MINI LAB THEORY

Pemeriksaan Sputum/ Discharge, Pewarnaan Gram, Pewarnaan

DISCUSSION
Salin dan KOH, Pewarnaan BTA dan Pewarnaan Giemsa
Supervisor Pembimbing:
dr. Fatmawaty Ahmad, Sp.PK
Oleh:
Firda Ayuningsi Umamit (70700120011)
Ilham Muharram (70700120031)
Andi Nurul Hidaya Azzahara (70700120035)
Rini Suherti (70700120041)

KEPANITERAAN KLINIK DEPARTEMEN PATOLOGI KLINIK

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR
2021
1.
Pemeriksaan Sputum/Discharge
 Dasar Teori
Berbagai organism patogen dapat terdeteksi melalui
pemeriksaan mikroskopik specimen sputum dan swab
tenggorokan. Organisme-organisme ini meliputi:
▪ Bakteri: basil tahan asam negaitif - Gram atau positif
– Gram
▪ Jamur atau ragi: berupa filamen – filament miselium,
dengan atau tanpa pori.
▪ Actinomycetes: berupa granula – granula
▪ Parasit: telur trematoda paru dan sangat jarang telur
skistosoma dan cacing dewasa spesies
Mammomonogamus laryngeus

3
 Alat dan Bahan
▪ Mikroskop
▪ Kaca objek
▪ Wadah berleher lebar dan tahan bocor untuk specimen
sputum, seperti stoples
▪ Kristal natrium klorida
▪ N-setilpirimidinium klorida
▪ Air suling

4
 Waktu Pengambilan Sputum
Dahak yang diambil ialah dahak yang kental kuning kehijauan
sebanyak 3-5 cc, dengan waktu pengambilan sebagai berikut :
▪ Dahak sewaktu, penderita datang berobat dengan keluhan apa
saja ke poliklinik.
▪ Dahak pagi, yang diambil besok paginya begitu bangun tidur.
▪ Dahak sewaktu, yang diambil sewaktu penderita mengantar
dahak pagi tersebut.

5
 Metode Pengambilan Sampel
Sputum
Spesimen sputum sebaiknya ditampung pagi hari sehabis bangun tidur
▪ Minta pasien bernapas dalam. Selanjutnya pasien diminta membatukkan
dengan kuat dan menampung air liurnya di dalam wadah. Tutup rapat wadah
tersebut dan tempelkan label bertuliskan nama dan nomor pasien. Pastikan
bahwa jumlah sputum yang ditampung cukup untuk pemeriksaan.
▪ Kalau specimen akan dikirim ke laboratorium untuk kultur Mycobacterium
tuberculosis, minta pasien untuk menampung langsung di dalam stoples
bermulut lebar, bertutup ulir, dan berisi 25 ml larutan berikut: N-
setilpiridinium klorida 5 g Natrium klorida 10 g Air suling sampai 1000 ml

6
 Continue..
▪ Tutup rapat stoples dan berikan label bertuliskan nama pasien dan tanggal
pengambilan specimen.
▪ Penting: Saliva yang encer dan berbusa serta secret hidung dan faring tidak
sesuai dipakai sebagai sampel untuk pemeriksaan bakteriologis. Minta pasien
mengirimkan sampel yang lain.

7
 Pembuatan Apusan Sputum
▪ Ambil pot sputum dan kaca sediaan yang beridentitas sama dengan pot sputum.
▪ Buka pot dengan hati-hati untuk menghindari terjadinya droplet (percikan sputum).
▪ Panaskan ose (sengkelit) di atas nyala api spritus sampai merah dan biarkan sampai dingin.
▪ Ambil sedikit sputum dari bagian yang kental dan kuning kehijau-hijauan (purulen) menggunakan ose
yang telah disterilkan.
▪ Oleskan sputum secara merata pada permukaan kaca sediaan.
▪ Masukkan ose ke dalam botol (berukuran 300-500cc) yang berisi pasir dan alcohol 70% atau
desinfektan, digoyang-goyangkan untuk melepaskan partikel yang melekat pada ose.
▪ Dekatkan ose pada api spritus sampai kering, bakar sampai membara.
▪ Keringkan sediaan di udara terbuka sekitar 15-30 menit, jangan terkena matahari langsung atau di atas
api.
▪ Gunakan pinset untuk mengambil sediaan yang sudah kering pada sisi yang berlabel dengan apusan
sputum menghadap ke atas.
▪ Lewatkan di atas lampu spritus sebanyak 3 kali (sekitar 3-5 detik) untuk fiksasi (kalau terlalu lama dapat
merubah bentuk bakteri dan membuat sediaan pecah).

8
 Pemeriksaan Mikroskopik
Pemeriksaan sputum dilakukan pertama-tama dengan mata telanjang dan
selanjutnya dengan mikroskop. Sampel sputum yang sebagian besar berisi saliva
tidak dapat dipakai untuk kultur ataupun pemeriksaan langsung.
▪ Sediaan yang telah diwarnai diperiksa di bawah mikroskop, cari lebih dulu
lapang pandang dengan obyektif 10x.
▪ Teteskan minyak emersi di atas apusan, periksa dengan menggunakan lensa
okuler 10x dan obyektif 100x
▪ Periksa paling sedikit 100 lapang pandang atau dalam waktu kurang lebih 10
menit.
▪ Sediaan yang telah diperiksa direndam dalam xylol selama 15-30 menit, lalu
disimpan dalam kotak sediaan.

9
 Interpretasi
Sputum pasien dengan infeksi bakteri biasanya berisi:
▪ Mukus yang tebal, disertai gelembung-gelembung udara
▪ Benang-benang fibrin
▪ Kumpulan pus
▪ Kadang-kadang, noda-noda darah berwarna kecoklatan
Berdasarkan inspeksi visual, karakteristik sputum dapat dilaporkan sebagai berikut
▪ Purulen: berwarna kehijauan, berisi pus dan mucus
▪ Mukoid: sebagian besar berisi mukus
▪ Mukosaliva: berisi mukus dan sedikit saliva
▪ Darah juga harus dilaporkan terlihat pada inspeksi visual ini

10
 Jenis Sampel Sputum

11
2.
Pewarnaan Gram
 Dasar Teori
Pewarnaan Gram adalah suatu metode untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok
besar, yakni Gram positif dan Gram negatif, berdasarkan
sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Pewarnaan
Gram bertujuan untuk mengklasifikasikan kedua tipe
bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel
mereka, selain itu membantu menentukan diagnosis
awal, sebagai pedoman awal memutuskan terapi
antibiotik sebelum tersedia bukti definitif bakteri
penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri
terhadap antibiotik).

13
14
15
 Pra Analitik:
▪ Persiapan Pasien : tidak memerlukan persiapan khusus
▪ Persiapan sampel:
▫ Sampel ditempatkan dalam tabung steril. Sumber
sampel berasal dari spesimen pasien seperti cairan
otak, sputum, cairan aspirasi, eksudat, feses, pus, urin,
biopsi, cairan sendi, koloni dari media padat dan cair
seperti kultur kaldu.
▪ Prinsip Tes :
▫ Bakteri Gram positif dapat mempertahankan zat warna
pertama yakni kristal violet sedangkan bakteri Gram
negatif melepaskan zat kristal violet dan mengikat zat
warna kedua yakni safranin.
16
 Alat dan Bahan
▪ Objek gelas
▪ Spesimen atau koloni bakteri
▪ Kit Larutan Pewarnaan Gram
▫ Kristal gentian violet
▫ Iodin/Lugol
▫ Ethanol atau methanol 99,8%
▫ Air destilasi
▫ Fuchsin atau safranin

17
 Analitik
▪ Preparat yang telah difiksasi, ditetesi dengan Carbol Gentian Violet,
biarkan 1 – 2 menit.
▪ Carbol Gentian Violet dibuang, cuci dengan air mengalir, lalu ditetesi
dengan lugol selama 1 – menit.
▪ Lugol dibuang, kemudian zat warna pada preparat dilunturkan dengan
Alkohol 96% selama 10 detik.
▪ Preparat dicuci dengan air mengalir sampai bersih.
▪ Preparat ditetesi dengan larutan Fuchsin dan dibiarkan 1 – 2 menit.
▪ Preparat dicuci dengan air mengalir sampai bersih.
▪ Keringkan dan periksa di bawah mikroskop dengan menggunakan lensa
minyak imersi.

18
 Pasca Analitik:
Interpretasi:
▪ Gram Positif (+) :
bakteri berwarna ungu, bentuk batang atau kokus
▪ Gram Negatif (-) :
bakteri berwarna merah, bentuk batang atau kokus

19
 Pasca Analitik:
Interpretasi:

20
3.
Pewarnaan Salin dan
KOH
 Tujuan Pemeriksaan KOH

Pemeriksaan dengan menggunakan KOH adalah tekhnik pemeriksaan

sederhana untuk mengidentifikasi bahan-bahan exogenous non protein
misalnya hypda,spora dan serabut fiberglass

22
 Prinsip
▪ Pemeriksaan mikroskopik untuk mengidentifikasi jamur dari kulit dan kuku.
Identifikasi jamur lebih baik menggunakan larutan KOH. KOH dpat melarutkan jaringan sel danm
mengkeratinisasi bahan lainnya, membuat elemen jamur lebi mudah terlihat.
▪ Preparat langsung dari kerokan kulit dengan larutan KOH 10%20 % dapat terlihat hifa atau spora
dan miselium.•
▪ fungsi KOH untuk melarutkan debris dan lemak, KOH 10% dapat melarutkan debris dan lemak dari
kerokan kulit, rambut dan mukosa
▪ sedangkan KOH 20% merupakan pelarut yang kuat dan biasanya dipakai untuk specimen kuku.
▪ Pemeriksaan langsung dengan KOH 10% . bahanbahan kerokan kulit diambil denan cara mengerok
bagian kulit yang mengalami lesi. #ebelumnya kulit dibersihkan dengan kapas alkohol 70% lalu
dikerok dengan scalpel steril dan jatuhannya ditampung dalam lempeng steril. sebagian dari bahan
trsebut diperiksa langsung dengan KOH 10% yangdiberi tinta Pake biru Hitam, dipanaskan sebentar,
di tutup dengan kaa penutup dan diperiksa di bawah mikroskop
▪ bila penyebabnya memang jamur, maka kelihatan garis yang memilki indeks bias lain dari sekitarnya
dan jarakjarak tertentu dipisahkan oleh sekatsekat atau seperti butirbutir yang bersambung
seperti kalung. Pada ptiriasis versikolor hifa tampak pendekpendek,lurus atau bengkok dengan
banyak butiranbutiran kecil bergerombol

23
 “
Alat dan Bahan
• Handschoen
• Skalpel
• Kapas
• Microskop
• Kaca objek
• Kaca penutup
• Lampu spiritus
• Pinset
• Alkohol 70%
• Larutan KOH 10% dan 20%
24
 Lokasi
Kulit : Bagian tepi kelaianan kulit
Kuku : kuku yang mengalami penebalan
Rambut : rambut rapuh dan berwarna agakm pucat
pada rambut terdapat benjolan
Daerah sekitar rambut yang menunjukan
kelainan kulit,misalnya bersisik botak dll.

25
Cara pengambilan sampel
• Bersikan kulit yang akan di kerok dengan kapas alcohol
70% untuk menghilangkan lemak ,debu dan kotoran
lainnya
• Keroklah bagian yang aktif dengan arah dari atas ke
bawah ( cara memegang scalpel harus miring
membentuk sudut 45 derajat ke atas)
• Letakkan hasil kerokan kulit pada kertas atau wadah
Cara pengambilan sampel
 Cara Pemeriksaan
• Letakkan kaca objek sebanyak 3x pada Bunsen spiritus untuk dekontaminasi
• Teteaskan 1-2 tetes larutan KOH 10%( untuk kulit ) 20 % untuk kuku
• Letakkan bahan yang akan diperiksa pada tetesan dengan menggunakan pinset
yang sebelumnya di basahi dahulu dengan larutan KOH
• Jepit kaca objek dan biarkan 15 menit di atas nyala api untuk mempercepat
proses lisis
• Teteskan minyak emersi dan periksa sediaan di bawah mikroskop dengan
pembesaran 10% dan 40 % untuk mencari adanya hypa atau spora tergantung
jamur yang menyebabkan penyakit

28
 Interpretasi
• Hypha dan spora T.Versicolor
▪ Hypha dermatopytes
Bentuknya berupa benang –benang
Bentuknya seperti benang Panjang lurus atau
pendek dan Panjang disertai dengan spora
berkeluk yang sering kali bercabang-cabang
yang berkelompok dengan ukuran yang
diameter uniform warna terang dengan tepi
sama
agak gelap
• Hypha dan budding spores candida
Di sebut dengan pseudo –hypha yang sering
kali sukar di bedakan bentuknya seperti
benang yang Panjang ,lurus,bengkok,atau
oval dan budding

29
 Interpretasi

30
4.
Pewarnaan BTA
 Dasar Teori & Indikasi
▪ Mycobacterium ▪ Kecurigaan terdapat TB
tuberculosis  sukar paru.
diwarnai namun apabila
carbol fuchsin telah
menyerap, zat warna akan
tetap dipertahankan dan
sukar luntur walaupun
dengan asam alkohol.

32
 PRA-ANALITIK
▪ Persiapan pasien: tidak ▪ Alat dan bahan:
memerlukan persiapan khusus Lidi/tusuk bambu
▪ Persiapan sampel: bimbingan Kaca obyek
cara, waktu dan lokasi
pengumpulan sampel/sputum Lampu spiritus
▪ Prinsip tes: BTA sukar Mikroskop
dilakukan pewarnaan namun Dahak penderita
apabila setelah pewarnaan, Pewarna Ziehl-Neelsen (Carbol
dinding bakteri tahan terhadap fuchsin 0,3%, asam alkohol 3%,
pencucian dengan asam Methylen blue 0,3%)
sehingga tidak mudah luntur.
Desinfektan Hypochlorite 0,5%

33
 ANALITIK
▪ Pembuatan sediaan:
Siapkan kaca objek dan penomoran
Nyalakan lampu spritus
Ambil sedikit sputum purulen dengan
lidi sterik dan letakkan di kaca objek
Sputum diratakan (bentuk oval) ukuran
2x3 cm
Dikeringkan pada suhu ruangan
Sisa sputum dan lidi bekas dimasukkan
pada pot desinfektan selama minimal 12
jam sebelum dibuang
34
▪ Pewarnaan sediaan:
Fiksasi sediaan diatas spritus sebanyak 3x
Letakkan apusan menghadap keatas
Genangi sediaan dengan carbol fuchsin
Panaskan dengan spritus
Dinginkan (Min. 5 menit)
Bilas dengan air dan buang sisa air
Genangi dengan asam alkohol sampai tidak ada
warna merah
Genangi sedian dengan methylen blue selama 20-30
detik
Bilas dengan air mengalir dan buang sisa methylen
blue
Keringkan pada suhu ruangan
 PASCA ANALITIK
▪ Skala IUATLD (International Union Against
Tuberculosis and Lung Disease):
Negatif: tidak ditemukan BTA dalam 100 LP
Scanty: tidak ditemukan 1-9 BTA dalam 100 LP
1+ : ditemukan 10-99 BTA dalam 100 LP
2+ : ditemukan 1-10 BTA dalam 1 LP
3+ : ditemukan >10 BTA dalam 1 LP

35
5.
Pewarnaan Giemsa
 Dasar Teori dan Indikasi
Giemsa merupakan pewarna dengan prinsip Romanowsky yang terdiri dari
Azure B (produk oksidasi methylen blue) yang memiliki warna biru dan eosin
(eosin B atau Y) yang berwarna merah, kombinasi kedua zat warna tersebut
bersifat polikromatik sehingga dapat memberikan beberapa warna terhadap
sediaan apus darah. Azure B mewarnai komponen sel yang bersifat asam dan
eosin Y mewarnai komponen yang bersifat basa seperti granula eosinofil, ikatan
antara eosin Y dengan azur B dapat menghasilkan warna ungu. Pewarna
Giemsa digunakan untuk membedakan inti sel dan morfologi sitoplasma sel
darah merah, sel darah putih, trombosit serta parasit darah.

37
 Pra Analitik:
▪ Persiapan: tidak memerlukan persiapan khusus
▪ Persiapan sampel:
▫ Sediaan apusan darah tepi dari darah kapiler segar atau darah
EDTA
▫ Darah kapiler segar akan memberikan morfologi dan hasil
pewarnaan yang optimal pada sediaan apus
▫ Darah EDTA (etilen diamin tetra asetat). EDTA dapat dipakai
karena tidak berpengaruh terhadap morfologi eritrosit dan
leukosit serta mencegah trombosit bergumpal.

38
 Prinsip Tes
Prinsip pewarnaan didasarkan pada sifat kimiawi dalam sel. Zat warna yang
bersifat asam akan bereaksi dengan komponen sel yang bersifat alkalis,
demikian pula sebaliknya. Pewarnaan sediaan apus menggunakan prinsip
Romanosky yaitu menggunakan dua zat warna yang berbeda yang terdiri dari
Azure B (trimethylthionin) yang bersifat basa dan eosin Y
(tetrabromoflourescein) yang bersifat asam seperti yang dianjurkan oleh The
International Council for Standardization in Hematology, dan pewarnaan yang
dianjurkan adalah Wright-Giemsa dan May Grunwald-Giemsa (MGG).

39
 Alat
▪ Kaca objek 25 x 75 mm
▪ Batang gelas
▪ Rak kaca objek
▪ Piper pasteur

40
 Bahan/Reagen
(1) Metanol absolut dengan kadar air kurang dari 4%, disimpan dalam botol yang tertutup rapat
untuk mencegah masuknya uap air dari udara.

(2) Larutan dapar pH 6,4  Na2HPO4 2,56 g KH2PO4 6,63 g, Air suling 1 L
Sebagai pengganti larutan dapar, dapat dipakai air suling yang pHnya diatur dengan penambahan
tetes demi tetes larutan Kalium bikarbonat 1% atau larutan HCl 1% sampai indikator Brom Thymol
Blue (larutan 0,04 % dalam air suling ) yang ditambahkan mencapai warna biru.

(3) Zat warna Giemsa  Zat warna giemsa 1g, Methanol absolut 10 ml
Hangatkan campuran ini sampai 50°C dan biarkan selama 15 menit, kemudian disaring. Sebelum
dipakai, campuran ini diencerkan sebanyak 20 x dengan larutan dapar pH 6,6. Untuk mencari parasit
malaria, dianjurkan menggunakan larutan dapar pH 7,2

41
 Analitik
a. Letakkan sediaan apus di atas bak tempat pewarnaan dengan lapisan darah berada
di atas.
b. Untuk fiksasi apusan, teteskanlah sekian banyak metanol absolut ke atas sediaan
itu, sehingga bagian yang terlapisi darah tertutup seluruhnya. Biarkan selama 2-3
menit. Kemudian, buanglah kelebihan metanol dari atas kaca.
c. Genangi sediaan apus dengan zat warna Giemsa yang baru diencerkan. Larutan
Giemsa yang dipakai adalah 5%, diencerkan dulu dengan larutan dapar. Biarkan
selama 20 – 30menit.
d. Bilas dengan air suling, mula-mula dengan perlahan (untuk membuang zat warna
yang terapung di atas) kemudian lebih kuat dengan tujuan menghilangkan semua
kelebihan zat warna dan membersihkan sediaan dari kotoran. Letakkan sediaan
hapus dalam rak dalam posisi tegak/vertikal dan biarkan mengering.

42
43
 Pasca Analitik

44
 Pasca Analitik

45
 Pasca Analitik

46
 Metode Pembuatan Sediaan ADT

47
 Sediaan yang Baik

48
 Thank
You!
The more you know, the more you know you don’t know
~Aristotle

49