosa

 Manitol

15
 

 Laktosa

 SIM

 TSIA

16
 VP

 MR

17
 Urease

 Simon Citrate

18